LD BioScreen. Low Density Biochip Schnelltest-Systeme. Offenes System für Indirekte Immunoassays (Antikörpertitration) LD BioScreen

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1 LD BioScreen Low Density Biochip Schnelltest-Systeme Offenes System für Indirekte Immunoassays (Antikörpertitration) LD BioScreen Die Alternative zur Mikrotiterplatte Für Assays im Forschungslabor Sie sparen Material, Zeit und Geld. BioTeZ Berlin-Buch GmbH Robert-Rössle-Str. 10 D Berlin Tel.: +49 (0) Fax: +49 (0) Internet: Nur für wissenschaftliche Zwecke. Nicht für die humanmedizinische Diagnostik.

2 Einführung Unter der Bezeichnung LD BioScreen ist eine Technologie auf der Basis von Low Density Biochips zusammengefasst, die Anwendern eine unkomplizierte und rasche Durchführung verschiedenartiger Immuno- bzw. DNA-Assays in miniaturisiertem Maßstab ermöglicht. Mit der Miniaturisierung ist gleichzeitig eine Verkürzung der Analysenzeiten und eine deutliche Einsparung bei Materialien und Reagenzien verbunden. Hauptanwendungsgebiete sind Antikörpertitrationen und Analysen von PCR- Produkten sowie kompetitive und Sandwich-Immunoassays. Darüber hinaus können auch multiple Assays auf Low Density Biochips durchgeführt werden. Die Einzelkits sind in Abhängigkeit vom Assaytyp unterschiedlich umfangreich zusammengesetzt und enthalten eine Reihe notwendiger Komponenten, um mit eigenem Probenmaterial, Antikörpern, Immunkonjugaten bzw. Nachweiskonjugaten Assays abarbeiten zu können. Je nach Art des Assays enthalten die Kits Basis-LD Biochips oder Streptavidin-LD Biochips. Im Unterschied zu den alternativen Medium und High Density Chips lassen sich LD Biochip Assays auch in manueller Arbeitsweise durchführen. Dafür benötigt man lediglich eine Mikropipette oder Mikromultipette, eine Spritzflasche (zum Waschen) sowie unsere preiswerte MultiCam (ein optisches Messsystem mit Digitalkamera). Soll das Chip-Ergebnis nicht nur rein visuell ausgewertet werden, steht entsprechende Software zur Verfügung. Für die LD BioScreen Plattform existiert darüber hinaus ein speziell dafür entwickeltes Gerätesystem. Hierzu zählen Spotter, Washer/Aspirator, Biochip-Halter, Inkubationskammer, Applikationskammer sowie ein Laser- Fluorimeter mit Auswertesoftware. Dieses Gerätesystem stellt eine erhebliche Erleichterung dar und kann wahlweise in unterschiedlichem Umfang einsetzt werden. 2

3 LD BioScreen: Indirekter Immunoassay (Antikörpertitration) auf dem LD Biochip Low Density Biochip A B C D E F G H Der LD Biochip besteht aus Kunststoff und hat die Abmaße eines Objektträgers. Unter dem Logo befindet sich ein Feld für Beschriftungen. Die 32 Spots sind in 4 Spalten (1-4) und 8 Reihen (A-H) angeordnet und entsprechen einem Ausschnitt einer 384-well Mikrotiterplatte. Der Low Density Biochip ist so konzipiert worden, dass darauf Assays wie bisher auf Mikrotiterplatten ausgeführt werden können. Im Vergleich zum Mikrotiterplatten-Assay werden auf dem Low Density Biochip statt der üblichen µl/well nur 2 4 µl/spot an Substanzlösung eingesetzt ein Spotvolumen, was sich auch manuell noch handhaben lässt Optisches Auswertegerät Das Ergebnis des Immuno- oder DNA-Assays auf dem LD Biochip wird mit einem optischen Auswertegerät (Digitalkamera) dokumentiert und in Form eines BMP-files ausgegeben. Ein zusätzliches Auswerteprogramm setzt die Spotfärbungen in numerische Messsignale um, sogenannte Relative Pixel Units (RPU). Laser Fluorimeter Mit dem Laser Fluorimeter LF 401 der Fa. IOM, Berlin, können LD Biochip Assays mit Fluoreszenz-Detektion gemessen werden. Hierzu gehört eine entsprechende Auswertesoftware. Die Fluoreszenz Färbung der Spots wird in numerischer Form als Relative Light Units (RLU) ausgegeben. 3

4 Titration von polyklonalen Antikörpern Beispiel: Titration eines ungereinigten Kaninchen Antiserums gegen ein Clenbuterol-HSA-Konjugat auf dem Basis LD Biochip Aufbau: Basis LD Biochip Immunogen Blocken Antikörper sek. anti-kaninchen- Antikörper-POD TMB Voraussetzung: Vorhandensein des Immunogens Kit-Bestandteile: BioTeZ-Basis-LD Biochips Beschichtungspuffer Verdünnungspuffer, enthält HSA anti-kan-igg-pod-konzentrat präzipitierendes Farbsubstrat Tetramethylbenzidin (TMB), ready-to-use Minimal notwendige Laborausstattung: Vortex-Mixer, Mikropipette oder Mikromultipette für 1 10 µl, Feuchtkammer für Objektträger, optische Auswerteeinheit mit Software Versuchsdurchführung 1 Basis-LD Biochip Bindung des Immunkonjugates: Spalte 1+2, Reihe A-H Spalte 3+4, Reihe A-H Doppel-Bestimmungen leer (zur Überprüfung unspez. AK-Bindung) Clenbuterol-HSA-Immunkonjugat: 100 µg/ml Verdünnung in Beschichtungspuffer Inkubation: 4h / Raumtemperatur, in Feuchtkammer Blocken: tauchen in Blocklösung, leicht schütteln! Reaktion mit Antiserum-Verdünnungen: Ausgang: natives Antiserum gegen Clenbuterol Reihe A-H, Spalte / 1:32000 / 1:16000 / 1:8000 / 1:4000 / 1:2000 / 1:1000 / 1:500 Verdünnungen in Verdünnungspuffer (enthält hohe HSA Konzentration zum Abblocken möglicher HSA-Antikörper) Inkubation: 15 min. / Raumtemperatur, in Feuchtkammer Reaktion mit anti-kan-igg-pod: 1:100-Verdünnung der Originallösung in Verdünnungspuffer alle Spots Nachweis-Reaktion: Messung: Auswertung: präzipitierendes TMB, ready to use nass (ohne abzusaugen) mit optischer Auswerteeinheit Datenerfassung mit Software 4

5 Ergebnis: Messwerte: Angaben in RPU Reihe: Antiserum- Verdünnung Spalte 1 Spalte 2 Spalte 3 Spalte 4 Mittelwert (e) A B 1: C 1: D 1: E 1: F 1: G 1: H 1: RPU: : : Relative Pixel Units unspezifische Bindung spezifische Bindung des Antiserums an das Immunkonjugat Titration von Clenbuterol Antiserum : : :8000 RPU 1:4000 1:2000 1:1000 1:500 Verdünnung Antiserum Zusammenfassung: Bis zu einer Antiserum-Verdünnung von mindestens 1:8000 ist eine eindeutige Bindung an das Immunkonjugat nachweisbar. Es tritt keine unspezifische Bindung auf. 5

6 Titration von monoklonalen Antikörpern Beispiel: Vergleichende Titration von 2 monoklonalen Antikörpern gegen IL-2 auf dem Basis LD Biochip Aufbau: Basis LD Biochip Immunogen Blocken Antikörper sek. anti-maus-antikörper- POD TMB Voraussetzung: Vorhandensein des Immunogens (Interleukin 2, IL-2) Kit-Bestandteile: BioTeZ-Basis-LDBiochips Beschichtungspuffer Verdünnungspuffer anti-maus-igg-pod-konzentrat präzipitierendes Farbsubstrat Tetramethylbenzidin (TMB), ready-to-use Minimal notwendige Laborausstattung: Vortex-Mixer, Mikropipette oder Mikromultipette für 1 10 µl, Feuchtkammer für Objektträger, optische Auswerteeinheit mit Software Versuchsdurchführung 1 Basis-LD Biochip Bindung von IL-2: Spalte 1+3 Spalte 2+4 Blocken: Einzelbestimmungen, 8 Antikörperkonzentrationen leer IL-2: 150 µg/ml Verdünnung in Beschichtungspuffer Inkubation: 15 min. / Raumtemperatur, in Feuchtkammer tauchen in Blocklösung (Verdünnungspuffer 1:3 mit aqua dest. verdünnen) leicht schütteln! Reaktion mit IL-2-mAK-Verdünnungen: Spalte 1+2, Reihe A-H mak gegen IL-2 mak1 Spalte 3+4, Reihe A-H mak gegen IL-2 mak2 Verdünnungen in Verdünnungspuffer 0 / 5 / 10 / 20 / 40 / 80 / 160 / 320 µg/ml Inkubation: 15 min. / Raumtemperatur, in Feuchtkammer Reaktion mit anti-maus-igg-pod: 1:100-Verdünnung der Originallösung in Verdünnungspuffer alle Spots Nachweis-Reaktion: Messung: Auswertung: präzipitierendes TMB, ready to use nass (ohne abzusaugen) mit optischer Auswerteeinheit Datenerfassung mit Software 6

7 Ergebnis: Messwerte: Angaben in RPU Reihe: mak (µg/ml) Spalte 1 Spalte 2 Spalte 3 Spalte 4 A B C D E F G H RPU: : : mak: Relative Pixel Units unspezifische Bindung spezifische Bindung des Antiserums an das Immunkonjugat monoklonaler Antikörper Titration von 2 verschiedenen maks gegen IL RPU mak (µg/ml) mak1 mak2 Zusammenfassung: Der Antikörper mak1 ist wesentlich affiner als der Antikörper mak2. 7

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