LSC. Applikationsnote 8 Überarbeitet von Dr. Ronald Edler Juli Cherenkov Messung von 32 P Geräte Performance. Einleitung

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1 LSC Applikationsnote 8 Überarbeitet von Dr. Ronald Edler Juli 2004 Cherenkov Messung von 32 P Geräte Performance Einleitung In den biologischen und chemischen Wissenschaften müssen viele Wissenschaftler 32 P als Tracer verwenden. Die von vielen Forschern bevorzugte Methode zur Analyse von 32 P Aktivitäten umfasst die Messung der Cherenkov- Strahlung, die durch β Partikel genügender Energie ohne Szintillationscocktail erzeugt wird. Die maximale Energie (E max ) die durch β Partikel von 32 P emittiert wird beträgt 1710 kev. Eine große Zahl dieser Partikel hat eine Energie größer als 263 kev. Dieser Wert ist der Grenzwert der Energie, der für Cherenkov Strahlung in Wasser erzeugt durch Elektronen oder β Teilchen benötigt wird. Wenn ein β Teilchen eine Energie größer als 263 kev besitzt, so wandert es in Wasser schneller als die Lichtgeschwindigkeit im gleichen Medium. Bei dieser Reisegeschindigkeit verursacht das β Teilchen lokale Polarisation entlang seines Weges mit dem Ergebnis, dass elektromagnetische Strahlung emittiert wird, wenn die polarisierten Moleküle in den Grundzustand zurückkehren. Die Strahlung wurde nach Cherenkov benannt, der dieses Phänomen intensiv untersuchte. Die Strahlung besteht aus einem Spektrum im Wellenlängenbereich vom UV bis in den sichtbaren Bereich mit einem Maximum bei ungefähr 420 nm. Wasser geringfügig über 55% liegen. Dies ist viel, wenn man berücksichtigt, dass Probenvolumina bis 20 ml gemessen werden können, denn ein Cocktail wird nicht benötigt. Die Produktion von Cherenkov Strahlung durch β Teilchen ist ein physikalisches Phänomen, deshalb gibt es hier keinen chemischen Quench. Wenn Sie allerdings das Lösungsmittel wechseln, welches dann einen anderen Brechungsindex hat als Wasser, so wird sich auch die Zählausbeute ändern. Dies hängt damit zusammen, dass der Brechungsindex den Grenzwert der Energie für Cherenkov Strahlung ändert. Allerdings tritt auch bei Cherenkov Strahlung Farbquench auf. Sogar sehr geringe Mengen an Farbe, kaum sichtbar für das menschliche Auge, können einen signifikanten Quencheffekt haben mit einer daraus folgenden Reduktion der Zählausbeute. Ein anderer wichtiger Faktor ist die Richtung der Cherenkov Strahlung. Die Resultierende Cherenkov Strahlung wird als Kegel von Strahlung mit einem bestimmten Winkel zur Wanderungsrichtung des β Teilchens emittiert. Der Winkel des β Teilchens variiert und kann nicht 41.3 übersteigen. Das breite Spektrum an Wellenlängen und die Winkel der Emissionen spielen eine Rolle bei der Zählausbeute wobei auch die Probengeometrie (Volumen) und der Vialtyp berücksichtigt werden muss. Die Zählausbeute der Messung von 32 P über die Cherenkov Strahlung kann in 1

2 Diese Applikationsnote berichtet über Experimente die mit einem Packard Tri- Carb 2300 TR Flüssigszintillationszähler zur Bestimmung der Genauigkeit der Messung der Cherenkov Strahlung von 32 P durchgeführt wurden. Mit diesen Messungen sollten optimale Messbedingungen ermittelt werden. Vergleichbare Ergebnisse können auch mit anderen Szintillationszählern von PerkinElmer LAS erreicht werden. Zählfenster Das Zählfenster kann zuerst durch Beobachtung des Pulshöhenspektrums ermittelt werden. Eine farblose Probe von 32 P wurde in ein LSC Vial gegeben und das Probenspektrum wie in Abbildung 1 gezeigt analysiert. Die Pulshöhen die von der Cherenkov Strahlung stammen haben eine geringe Größe und überschreiten nicht 30 kev. Die Zählregion wurde deshalb definiert, indem die Einstellung für die untere Fenstergrenze auf 0 und die obere Fenstergrenze auf 30 kev eingestellt wurde. Abbildung 1: Pulshöhenspektrum von Cerenkov Photonen erzeugt durch 32 P in Wasser Volumeneffekt Wegen der gerichteten Emission von Cherenkov Photonen kann das Probenvolumen einen Einfluss auf die Zählausbeute haben. Außerdem ist der Volumeneffekt für Glas- und Plastik-Vials unterschiedlich, was weiter unten erläutert wird. Tests mit Glas- und Plastik-Vials wurden durchgeführt um den Effekt des Probenvolumens auf die Zählausbeute zu bestimmen. In ein Glas- und ein Plastik- Vial von 20 ml Volumen wurde eine 1,0 ml Probe in farblosem Wasser bekannter 32 P Aktivität gegeben. Die beiden Proben wurden im gewählten Bereich von 0-30 kev gemessen und die Zählausbeute wie folgt berechnet: CPM %E = 100 DPM 1,0 ml reines Wasser wurden dann in das Glas- und Plastik-Vial gegeben um das Gesamtvolumen auf 2,0 ml in jedem Vial zu erhöhen. Die beiden Vials wurden dann im gleichen Zählfenster gemessen und die Zählausbeute noch einmal berechnet. Diese Prozedur wurde wiederholt, bis ein Probenvolumen von 20 ml erreicht wurde. Der Effekt des Probenvolumens auf die Zählausbeute wird in Abbildung 2 gezeigt. 2

3 Wechsel im Probenvolumen haben einen größeren Einfluss bei Verwendung von Glas-Vials. Die Zählausbeute mit Plastik- Vials war ebenso größer (PerkinElmer LAS Super Polyethylen Vial, 1 mm Wandstärke). Sehr geringe Änderungen der Zählausbeute (< 1%) wurden in Plastik- Vials bei Probenvolumina zwischen 9 und 20 ml beobachtet. Abbildung 2: Effekt des Probenvolumens der Cerenkov Strahlung auf die Zählausbeute von 32 P Die Tatsache, dass die Zählausbeute in Plastik-Vials höher ist, basiert darauf, dass ein signifikanter Anteil der Cherenkov Strahlung im Ultravioletten Bereich des Spektrums auftritt. Der Ultraviolette Anteil der Strahlung wird zum großen Teil durch die Glaswand des Vials blockiert. Wird das Probenvolumen konstant gehalten, können keine Veränderungen der Zählausbeute durch Variabilität der Probengeometrie auftreten. Quenchkorrektur Es gibt zwar keinen chemischen Quench bei Cherenkov Strahlung aber Farbquenchkorrektur ist erforderlich. In vielen Anwendungen in der Biologie und Biochemie muss 32 P in Tieren oder Pflanzengewebe analysiert werden. Das Gewebe kann verascht werden um die organische Materie zu zerstören und 32 P in eine lösliche Form zu überführen. Dann kann die Asche in verdünnter Säure in einem Messkolben gelöst werden. Dies führt zu einer farblosen oder manchmal schwach gelben Probe. Aus diesem Grund haben wir den Einfluss von gelber Farbe auf die Zählausbeute der Cherenkov Strahlung überprüft. Bei anderen Applikationen mag 32 P bereits in Lösung sein und die Probe kann eventuell direkt gemessen werden. Dies erlaubt Studien an unveränderten Proben. Haben diese Proben nur die geringste Färbung, so ist eine Farbquenchkorrektur erforderlich, falls keine Entfärbung durchgeführt wird. Es wurde eine Quenchkorrekturkurve mit gelber Farbe durch Zugabe variierender Mengen von 0,01% K 2 Cr 2 O 7 von 0,0 bis 10,0 ml zu einer Serie von zehn Glas- und Plastik-Vials erstellt. Eine genau bekannte Menge an 32 P in wässriger Lösung wurde zu jedem Vial gegeben und die Probenvolumina auf 20 ml aufgefüllt. Externe Standards die normalerweise verwendet werden um einen Quenchparameter zu ermitteln können für Cherenkov Strahlung nicht eingesetzt werden, weil die in den LSC s eingesetzte Gamma-strahlenquelle Comptonelektronen niedriger Energie erzeugen. Diese Energie ist viel zu gering, als dass sie den Grenzwert für die Erzeugung von Cherenkov Strahlung überschreiten könnte. Allerdings kann eine Quenchkorrektur über den Spectal Index of the Sample (SIS) ermittelt werden, welcher aus der mittleren Pulshöhe des β Spektrums ermittelt wird. Die Größe des SIS-Wertes ist ein Maß für die Photonenintensität die aus dem Messvial entweichen. Dies ist ein exzellenter Quenchparameter für Cherenkov Messungen. In Abbildung 3 wird eine Quenchkorrekturkurve für gelb gefärbte Proben in Plastik-Vials gezeigt. Zwei Volumina von gequenchten Standards (15 und 20 ml) wurden untersucht. Beide Volumina gaben identische Quenchkurven, wenn Plastik- Vials verwendet wurden. Allerdings waren die Quenchkurven unterschiedlich, wenn Glas-Vials verwendet wurden. Dies unterstreicht noch einmal den besonderen Effekt der Probengeometrie bei Verwendung von Glas-Vials. 3

4 Abbildung 3: Cerenkov Farbquenchkurve (SIS) für gelbe Farbe in Wasser für 32 P Figure of Merit Der Begriff Figure of Merit wird oft verwendet, um die Zählbedingungen für die Probe zu optimieren. FOM = E 2 E ist die Zählausbeute und B die Background Zählrate. Durch Erhöhung der Zählausbeute oder Senkung des Backgrounds kann der FOM Wert und die Empfindlichkeit des Gerätes zur Messung der radioaktiven Probe verbessert werden. Die FOM-Werte für Glas- und Plastik- Vials werden in Tabelle 1 aufgelistet. Der FOM-Wert für Plastik-Vials ist mehr als zweimal so groß wie der von Glas-Vials. Alle die bislang genannten Gründe bedeuten, dass Plastik Vials deutlich besser für Cerenkov Messungen geeignet sind als B Glas Vials. Außerdem sind Plastik Vials günstiger und unzerbrechlich. Wiederfindung von Radionukliden Die Genauigkeit von Cerenkov Messungen für 32 P wurde mit Hilfe der Wiederfindung überprüft, wobei: GemesseneDPM % Wiederfindung = 100 AktuelleDPM Eine Serie von wässrigen 32 P Proben bekannter Aktivität wurden in Triplikaten in Plastik Szintillationsvials pipettiert. 32 P Cerenkov Counting Performance Vial Typ Zählmodus % Zählausbeute Background (CPM) Figure of Merit (E 2 /B) Plastic NCM 56,7 16,6 193,7 Glas NCM 50,2 29,1 86,6 Tabelle 1: Performance von Cerenkov Messungen im Normal Count Mode (NCM) Background Messungen wurden in Triplicaten in reinem Wasser im Zählfenster von 0-30 kev durchgeführt. Messzeit 200 Minuten mit einem %2σ von 3,0% 4

5 Die Proben wurden im Zählfenster von 0-30 kev gemessen. Der Packard Szintillationszähler wurde so programmiert, dass er die DPM für jede Probe unter Verwendung der Quenchkorrekturkurve wie in Abbildung 3 gezeigt berechnete und ausdruckte. Die für die in Triplikaten gemessenen Proben ermittelten Wiederfindungen sind in Tabelle 2 zu sehen. Die prozentualen Wiederfindungen waren für Proben mit 32 P sehr gut bis hinunter auf DPM pro Probe. Die Proben mit geringerer Aktivität von 883 DPM zeigten um ~ 6% zu geringe Wiederfindungen. Die Wiederfindung von Proben mit geringen Aktivitäten konnte durch längere Messzeiten verbessert werden. Die längere Messzeit verringerte die Standardabweichung und führte zu einer genaueren Bestimmung des SIS-Wertes. Allerdings werden sich Fehler beim Messen von Proben niedriger Aktivität (<2000 DPM oder ~1000 CPM) immer einschleichen, selbst wenn lange Zählzeiten verwendet werden um 1% 2σ zu erreichen. Proben mit geringer Zählrate haben eine Pulshöhenverteilung die ähnlich der Pulshöhenverteilung von Background ist. Als Konsequenz hat das Messgerät bei Proben mit niedriger Zählrate Probleme den SIS Quenchparameter genau zu bestimmen. Deshalb wird für Proben geringer Aktivität die konventionelle Flüssigszintillationstechnik mit dem tsie als Quenchparameter empfohlen. Der Szintillationszähler braucht weniger als eine Minute um den tsie einer Probe in Cocktail genau zu bestimmen. Schlussfolgerung 1. Cerenkov DPM Messungen für 32 P Analyse sind günstig, da kein Cocktail benötigt wird. 2. Ein Standard Szintillationszähler kann verwendet werden. 3. Zählausbeuten von mehr als 55% für farblose 32 P Proben können bei Cerenkov Messungen erreicht werden. Statt der 10 ml Probenvolumina bei Cocktailmessungen können bis zu 20 ml Probe bei Cerenkov Messungen eingesetzt werden. Wiederfindung von 32 P Aktivitäten in Cerenkov Messungen DPM (aktuell) DPM (gemessen) % 2σ % Wiederfindung ,4 99,1 99, ,9 Mittelwert 98,8 99,0 99,1 99,0 Mittelwert 100,0 96,8 95,9 97,6 Mittelwert 94,0 93,3 94,6 94,0 Mittelwert Tabelle 2: Wiederfindung von 32 P aus Cerenkov Messungen Die DPM Aktivität wurde mit dem SIS als Quenchparameter bestimmt. %2σ ist die % 2σ Standardabweichung. 5

6 4. Eine 32 P Probe in wässriger Lösung kann direkt ohne Zerstörung der Probe durch Zugabe von Cocktail gemessen werden. Dies erlaubt weitere Untersuchungen an der Probe z. Beispiel mit Chromatographie oder Spektrometrie etc. 5. Es gibt keine Probleme mit der Entsorgung von Cocktail. 6. Für Proben mit geringen Aktivitäten (<2000 DPM oder ~1000 CPM) werden lange Zählzeiten benötigt um den SIS- Wert zu bestimmen und Fehler können trotzdem auftreten. In solchen Fällen ist die konventionelle LSC Technik unter Verwendung von Cocktail und Benutzung des tsie als Quenchparameters zu empfehlen. Empfehlungen Die folgenden Empfehlungen können für die Messung von 32 P über die Cerenkov Mehode gegeben werden um die Performance zu optimieren: 1. Verwenden Sie immer Plastik Vials für Cerenkov Messungen (z. Beispiel PerkinElmer LAS 20 ml Super Polyethylene Vials mit 1 mm Wandstärke). Plastik Vials geben bessere FOM-Werte, sie sind günstiger und unzerbrechlich. 2. Solange Proben nicht völlig farblos sind und konstante SIS-Werte zeigen fertigen Sie eine Farbquenchkurve basierend auf der Farbe ihrer Probe an. 3. Halten Sie ihre Proben bei konstantem Volumen es sei denn, Sie erkennen, dass keine wesentlichen Volumeneffekte auftreten. 4. Alle Proben sollten so lange gezählt werden bis ein % 2σ von einem Prozent oder weniger erreicht wird um korrekte Ergebnisse und genaue SIS-Werte zu erhalten. 5. Für Proben niedriger Aktivität (<1000 DPM) empfehlen wir die konventionelle LSC Technik für 32 P. Dies beinhaltet die Messung von 32 P in standard Cocktails unter Verwendung des tsie als Quenchparameter. Der Szintillationszähler benötigt weniger als eine Minute um den tsie Wert jeder Probe exakt zu bestimmen. Danksagung Die Experimente wurden in Äthiopien und Tansania mit einem Packard TriCarb 2300 LSC erhalten, der von der Internationalen Atomenergiebehörde installiert worden war. Folgenden Personen, die an diesen Experimenten beteiligt waren, gilt unser Dank: In Äthiopien: Asrat Bulbula, Deputy Commissioner, Ethiopian Science and Technology Commission (ESTC); Dr. Beyene Kebede, Department of Agriculture and Environment (ESTC), Balesh Tulema, Alemayehu Tereffe, Kebede Hailu, Wondimu Bassazinew, Holetta Research Center; Dr. Asfaw Hailemariam, Dereje Tilahun, National Soil Service Laboratory. In Tansania: Dr. A. M. Nyanda, Registrar, National Radiation Commission (NRC); L. D. Kifanga, NRC; Dr. A. S. Nyaki, Selian Agricultural Research Institute ; George Sayula, Inviolata Swai, Hussein Mansoor, Rama Ngatoluwa, Pius Muya, Msaeicy Willy. Weltweites Hauptquartier: PerkinElmer Life Sciences, Inc., 549 Albany Street, Boston, MA USA (800) Europäisches Hauptquartier: PerkinElmer Life Sciences, Imperiastraat 8, B-1930 Zaventem Belgien Technischer Support: In Europe: techsupport.europe@perkinelmer.com in US und im Rest der Welt: techsupport@perkinelmer.com Deutschland: Tel: