Eine neue effiziente PCR-Methode zur akkuraten Bestimmung von Mycobacterium avium subsp. (MAP)

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1 Eine neue effiziente PCR-Methode zur akkuraten Bestimmung von Mycobacterium avium subsp. (MAP) Standardized. Streamlined. Efficient. RealPCR MAP DNA Test RUMINANTS WIEDERKÄUER RUMINANTS RUMIANTES 反刍动物反芻動物 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

2 RealPCR bei IDEXX (CAG) Die molekulardiagnostik Labore von IDEXX in Sacramento und Ludwigsburg, nutzen die modulare RealPCR Plattform seit Bisher sind 200 RealPCR tests entwickelt worden für die IDEXX Referenzlabore Weltweit. In Ludwigsburg werden pro Jahr etwa Proben in 2 MioTests untersucht. Das modulare Konzept der RealPCR Platform wird nun in der IDEXX Livestock, Poultry, and Dairy Division für Kunden verfügbar gemacht. Die modulare RealPCR Plattform, reduziert die Kosten der Analysen, durch verringerten Arbeitsaufwandt, geringere Investitionen in Maschinen und die effizientere Nutzung der Reagenzien. Christian Leutenegger, DrVetMed, PhD, FVH, Head of Molecular Diagnostics, IDEXX Molecular Diagnostics Laboratory IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

3 RealPCR gemeinsame Reagenzien IDEXX modulares System traditionelle Real-time PCR Detection Mix Detection Mix RNA Master Mix DNA Master Mix DNA or RNA Master Mix spezifische Positivkontrolle Positivkontrolle spezifisch gemeinsam Detection Mix: Primer und Sonden für Zielsequenz und interne Probenkontrolle Master Mix: Enzyme und Nukleotide Positivkontrolle IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

4 10 Jahre Erfahrung mit der modularen RealPCR Plattform IDEXX RealPCR traditionelle real-time PCR kits Zielspezifisch Gemeinsame Reagenzien Detektions mix RNA / DNA master mix Positiv kontrolle Negativ kontrolle IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

5 Standardisiertes PCR-Programm erhöhter Durchsatz mit der RealPCR Plattform Ein Programm für alle RNA und DNA Zielsequenzen Unterschiedliche Tests in einem PCR lauf (70min) weniger Fehler aufgrund unterschiedlicher PCR Programme geringerer Schulungsaufwand für Personal Real-time PCR Schritte Temperatur Zeit Zyklen reverse Transkription 50 C 15 min 1 initiales denaturieren 95 C 1 min 1 Amplifikation 95 C 60 C 15 sec 30 sec IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

6 RealPCR MAP DNA Test Ablauf Optimierte pre-extraction zur standardisierten MAP Detektion IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

7 Sensitivität und Spezifizität Analytische Sensitivität <10 Kopien Bestätigte positive and negative Proben aus Europa und Nordamerika Sample status Confirmed positives Confirmed negatives Sample number IDEXX RealPCR MAP Discrepant Diagnostic sensitivity % % Exklusivität wurde durch testen von 24 Proben verschiedener Mycobacteria Spezies bzw. Bakterien und Viren bestätig, basierend auf den vvrgaben des FLI Es wurde keine unspezifische Amplifikation festgestellt IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

8 Ct Values IDEXX Bovine Diagnostics Schwach positive Proben Vergleich zu anderen Tests Zwei schwach positive Proben wurden vor der Extraktion in negativen Proben verdünnt Die Proben wurden mit IDEXX RealPCR und dem PCR-Test eines anderen Herstellers getestet Vergleich 50 No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct Neat 1:10 1:100 1:1K Neat 1:10 1:100 1:1K Sample 1 Sample 2 RealPCR MAP Other PCR IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

9 MAP Testing Test Probentyp Performance Pro s Con s Kultur Feces Se 30-50% Sp 100% PCR Feces Se 30-70% Sp 100% Tankmilch ELISA Blut Se 40-80% Sp > 99% Milch Se 40-80% Sp > 99% Tankmilch Se 20-30% Sp 99% Positives Ergebnis ist Aussagekräftig, hohe Spezifität, gute Bestätigung eines Befundes schnell, hohe spezifität, positives Ergebnis Aussagekräftig Guter Indikator für MAP in Milch Einfach, schnell, kostengünstig Einfacher als Blut, option häufiger zu testen Güntig und einfach. Zeigt Anwesenheit von MAP Bis zu 14 Wochen, schwache Sensitivität in jungen bzw. subklinischen Tieren und schwachen/mittleren Exkretierern Schwache Sensitivität in in jungen bzw. subklinischen Tieren Kaum Informationen zu Prevalenz, Kontaminationen möglich Blutprobe erforderlich Nachverfolgung schwieriger Poor sensitivity: a negative result does not mean a lot IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

10 Johne s Diagnose und Management Wiederholte ELISA tests erlauben eine frühere Identifizierung infizierter Tiere (Nielsen & Ersboll 2006). Kühe können wechselnde Ergebnisse aufweisen, dies kann frustrierend sein für Veterinäre und Halter. Jedes einmal positiv getestete Tier sollte als Risiko Tier behandelt werden. In Gebiete mit TB Haut Tests, können MAP ELISA Ergebnisse beeinflusst sein. - Proben für MAP sollten vor dem Test gezogen werden. - Alternativ können Feces zur analyse mit PCR genutzt werde. Kolostrum management: pasteurisieren (60 C for 60 minutes) is zur MAP-Eliminierung ausreichend. Die morbidität wird signifikant reduziert (Donahue 2012) Risko Einschätzung Tests zur status Etablierung Tests für Krankheitsmanagement IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

11 Guidelines Johne s ELISA und PCR Diagnose Use ELISA to Use PCR to Management Entscheidung Status etablieren Identifikation von Exkretierern Status Etablierung - Herdenstatus (Tankmilch negative, schließt MAP Anwesenheit nicht aus; Test der Schlachtiere, Ziel 30 Kühe Screening oder ganze Herde Testen) Minimum Tests - Halbjährig 30 Tiere - Halbjährig Schlachttiere testen - Häufiger (vierteljährig) abhängig von Management und Prevalenz Kontrollen - strategische Tests-zur Management Entscheidung: Transitionsphasen: Laktation, Trockenstehen oder Empfängnis Minimum: Einzeltest bei Trockenstehphase Ideal: Zwei Tests pro Jahr (vor Trockenstehphase und vor Empfängnis) oder Vierteljährig In ganzjährig kalbenden Herden ist ein jährlicher Test pro Tier unzureichend IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

12 RealPCR MAP DNA Test RealPCR MAP DNA Mix RealPCR ASFV DNA Mix IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

13 Thank you! IDEXX Bovine Diagnostics Dr. Jan van Ooyen PCR Application Specialist EMEA IDEXX Livestock, Poultry and Dairy IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.