Enzymatische Katalyse

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1 VERSUCHSZIEL Die natürliche Braunfärbung einer aufgeschnittenen Kartoffel ist nichts anderes, als die enzymatisch oxydative Umsetzung der darin anwesenden Phenolverbindungen mit Sauerstoff zu Chinonverbindungen. Für diesen Versuch wird die Reaktionsgeschwindigkeit folgender Reaktion untersucht. In diesem Fall wird Catechol (auch Brenzkatechin) durch das Enzym Catecholase (in Kartoffeln vorhanden) oxidiert und zu 1,2-Benzochinon umgesetzt. Aufgrund der gebildeten PI-Bindungen am Chinon (242 nm) lassen sich nun spektroskopische Messungen im UV-Bereich durchführen. Gleichzeitig kann im VIS-Bereich die Bildung bräunlicher Huminsäuren (ca. 500 nm) beobachtet werden. Aus der zeitlichen Änderung der Extinktion kann mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes auf die Konzentrationsänderung und somit auf die Reaktionsgeschwindigkeit geschlossen werden. In diesem Versuch soll untersucht werden, ob diese Enzymreaktion einer Michaelis-Menten- Kinetik entspricht. Abweichungen sollen untereinander diskutiert bzw. Grundlage für einen Optimierungsvorgang des bestehenden Versuchsaufbaus sein. -- PA_EYK -- Seite 1/6

2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN Enzyme Enzyme sind aus Proteinen zusammengesetzte biologische Katalysatoren, die eine Senkung der Aktivierungsenergie von biochemischen Reaktionen hervorrufen. Eine einfache Darstellung dieser Reaktionen wird vom Michaelis-Menten-Modell beschrieben. Dieses Modell hat folgende Form: E + S k1 k 1 ES k cat E + P E S ES P k : Enzym : Substrat : Enzym-Substrat-Komplex : Produkt : Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten Bevor die eigentliche katalytische Reaktion zu [P] stattfindet, wird das [S] reversibel an [E] gebunden (Schlüssel-Schloss-Prinzip). Unter Bildung eines [ES] findet der geschwindigkeitsbestimmende katalytische Abschnitt statt, die Bildung und Dissoziation von [P]. Die Gleichung die diesen Vorgang beschreibt, lautet r = r max [S] K m + [S] = k catk[e 0 ][S] = d[p] 1 + K[S] dt r kcat Km K = 1/Km t : Reaktionsgeschwindigkeit : Reaktionsgeschwindigkeitskonstante : Michaelis-Menten-Konstante : Gleichgewichtskonstante : Zeit Für die grafische Darstellung trägt man die Reaktionsgeschwindigkeit gegen die Substratkonzentration auf. Das Ergebnis ist eine Kurve hyperbolischer Form. Für [S] << Km ist die Reaktion 1. Ordnung und die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zur Substratkonzentration. Für [S] >> Km ist die Reaktionsgeschwindigkeit näherungsweise gleich der maximalen Geschwindigkeit rmax (Reaktion 0. Ordnung). -- PA_EYK -- Seite 2/6

3 UV/VIS-Spektroskopie Das in diesem Versuch verwendete Einstrahlspektrometer vergleicht die Lichtintensität bestimmter Wellenlängen vor und nach der Probenküvette. Das Defizit an Lichtenergie, das beim Durchgang durch die Probe bei einer bestimmten Wellenlänge auftritt, gibt zum einen Aufschluss über die Art der vorliegenden Bindungen und somit auf das Vorhandensein einer bestimmten Substanz und zum anderen können zeitabhängige Konzentrationsänderungen beobachtet werden. Trifft Licht mit einer bestimmten Frequenz auf ein Atom und stimmt diese Frequenz mit der atomaren Eigenfrequenz überein, so wird diese Energie aufgenommen (absorbiert) und dafür verwendet, um ein Elektron auf ein höheres Energieniveau im Valenzband zu heben. Dementsprechend kann eine Absorption nur auftreten, wenn energieärmere Niveaus stärker besetzt sind als energetisch höhere. Der Bereich im elektromagnetischen Spektrum von nm ist als ultravioletter Bereich (UV) und von nm als visueller Bereich (VIS) definiert. 190 nm Um nun aus dem Energiedefizit des Lichts durch die Probe auf eine Änderung der Substanzkonzentration zu schließen, muss zum einen die absorbierte Lichtmenge unabhängig von der Intensität der Strahlungsquelle sein (Lambert) und zum anderen die Absorption proportional der Zahl der absorbierenden Moleküle sein (Beer). Unter diesen Voraussetzungen gilt das Lambert- Beersche Gesetz. log ( I 0 I ) = E λ = e c d I : Lichtintensität [cd] E : Extinktion [-] e : Extinktionskoeffizient [cm²/mol) c : Konzentration der absorbierenden Substanz (mol/cm³) d : Schichtdicke der Küvette (cm) -- PA_EYK -- Seite 3/6

4 Vorbereitung Kartoffelextrakt Vor dem Versuch werden zwei handgroße Kartoffeln geschält, gewürfelt und mit Hilfe eines Labormixers püriert (15 s bei n = 2000 min -1 ). Füllen Sie den Mus auf ein doppellagiges Papiertuch und wringen Sie den Saft in einem geeigneten Gefäß aus. Führen Sie diese Arbeiten zügig aus, um die vorzeitige Oxidation zu minimieren. In 4-8 verschlossenen Zentrifugenbechern wird der Saft 10 Minuten lang bei einer Drehzahl von 8000 U/min zentrifugiert (die Zentrifuge ist nur vom Laborbetreuer anzustellen). Benötigte Lösungen Stellen Sie 100 ml einer 0,024 molaren Catechollösung und 100 ml einer jeweils 0,0248 molaren Pufferlösung (Na2HPO4 - NaH2PO4) her. Für den Versuch werden 6 Proben benötigt. Verdünnungs- Volumen Probe faktor Cat.-Lsg. Cat.-Lsg./Versuch Pufferlsg. H 2O Kart.-Saft/Versuch Referenzmessung 5 ml H 2O A 16 B 8 C 4 5 ml 5 ml 15 ml 0,5 ml (Zugabe unmittelbar vor dem Versuch) D 2 E 1 -- PA_EYK -- Seite 4/6

5 Versuchsdurchführung Schalten Sie das UV/VIS Gerät gleich bei Praktikumsbeginn ein, da die interne Lichtquelle (Deuteriumlampe) eine halbstündige Vorwärmzeit benötigt. Gewinnen Sie das Kartoffelextrakt wie oben beschrieben und bereiten Sie die erforderlichen Lösungen (!!! ohne Kartoffelextrakt!!!) vor und beschriften Sie diese. Öffnen Sie das Programm "Aspect Plus" auf dem bereitgestellten Rechner Wählen Sie unter dem Reiter "Messung" den Befehl "Geräteinitialisierung" aus Geben Sie als erstes die Referenzlösung in die Quarzglasküvette und starten Sie die "Referenzmessung" Alle weiteren Messungen werden mit ausgeführt Speichern Sie Ihr Spektrum nach jeder Messung ab! Beginnen Sie mit Probe A, denn diese Probe ist gleichzeitig für eine Langzeitmessung (bis Ende des Praktikums) bestimmt. Probe E soll analog als Langzeitmessung beobachtet und mit der Variation der Substratkonzentration später verglichen werden. Stellen Sie die jeweilige Probe auf die angeschaltete Magnetrührplatte. Geben Sie die entsprechende Kartoffelextraktmenge hinzu und starten Sie gleichzeitig die Stoppuhr. Messen Sie jede Probe nach 2, 5 und 10 Minuten. Für die Messungen A-E, wird mit einer Pipette eine geeignete Menge aus der jeweiligen Probe in die Küvette zügig eingefüllt, gemessen und anschließend der Probe wieder zugeführt. Spülen Sie bitte nach jeder Probe die Küvette mit entionisiertem Wasser aus, ohne dabei die Küvette aus der Halterung zu nehmen und ohne die Lichtleiter abzuschrauben. Auswertung Erstellen Sie aus der Langzeitprobe eine 2-Punkt-Kalibrierung. Berechnen Sie damit und mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes die Konzentration des Substrats. Stellen Sie in einem Diagramm die Reaktionsgeschwindigkeit (Δc/Δt) als Funktion der Substratkonzentration [S] dar. Wählen Sie eine geeignete Linearisierungsmethode aus, um die Parameter rmax und Km zu bestimmen! Vergleichen Sie den Langzeitversuch E (Abnahme der Substratkonzentration) mit der Variation der Substratkonzentration und diskutieren Sie die Ergebnisse! Verwendete Stoffe -- PA_EYK -- Seite 5/6

6 Catechol (Brenzkatechin) CAS Nr MAK 10 ml/m³ Flammpunkt 127 C H-Sätze 302,312,315,319 P-Sätze 280, Wassergefährdungsklasse WGK 2 schwach wassergefährdend Molare Masse 110 g/mol Dichte 1,37 g/cm³ Sonstiges Kontakt vermeiden; ausschließlich im Abzug verwenden Verständnisfragen Was versteht man unter kompetitiver und allosterischer Hemmung? Wie ist ein Spektrometer grundsätzlich aufgebaut? Wieso werden Extinktionen > 1 problematisch? Wie wird aus der Extinktion die Konzentration berechnet? -- PA_EYK -- Seite 6/6