Vertiefendes Seminar zur Vorlesung Biochemie I

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1 Vertiefendes Seminar zur Vorlesung Biochemie I Klausurvorbereitung: Gerhild van Echten-Deckert Rekombinante DNA Fon Homepage:

2 Klärung einiger Begriffe: Replikation Replikationsursprung Replikationsgabel Nukleasen (Exo-, Endo-, Restriktions-) Genetischer Fingerabdruck Template-Strang (3 ->5 >5 ) Codierender Strang (5 ->3 ) Transkritption (reverse Tr.) Translation (genetischer Code) Nukleasen (Exo-, Endo-, Restriktions-) Exons, Introns cdna PCR (polymerase chain reaction)

3 Zusammenfassung der Schritte, die vom Gen zum Protein führen. Die Menge eines Proteins in einer Zelle hängt letztendlich von der Effizienz der einzelnen Schritte und der Abbaugeschwindigkeit der RNA und der Proteinmoleküle ab. (A) In eukaryontischen Zellen enthält des anfängliche RNA-Molekül (das Primärtranskript), das durch die Transkription entsteht, Intron- und Exonsequenzen. Seine zwei Enden werden modifiziert und die Introns in einer enzymatisch katalysierten RNA-Spleißreaktion entfernt. Die resultierende mrna wird vom Zellkern ins Cytoplasma transportiert, wo sie in Protein übersetzt wird. Obwohl diese Schritte hier so dargestellt sind, als würden sie einer nach dem anderen erfolgen, geschehen sie in Wirklichkeit oft gleichzeitig. Das RNA-Cap kann z.b. schon angefügt und das Spleißen begonnen werden, bevor das Primärtranskript fertiggestellt ist. (B) In Prokaryonten verläuft die mrna-produktion einfacher. Das 5 -Ende eines mrna-moleküls wird durch den Transkriptionsbeginn von der RNA-Polymerase gebildet und das 3 -Ende entsteht durch die Beendigung der Transkription. Da prokaryontische Zellen keinen Zellkern haben, finden Transkription und Translation im selben Kompartiment statt.

4 The Standard Genetic Code Biochemistry. Voet & Voet

5 Transcription and Translation. These two processes are closely coupled in prokaryotes, whereas they are spatially and temporally separate in eukaryotes. (A) In prokaryotes, the primary transcript serves as mrna and is used immediately as the template for protein synthesis. (B) In eukaryotes, mrna precursors are processed and spliced in the nucleus before being transported to the cytosol for translation into protein.

6 1-4: fundamentale molekulargenetische Prozesse 1-3 liegen der Proteinbildung zugrunde Lodish et al.: Molecular Cell Biology

7 Restriktions-Endonucleasen o Restriktions-Endonucleasen erkennen spezifisch Sequenzen von 4-8 Basen im Doppelstrang. o Schnitte : glatt oder überlappend, immer beide Stränge (Hamilton Smith, Daniel Nathans) o Heute mehr als 500 Enzyme bekannt. o Drei Typen : Type I und III : besitzen Endonuclease und Methylierungsfähigkeit Typ II : nur Endonucleasen EcoRI produziert kohäsive Enden (sticky ends) HaeIII produziert stumpfe Enden (blunt ends)

8 Selected restriction enzymes

9 DNA ligase reaction. DNA ligase catalyzes the joining of one DNA strand with a free 3 -hydroxyl group to another with a free 5 -phosphate group. In eukaryotes and archea, ATP is cleaved to AMP and PP + i to drive this reaction. In bacteria, NAD is cleaved to AMP and nicotinamide mononucleotide (NMN) Berg, Tymoczko, Stryer: Biochemistry

10 Plasmids are extrachromosomal self-replicating DNA molecules The constructed E. coli plasmid pbr322

11 Cloning foreign DNA in E. coli and identification of cells containing it

12 Plasmid cloning permits isolation of DNA fragments from complex mixtures

13 Identifizierung des gewünschten Klons mittels Hybridisierung Lehninger Principles of Biochemistry 5 th ed.

14 The chain-terminator (dideoxy) method of DNA sequencing

15 Strategy for automating DNA sequencing reactions

16 Polymerase chain reaction: an alternative to cloning

DNA Replikation ist semikonservativ. Abb. aus Stryer (5th Ed.)

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