Charakterisierung eines Borna Disease Virus-spezifischen T-Zell-Epitops der Lewis Ratte und Einsatz dieses Epitops in Immunisierungsexperimenten

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1 Aus der Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Standort Tübingen und dem Institut für Virologie des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. L. Stitz Charakterisierung eines Borna Disease Virus-spezifischen T-Zell-Epitops der Lewis Ratte und Einsatz dieses Epitops in Immunisierungsexperimenten INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Eingereicht von Silke Stamer, geb. Hülpüsch Tierärztin aus Böblingen Gießen 2002

2 Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Dekan: Prof. Dr. Dr. h. c. B. Hoffmann 1. Berichterstatter: Prof. Dr. L. Stitz 2. Berichterstatter: Prof. Dr. E. F. Kaleta Tag der mündlichen Prüfung: Diese Arbeit wurde durch Mittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft finanziert: Pl 256/1-1 Teile dieser Arbeit wurden vorab publiziert in: J. Biol. Chem. 276: 17; Planz et al., 2001

3 Berichte aus der Veterinärmedizin Silke Stamer Charakterisierung eines Borna Disease Virus-spezifischen T-Zell-Epitops der Lewis Ratte und Einsatz dieses Epitops in Immunisierungsexperimenten. D 26 (Diss. Universität Giessen) Shaker Verlag Aachen 2002

4 Die Deutsche Bibliothek - CIP-Einheitsaufnahme Stamer, Silke: Charakterisierung eines Borna Disease Virus-spezifischen T-Zell-Epitops der Lewis Ratte und Einsatz dieses Epitops in Immunisierungsexperimenten / Silke Stamer. Aachen : Shaker, 2002 (Berichte aus der Veterinärmedizin) Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2002 ISBN Copyright Shaker Verlag 2002 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen und der Übersetzung, vorbehalten. Printed in Germany. ISBN ISSN X Shaker Verlag GmbH Postfach Aachen Telefon: / Telefax: / Internet: info@shaker.de

5 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis V 1. EINLEITUNG 1 2. FRAGESTELLUNG MATERIAL Zelllinien Virus Virus der Bornaschen Krankheit (BDV) Vaccinia Virus (VV) Versuchstiere Peptide Nukleinsäuren Plasmide Oligonukleotide BDV p40-spezifische Primer Weitere Primer Weitere Nukleinsäuren Bakterien Kompetente Bakterien Weitere Bakterien Enzyme und Kits Enzyme Kits Antikörper, Seren, Konjugate Medien Medienzusätze Lösungen und Puffer Zellkultur Aufreinigung von Immunglobulinen Isolierung von Gehirnlymphozyten Aufreinigung rekombinanter Proteine SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese und Western Blot-Analyse Durchflusszytometrie Plasmidisolierung Sequenzierung Färbung BDV-infizierter Zellen Vaccinia Plaque-Assay Chemikalien Radiochemikalien Verbrauchsmaterial Geräte und Laborhilfsmittel 31 -I-

6 Inhaltsverzeichnis Zentrifugen Rotoren Weitere Geräte METHODEN Zellkultur Kultivierung von Zellen Kultivierung von adherent wachsenden Zellen auf Microcarriern Einfrieren von Zellen Auftauen von Zellen Bestimmung der Anzahl vitaler Zellen Transfektion von Zellen Transfektion mit Dosper Transfektion mit Effectene Herstellen eines Zelllysats Produktion monoklonaler Antikörper im Kulturüberstand von Hybridomzellen Reinigung monoklonaler Antikörper Gewinnung von BDV aus Rattengehirnen Infektion von Ratten mit BDV Beurteilung klinischer Symptome Infektion von Ratten mit Vaccinia Virus Immunisierung von Ratten Intraperitoneale Immunisierung Subkutane Immunisierung Immunisierung in den Fuß Isolierung von Rattenlymphozyten Isolierung von Lymphozyten aus dem Rattengehirn Isolierung von Lymphozyten aus der Milz Isolierung von Lymphozyten aus den poplitealen Lymphknoten In vitro Restimulation von Lymphozyten der Lewis Ratte Präparation der zur Antigenpräsentation eingesetzten Zellen (Feederzellen) In vitro Restimulation Zytotoxizitätstest Zytotoxizitätstest mit Peptiden Markierung von Zielzellen mit synthetischen Peptiden Markierung von Zielzellen mit HPLC-Fraktionen Arbeiten mit Vaccinia Viren Gewinnung von Vaccinia Virus Vaccinia Virus-Infektion von Zellen auf Microcarriern Herstellung rekombinanter Vaccinia Viren Infektion mit Vaccinia-Wildtyp und Transfektion Plaquereinigung rekombinanter Viren Virustitration Titration des Borna Disease Virus Titration des Vaccinia Virus (Plaque Assay) 50 -II-

7 Inhaltsverzeichnis 4.11 Aufreinigung rekombinanter Proteine SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese und Western Blot-Analyse SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese Western Blot-Analyse Transfer von Proteinen auf eine Teflonfolie Immunoblotting Durchflusszytomerie Phänotypische Charakterisierungvon Zellen anhand von Oberflächenantigenen Nachweis Vaccinia Virus-spezifischer Proteine im Inneren von Zellen Permeabilisierung Markierung der Zellen Nachweis von GFP (Green Fluorescent Protein) Nachweis von GFP (Green Fluorescent Protein) mittels Fluoreszenzmikroskopie Extraktion viraler Peptide aus infizierten Zellen Fraktionierung viraler Peptide mittels HPLC Histologische Untersuchungen Molekularbiologische Methoden Gewinnen von Plasmiden Minipräparation Säulenaufreinigung von Plasmid-DNA Gewinnen zellulärer und viraler DNA Auftrennung, Isolierung und Aufreinigung von genomischer und Plasmid-DNA Auftrennung Isolierung und Aufreinigung Bestimmung von Nukleinsäuekonzentrationen RNA-Isolierung Enzymatische Behandlung von Nukleinsäuren Spaltung mit Restriktionsenzymen Ligation Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Reverse Transkriptase Polymerase- Ketteneaktion (RT-PCR) cdna Synthese Polymerase-Kettenreaktion mit der Taq-Polymerase Polyamerase-Kettenreaktion mit der Pwo-Polymerase Sequenzierung von DNA Sequenzierreaktion Aufreinigung Sequenziergel Bakterienkultur Anzucht von E.coli in Flüssigmedium Anzucht von E.coli in auf festen Nährböden Transformation Lagerung von Bakterienkulturen 71 - III -

8 Inhaltsverzeichnis 5. ERGEBNISSE Verkürzte Nukleoproteine Transfektion von LEW Zellen Expression des vollständigen Nukleoproteins in LEW Zellen Expression von verkürzten Nukleoproteinen in LEW Zellen Herstellung rekombinanter Vaccinia Viren BDV-spezifische Peptide Synthetische Peptide Bestimmung der optimalen Peptidkonzentration für das Beladen von Zielzellen Natürlich prozessierte Peptide Immunisierungsexperimente mit dem Peptid Periphere Immunisierung (subkutan und intraperitoneal) Lokale Immunisierung Immunisierung von Ratten mit dem Peptid 9048 und anschließende BDV-Infektion Immunisierung mit dem Peptid 9048 und anschließende Virusinfektion: Beurteilung des Krankheitsverlaufs, der Virusvermehrung und der entzündlichen Veränderungen im Gehirn (Experiment 1) 103 a. Auftreten BDV-spezifischer Symptome 104 b. Auftreten BDV-spezifischer Antikörper 106 c. Nachweis von infektiösem Virus und entzündlichen Veränderungen im Gehirn Immunisierung mit dem Peptid 9048, rekombinantem Nukleoprotein oder Bacterial Ghosts und anschließende Virusinfektion: Beurteilung des Krankheitsverlaufs, der Virusvermehrung im Gehirn (Experiment 2) 107 a. Auftreten BDV-spezifischer Symptome 109 b. Auftreten BDV-spezifischer Antikörper 111 c. Nachweis von infektiösem Virus im Gehirn Immunisierung mit den Peptiden 9048, 9050, rekombinantem Nukleoprotein oder Bacterial Ghosts und anschließende Virusinfektion: Aktivierungsgrad von CD8 + T-Zellen zu einem späten Zeitpunkt nach Infektion (Experiment 3) 113 a. Auftreten BDV-spezifischer Symptome 114 b. Auftreten BDV-spezifischer Antikörper 117 c. In vitro Zytotoxizitätstest Immunisierung mit dem Peptid 9048 oder rekombinantem Nukleoprotein und anschließende Virusinfektion : Aktivierungsgrad von CD8 + T-Zellen zu einem frühen Zeitpunkt nach Infektion (Experiment 4) 120 a. Auftreten BDV-spezifischer Symptome 121 b. Auftreten BDV-spezifischer Antikörper 123 c. In vitro Zytotoxizitätstest DISKUSSION ZUSAMMENFASSUNG A SUMMARY LITERATUR 148 -IV-