Einnistung hygienisch relevanter Bakterien in Biofilme aufgrund von Materialveränderungen? (Teilprojekt 4b)

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1 BMBF-Projekt: Vermeidung und Sanierung von Trinkwasser-Kontaminationen durch hygienisch relevante Mikroorganismen aus Biofilmen der Hausinstallation Einnistung hygienisch relevanter Bakterien in Biofilme aufgrund von Materialveränderungen? (Teilprojekt 4b), AG Aquatische Mikrobiologie, Fakultät für Chemie, Universität Duisburg-Essen M. Moritz, H.-C. Flemming, S. Eppmann, Z. Dwidjosiswojo, H. Petry-Hansen, A. Dannehl, J. Wingender

2 Ziele des Vorhabens Untersuchung der Ansiedlung und Persistenz hygienisch relevanter Bakterien in Trinkwasserbiofilmen auf Werkstoffen der Trinkwasser-Installation unter Laborbedingungen. Einfluss einer Alterung von Werkstoffen der Trinkwasser- Installation auf die Persistenz hygienisch relevanter Bakterien in Trinkwasserbiofilmen. Nachweis der Persistenz der Zielorganismen in Biofilmen mit Kulturverfahren und der kultivierungsunabhängigen Methode der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (). 2

3 Auswahl der Werkstoffe Werkstoffe: EPDM Silanvernetztes Polyethylen (PE-Xb) Strahlenvernetztes Polyethylen (PE-Xc) Kupfer Erfüllen Anforderungen der KTW-Empfehlungen und des DVGW-Arbeitsblatts W 270 Coupons (26 mm x 76 mm) als Aufwuchsträger für Biofilme Alterung: EPDM, PE-Xb, PE-Xc: NaOCl-behandelt (TP 4a) EPDM, PE-Xb: ClO 2 -behandelt (TP 4a) Kupfer: mindestens 6 Monate in einem Trinkwasserverteilungssystem exponiert. 3

4 Teststämme: Isolate aus Kontaminationsfällen Pseudomonas aeruginosa AdS Herkunft: Trinkwasser-Installation einer Schule, Wasser aus Selbstschlussarmatur. Legionella pneumophila AdS (Serogruppe 1) Herkunft: Trinkwasser-Installation einer Schule, Biofilm aus Selbstschlussarmatur. Enterobacter nimipressuralis Klon A Herkunft: aus dem Hochbehälter eines Trinkwassersystems; Institut für Hygiene und Öffentliche Gesundheit, Bonn. 4

5 Einnistungsversuche: Ablauf und Analytik P. aeruginosa, L. pneumophila, E. nimipressuralis (10 6 Zellen/mL), 24 h ausgehungert in Trinkwasser Anzucht von Trinkwasserbiofilmen auf Coupons (Durchfluss 20 L/h, 14 Tage; 20,3 C) Animpfen der Biofilme mit den Zielorganismen in Kleinreaktoren 24 h Stagnation, dann Wiederherstellung des Durchflusses (3 L/h; 18,4 C, ph 7,9) Beprobung von Biofilm und Wasserphase vor und 1, 14, 28 Tage nach Animpfen Nachweis der Zielorganismen Koloniezahl (HPC: R2A, 20 C, 7 d) Gesamtzellzahl (DAPI-Methode) P. aeruginosa E. nimipressuralis L. pneumophila CN-Agar, 36 C, 48 h Sonde Psae16S-182 Colilert-18 / QuantiTray 2000 GVPC-Agar, 36 C, 10 d Sonde LEGPNE1 Isolate Isolate Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) API 20 NE PFGE Wachstum auf BCYEa- und Nähragar Bestimmung der Art/Serogruppe mit Latex-Agglutination 5

6 Gesamtzellzahl (Zellen/cm²) Koloniezahl (KBE/cm²) Biofilmbildung auf Werkstoffen der Trinkwasser- Installation Trinkwasserbiofilme auf EPDM, PE-Xb, PE-Xc und Kupfer, neu und gealtert 1,00E+08 Gesamtzellzahl 1,00E+08 Koloniezahl (HPC) 1,00E+07 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 * 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+03 * 1,00E+02 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 EPDM PE-Xb PE-Xc Kupfer 1,00E+01 1,00E+00 EPDM PE-Xb PE-Xc Kupfer * Geometrisches Mittel aus 2 bis 4 unabhängigen Experimenten mit je vier Probenahmezeitpunkten über den Zeitraum 14 bis 43 Tage. neu (unbehandelt) NaOCl-behandelt / in Trinkwasser exponiert* ClO 2 -behandelt Beprobte Fläche ~ 76 cm² * Kupfer wurde zur Alterung mindestens 6 Monate in einem Trinkwasserverteilungsnetz exponiert 6

7 P. aeruginosa (KBE bzw. Zellen/cm²) n.n. n.n. n.n. n.n. Nachweis von P. aeruginosa in Biofilmen Persistenz von P. aeruginosa in Trinkwasserbiofilmen auf PE-Xb, neu und gealtert Nachweis: kulturell und mit 1,00E+05 NaOCl-Behandlung ClO 2 -Behandlung 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 1,00E Tage nach Animpfen Beprobte Fläche ~ 76 cm² n.n. nicht nachgewiesen PE-X b neu PE-X b gealtert kulturell kulturell 7

8 L. pneumophila (KBE bzw. Zellen/cm²) Nachweis von L. pneumophila in Biofilmen Persistenz von L. pneumophila in Trinkwasserbiofilmen auf PE-Xb, neu und gealtert Nachweis: kulturell und mit 1,00E+05 1,00E+04 NaOCl-Behandlung ClO 2 -Behandlung 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 1,00E Tage nach Animpfen Beprobte Fläche ~ 76 cm² PE-X b neu PE-X b gealtert kulturell kulturell 8

9 P. aeruginosa (KBE bzw. Zellen/cm²) Nachweis von P. aeruginosa und L. pneumophila in Biofilmen L. pneumophila (KBE bzw. Zellen/cm²) Persistenz von P. aeruginosa und L. pneumophila in Trinkwasserbiofilmen auf PE-Xc, neu und gealtert (NaOCl-behandelt) Nachweis: kulturell und mit P. aeruginosa L. pneumophila 1,00E+05 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+01 1,00E+00 1,00E+00 1,00E Tage nach Animpfen 1,00E Tage nach Animpfen Beprobte Fläche ~ 76 cm² PE-Xc neu kulturell PE-Xc gealtert kulturell 9

10 L. pneumophila (KBE bzw. Zellen/cm²) n.n. Nachweis von L. pneumophila in Biofilmen Persistenz von L. pneumophila in Trinkwasserbiofilmen auf Kupfer, neu und gealtert Nachweis: kulturell und mit 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 1,00E Tage nach Animpfen Beprobte Fläche ~ 76 cm² n.n. nicht nachgewiesen Kupfer neu kulturell Kupfer gealtert kulturell 10

11 Persistenz von P. aeruginosa und L. pneumophila in Trinkwasserbiofilmen Werkstoff Maximale Nachweisbarkeit in Tagen P. aeruginosa L. pneumophila kulturell kulturell EPDM neu EPDM NaOCl-behandelt EPDM ClO 2 -behandelt PE-Xb neu PE-Xb NaOCl-behandelt PE-Xb ClO 2 -behandelt PE-Xc neu PE-Xc NaOCl-behandelt Kupfer neu Kupfer Trinkwasser-behandelt P. aeruginosa und L. pneumophila waren kulturell in der Wasserphase mindestens solange wie im Biofilm nachweisbar. Eine Einnistung von E. nimipressuralis wurde kulturell in keinem Fall nachgewiesen. 11

12 I B 1 d W 1 d B 28 d W 28 d M M I B 1 d W 1 d B 21 d W 21 d Typisierung von P. aeruginosa und L. pneumophila Genotypisierung von P. aeruginosa und L. pneumophila-isolaten aus Inokulum, Biofilmen und Wasser mittels Pulsfeldgelelektrophorese. Alle Isolate aus Biofilmen und Wasser wiesen identische Bandenmuster auf. Bestätigung der Identität der Biofilmund Wassserisolate mit den Ausgangsstämmen. P. aeruginosa L. pneumophila M Marker I Inokulum B Biofilm W Wasserphase Fragmentmuster von Isolaten aus Wasser und Biofilmen von PE-Xc 12

13 "Viable but non-culturable" (VBNC)-Zustand Mit der kultivierungsunabhängigen -Technik wurden teilweise um Größenordnungen höhere Konzentrationen von P. aeruginosa und L. pneumophila als mit kulturellen Verfahren nachgewiesen. Hinweis auf Vorliegen eines VBNC-Zustands der Bakterien? Auf üblichen Nährmedien kultivierbar Induktion des VBNC-Zustands durch Stressbedingungen: Nährstoffmangel, ungünstige Umgebungstemperaturen, Desinfektionsmittel, toxische Metallionen Wiederbelebung durch Eliminierung/Neutralisierung von Stressfaktoren VBNC-Zustand: Auf üblichen Nährmedien nicht kultivierbar, aber noch lebend und mit kultivierungsunabhängigen Verfahren nachweisbar. 13

14 Induktion des VBNC-Zustands durch Kupfer Kupferionen induzieren einen VBNC-Zustand bei planktonischen Zellen von P. aeruginosa. Poster Einfluss von Kupferionen in Trinkwasser auf die Vitalität und Cytotoxizität von Pseudomonas aeruginosa Kupferionen sind möglicherweise auch an der Induktion bzw. Aufrechterhaltung eines VBNC-Zustands von P. aeruginosa in Trinkwasserbiofilmen verantwortlich. 14

15 Konzentration (Zellen bzw. KBE/cm²) Revitalisierung von P. aeruginosa im Biofilm P. aeruginosa-haltiger Trinkwasserbiofilm vor und nach 7 d Inkubation bei 20 C ohne bzw. mit dem Kupferchelator NDDC GZZ (Zellen/cm²) HPC (KBE/cm²) CN (KBE/cm²) (Zellen/cm²) Anteil kultivierbarer P. aeruginosa an -positiven P. aeruginosa 0,07 % 0,08 % 8,20 % 0 d 7 d, ohne NDDC 7 d, mit NDDC Kupferchelator: 100 µm NDDC (Natriumdiethyldithiocarbamat) Kupfergehalt des Biofilms zum Zeitpunkt des Animpfens: 0,005 mg/cm² Kupfergehalt des zulaufenden Trinkwassers: 0,06 mg/l Vor Zugabe von 7 NDDC: d Inkubation deutliche ohne NDDC: 7 d Inkubation deutliche mit 100 µm NDDC: kultivierbare Differenz zwischen Differenz kultivierbaren zwischen und kultivierbaren und -positive und P. aeruginosa nehmen zu. Die -positiven P. -positiven aeruginosa P. aeruginosa Differenz zwischen beiden wird kleiner. P. aeruginosa im P. VBNC-Zustand aeruginosa im VBNC-Zustand (teilweise) Revitalisierung von P. aeruginosa 15

16 Zusammenfassung I Einnistung der fakultativ pathogenen Bakterien P. aeruginosa und L. pneumophila in Biofilme auf neuen und gealterten Werkstoffen der Trinkwasser-Installation Einnistung in Biofilme auf allen Werkstoffen (EPDM, PE-Xb, PE-Xc und Kupfer), Ausnahme: keine Einnistung von P. aeruginosa in Biofilme auf Kupfer nachgewiesen; Persistenz der Bakterien in den Biofilmen über mehrere Wochen; Keine Vermehrung der Organismen in den Biofilmen; Kein Hinweis auf einen Einfluss der Werkstoffalterung auf die Einnistung und Persistenz der Organsimen in den Biofilmen. Biofilme auf Werkstoffen der Trinkwasser-Installation können unter Kaltwasserbedingungen potenzielle Reservoire für P. aeruginosa und L. pneumophila sein. 16

17 Zusammenfassung II VBNC-Zustand Die Konzentration -positiver Zellen war sowohl auf neuen als auch auf gealterten Werkstoffen in der Regel höher als die Anzahl kultivierbarer Bakterien. Hinweis auf Vorliegen der Bakterien in einem VBNC-Zustand Das Verhältnis kultivierbarer zu -positiven Zellen variierte abhängig von der Spezies (P. aeruginosa < L. pneumophila) und dem Werkstoff (Kupfer < EPDM, PE-Xb und c). Wirkung von Kupferionen auf die Vitalität von P. aeruginosa Anwesenheit von Kupferionen ist eine mögliche Ursache für den Übergang vom kultivierbaren in einen nicht kultivierbaren Zustand (VBNC) von P. aeruginosa in Biofilmen der Trinkwasser- Installation. Aufhebung des Kupferstresses führt zur Revitalisierung von P. aeruginosa. 17

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