GEIM- TECHIMOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN

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1 GEIM- TECHIMOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN Ein Handbuch experimenteller Techniken und Verfahren Herausgegeben von Rudolf Hagemann Bearbeitet von Frank Baldauf, Jörn Belter, Sabine Brantl, Baimund Eck, Karsten Fritzsche, Monika Hagemann, Hblger Junghans, Michael Metzlaff, Gerhard Saalbach und Kerstin Steiner Redaktion: Monika Hagemann m SEMPERm Gustav Fischer Verlag Stuttgart New York 1990

2 1. Kultur von gentechnologisch relevanten Objekten Kultivierung von Bakterien Isolierung von Einzelkolonien Flüssigkultur Lagerung Vermehrung von Bakteriophagen Piaquereinigung des Bakteriophagen Lambda Herstellung eines Phagenlysates aus einem einzelnen Plaque Vermehrung von Lambda-Phagen in Flüssigkultur Vermehrung von 5113-Phagen in Flüssigkultur Lagerung Kultivierung von Hefe 18 Literatur Isolation von DNA und RNA Gesamt-DNA aus pflanzlichen Zellen Präparation von Human-DNA Präparation von DNA aus Blut Präparation von DNA aus Gewebe und kultivierten Zellen Isolation von chromosomaler DNA aus Saccharomyces cerevisiae Isolation von-plastidaler DNA aus höheren Pflanzen Isolation von mitochondrialer DNA (mtdna) aus pflanzlichem Gewebe Isolation chromosomaler Bakterien-DNA Plasmid-DNA aus Escherichia coli Präparationsmethoden im großen Maßstab Plasmid-Minipräparationsmethoden Plasmid-Isolation aus Saccharomyces cerevisiae Isolierung von Hefe-Sphäroplasten Große Plasmid-Isolation aus Saccharomyces cerevisiae Mini-Präparation von Hefe-Plasmiden zum Transformanten-Screening Isolation von Bakteriophagen-DNA (Lambda-DNA) Infektion Induktion Reinigung der Lambda-Phagen Extraktion der Lambda-DNA 51

3 ' Inhalt Isolation von Gesamt-RNA Isolation von RNA aus Escherichia coli RNA-Isolation aus pflanzlichen Geweben Isolation von Gesamt-RNA aus Saccharomyces cerevisiae Isolation von mrna 58 Literatur Fragmentierung von DNA Fragmentierung von DNA mit Restriktionsenzymen Vollständige Verdauung von DNA mit Restriktionsenzymen Partielle Verdauung von DNA mit Restriktionsenzymen Erzeugung von Deletionsmutanten durch Einsatz von Exonucleasen in vitro Nuclease BAL Exonuclease III Nuclease S1 72 Literatur Gelelektrophoretische Auftrennung und Isolation von DNA und RNA Auftrennung von DNA in Agarosegelen Auftrennung von DNA und RNA in Polyacrylamidgelen Polyacrylamidgelelektrophorese von DNA Polyacrylamidgelelektrophorese von RNA Isolation von DNA-Fragmenten Isolation aus PAA-Gelen Isolation aus Agarosegelen durch Elektrotransfer an DEAE-Zellulose Isolation aus Agarosegelen durch Elektrotransfer an Dialysemembranen Isolation aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt Isolation durch Extrusion aus der Gelmatrix ' Trennung von RNA-Molekülen in Agarosegelen 91 Literatur "Verfahren zur Herstellung Ton komplementärer DNA (cdna) Herstellung doppelsträngiger cdna unter Einsatz von RNase H Herstellung doppelsträngiger cdna unter Einsatz von Sl-Nuclease Herstellung doppelsträngiger cdna unter Einsatz von Vektor-Primern" cdna-klonierung 5'-terminaler RNA-Sequenzen Möglichkeiten der Klonierung von RNA:DNA-Hybriden cdna-synthese zur Erzeugung hochmarkierter Hybridisierungssonden Polyadenylierung von 3'-poly(A)-RNA Reinigung und Fraktionierung von cdna Herstellung von Oligodesoxyribonucleotiden mit randomisierter Sequenz. : Optimierung des 3'-Tailing von cdna 114 Literatur Herstellung von rekombinierter DNA Ligation von Donor- und Vektor-DNA Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten Ligation von DNA-Fragmenten 123 8

4 6.2. Klonierung in Lambda-Vektoren Präparation der Fremd-DNA Präparation der Vektor-DNA Ligation 127 Literatur Übertragung rekombinanter DNA auf Wirtszellen Transformation von Bakterienzellen Transformation nach MANDEL und HIGA (1970; modifiziert) Transformation nach HANAHAN (1983; modifiziert) Transfektion und in vitro-verpackung Transfektion Präparation der Verpackungsextrakte In vitro-verpackung rekombinanter Lambda-DNA Transfektion mit M13-Phagen Transformation von Saccharomyces cerevisiae 137 Literatur : 138 S. Verfahren zum Nachweis spezifischer DNA-, RNA- und Protein-Moleküle in Zellen und zur Identifizierung rekombinanter Zellen und Klone Mikrobiologische Selektionsmethoden Inaktivierung von Resistenzmarkern Selektion unter Verwendung des lac-operons Selektion rekombinanter Lambda-Phagen Markierung von DNA oder RNA Nick-Translation Random-Priming-Markierung Die 5''End-Markierung Die 3'-End-Markierung In vitro-transcription Hybridisierungs-Verfahren Southern-Hybridisierung Northern-Blotting Gelelektrophoretische Trennung von RNA an Agarosegelen Northern-Blotting. u Hybridisierung Dot-Blot-Hybridisierung Koloniehybridisierung Plaquehybridisierung Immunoblotanalyse (Western-Blotting) 176 Literatur Verfahren der DNA-Sequenz-Analyse MAXAM-GrLBEBT-Technik (DNA-Sequenzanalyse durch basenspezifische chemische Spaltung) DNA-Endmarkierung DNA-Strangtrennung in Polyacrylamidgelen 186 9

5 Die basenspezifische chemische Spaltung ' M13-Sequenzierung durch Strangabbruchsynthese nach SANGER 190, Präparation von M13-Einzelstrang-DNA-Template Sequenzierung Gelelektrophorese und Autoradiographie Plasmid-Sequenzierung Denaturierung der Plasmid-DNA Sequenzierung 201 Literatur Methoden zum Nachweis der Genexpression in Bakterien Nachweis der Expression Plasmid-codierter Gene im Maxizellsystem von Escherichia coli Untersuchung der Expression Plasmid-codierter Gene im Minizellsystem von Escherichia coli ß-Galactosidase-Assay 210 Literatur Anhang Abkürzungsverzeichnis Verwendete Bakterienstämme Escherichia coli K Standardpuffer Elektrophoresepuffer Restriktionspuffer Restriktionsstopplösung Enzymstammlösungen Präparation organischer Reagenzien Präparation RNase-freier DNase Konzentrierung von Nucleinsäuren Quantifizierung von DNA und RNA Herstellung von Stammlösungen von NTPs oder dntps DNA-Daten Kernphysikalische Daten wichtiger Radionuclide Größe einzelner Restriktiofisfragmente aus Lambda- und pbr 322-DNA als Molekulargewichtsmarker Molekulargewichtsmarker für die Gelelektrophorese von RNA Antibiotika Polylinker-Sequenzen mit multiplen Erkennungsstellen für Restriktionsendonucleasen ausgewählter Klonierungsvektoren 223 Bücher zu Methoden der Gentechnologie 224 Sachregister

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