Fotoausstellung des Robert Koch-Instituts zur Diagnostik von Influenzaviren

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1 Fotoausstellung des Robert Koch-Instituts zur Diagnostik von Influenzaviren 1) Die Mitarbeiter des Nationalen Referenzzentrums für Influenza am Robert Koch-Institut Vorne rechts im Bild die Leiterin, Dr. Brunhilde Schweiger. Die Mitarbeiter des Referenzzentrumserheben als Teil des Netzwerkes der globalen Influenzaüberwachung virologische Daten und übermitteln sie wöchentlich an die Weltgesundheitsorganisation. Im Rahmen der bundesweiten Influenzabeobachtung (Surveillance) untersuchen die Mitarbeiter die nachgewiesenen Influenza- oder Grippeviren. Auch neu auftretende Influenzaviren wie die Neue Influenza A/H1N1 ("Schweinegrippe") werden im Referenzzentrum diagnostiziert und charakterisiert.

2 2) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Grippevirus Der Durchmesser eines Viruspartikels beträgt etwa 100 Nanometer, also ein Zehntausendstel Millimeter. Auf der Hülle des Virus erkennt man einen Saum aus den Oberflächenproteinen Hämagglutinin (H) und Neuraminidase (N). Über das Hämagglutinin bindet das Virus an die Oberfläche der Wirtszelle, dringt in die Zelle ein und vermehrt sich im Zellinneren. Die neugebildeten Viren knospen an der Zelloberfläche aus, bleiben aber an die Zelle gebunden. Mit Hilfe der Neuraminidase wird die Bindung gespalten. Die Viren werden freigesetzt und können weitere Zellen infizieren. Vom Hämagglutinin sind 16 Varianten (Subtypen) bekannt, von der Neuraminidase 9. Die in den letzten Jahrzehnten in der Bevölkerung zirkulierenden Influenzaviren gehören zum Typ A - Subtypen H1N1 und H3N2 - sowie zum Typ B. Das im April 2009 erstmals aufgetretene neue Influenzavirus ("Schweinegrippe") gehört zum Subtyp H1N1 (Typ A). Die für Geflügel hochpathogenen Vogelinfluenza-Viren gehören zu den H5- oder H7-Subtypen. Die elektronenmikroskopische Aufnahme zeigt ein neues A/H1N1-Virus, das im Referenzzentrum isoliert und angezüchtet worden ist. Allerdings lassen sich die verschiedenen Influenzaviren im Elektronenmikroskop nicht unterscheiden.

3 3) Eingang des Untersuchungsmaterials Ärzte nehmen Rachen- oder Nasenabstriche von Patienten mit Influenzaverdacht. Zusätzlich füllen sie einen kurzen Fragebogen aus, der Informationen zum Krankheitsverlauf sowie die Personalien enthält. Typisch für die Influenza ist besonders der plötzliche Krankheitsbeginn mit Fieber, Husten, Kopf- und Gliederschmerzen. Den Fragebogen und die Probe schicken die Ärzte per Post an das Robert Koch-Institut.

4 4) Probenaufbereitung Ein Mitarbeiter entnimmt das Wattestäbchen mit dem Abstrich dem Teströhrchen und schwenkt es in steriler Flüssigkeit, so dass sich die eventuell vorhandenen Viren anschließend in der Lösung befinden. Danach verteilt er diese Suspension für die Analyse: ein Teil dient als Ausgangsmaterial für die so genannte Polymerasekettenreaktion (Bilder 5 7), ein anderer wird zur Virusanzucht verwendet (Bilder 8-12)

5 5) Isolieren des Erbmaterials Bei Influenzaviren besteht das Erbmaterial nicht wie beim Menschen aus Desoxyribonukleinsäure (DNA), sondern aus einem ähnlichen Molekül, der Ribonukleinsäure (RNA). Um die Gene der Influenzaviren analysieren zu können muss eine Mitarbeiterin zunächst die RNA der Viren isolieren. Die Zugabe geeigneter Reagenzien zerstört die Hülle der Viren, was zum Freisetzen der RNA führt. Diese bindet dann an ein hinzugefügtes festes Material (Matrix) und wird durch Zentrifugieren von den übrigen Bestandteilen abgetrennt. Die RNA kann man anschließend wieder von der Matrix lösen.

6 6) Vorbereiten der Polymerase- Kettenreaktion Eine sehr kleine Menge RNA genügt als Ausgangsmaterial für die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerasechainreaction, PCR). Das erforderliche Umwandeln der RNA in DNA erfolgt in einem ersten Schritt, diesen Vorgang nennt man reverse Transkription. Die so entstandene cdna (copy DNA) dient nun als Ausgangsmaterial für die PCR. Da eine winzige Menge für die Reaktion ausreicht, ist diese Methode extrem empfindlich gegen ein unbeabsichtigtes Verschleppen von anderer DNA (Kontamination). Eine solche Kontamination würde die Ergebnisse verfälschen. Daher pipettiert die Mitarbeiterin den Reaktionsansatz in einer speziellen Werkbank zusammen, deren Inhalt durch eine Glasscheibe gegen Kontaminationen aus der Luft geschützt ist.

7 7) Auswertung der Polymerase- Kettenreaktion Mit der hier verwendeten PCR-Methode (der so genannten Real-Time-PCR) kann man die unterschiedlichen Gensequenzen der verschiedenen Virustypen und -subtypen in einer Probe schnell nachweisen. Wenn die gesuchte Sequenz (die Reihenfolge der Erbgutbausteine) im Untersuchungsmaterial vorliegt, erscheint im Auswertungsprogramm eine Kurve.

8 8) Virusanzucht in der Zellkultur Das Influenzavirus kann nicht nur Patienten, sondern auch Zellkulturen infizieren und sich in ihnen vermehren. Die hierzu verwendeten Zellen wachsen auf den Innenwänden spezieller Röhrchen, die mit Nährlösung gefüllt in einem Brutschrank langsam rotieren.

9 9) Analyse der Zellen Virusinfizierte Zellen nehmen eine charakteristische Form an, die eine Mitarbeiterin im Mikroskop untersucht. Zeigt sich eine deutliche Veränderung der Zellmorphologie, lagen im Patientenmaterial vermehrungsfähige Viren vor. Die Nährlösung enthält jetzt sehr viele Viren.

10 10) Virusanzucht im Hühnerei Alternativ zur Zellkultur erfolgt die Virusanzucht in befruchteten Hühnereiern. Die Mitarbeiterin spritzt dazu eine kleine Menge der Virus- Suspension mit einer Kanüle durch die Schale in das Ei, das anschließend bebrütet wird. Nach ein bis zwei Tagen kann man die Eier öffnen und mit einer Spritze virushaltige Flüssigkeit entnehmen. Das Referenzzentrum verwendet diese Methode vor allem für die Anzucht von Impfstämmen für die Antigencharakterisierung (siehe Bild 11).

11 11) Antigencharakterisierung Die Oberfläche der Influenzaviren verändert sich von Jahr zu Jahr. Daher ist eine jährliche Aktualisierung der Impfstoffzusammensetzung erforderlich. Eine wichtige Voraussetzung dafür ist die Antigencharakterisierung. Bei Antigenen handelt es sich um die Strukturen auf der Oberfläche der Viren, gegen die das Immunsystem Antikörper bildet. Diese Antikörper befinden sich im Blutserum. Zur Analyse der Virusantigene bringt man die angezüchteten Viren mit standardisierten Immunseren gegen verschiedene umlaufende Influenzastämme zusammen. Wenn die auf der Virusoberfläche vorliegenden Varianten von Hämagglutinin (einem Antigen) zu den Antikörpern in den Seren passen, entstehen Antigen-Antikörper-Komplexe. Die Viren können dann rote Blutkörperchen nicht mehr binden. Diese sinken ab und sind auf dem Boden der Probenplatte zu erkennen.

12 12) Genomanalyse Viren aus Patientenproben werden stichprobenartig sequenziert (das heißt, auf die Reihenfolge der Erbgutbausteine untersucht), um die Verwandtschaft der isolierten Virusstämme beurteilen zu können. Wenn eine Probe in der PCR positiv für H5 gewesen wäre, würde an dieser Stelle auch untersucht, ob es sich um die ob es sich um die hochpathogene Variante des Subtyps Asia handelt, an der sich Menschen bislang nur selten anstecken. Dazu vervielfältigt man die cdna in einer PCR-Reaktion (siehe Foto 6), versetzt die Probe dann mit einem in ultraviolettem (UV) Licht fluoreszierenden Farbstoff und trägt sie auf ein Agarose-Gel auf. An der Intensität der Fluoreszenz lässt sich die Menge der DNA abschätzen. Von dieser DNA wird in speziellen Analysen die Sequenz ermittelt. Da UV-Bestrahlung auch hier zu Sonnenbrand und Augenschäden führen kann, trägt der Mitarbeiter einen Gesichtsschutz.

13 13) Verwendetes Material und Befund Das Nationale Referenzentrum übermittelt bereits nach der PCR an den Arzt, ob der Patient mit einem Influenzavirus infiziert ist oder nicht. Etwa acht Mitarbeiter haben an der Diagnostik mitgewirkt und dabei in den einzelnen Schritten vom Probeneingang bis hin zur Befundübermittlung eine Vielzahl der hier abgebildeten Reagenzien und Materialien verwendet.