Angelika Stöcklinger. Molekulare Biologie und Biochemie Teil 7: Kohlenhydrate

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1 Angelika Stöcklinger Molekulare Biologie und Biochemie Teil 7: Kohlenhydrate

2 Kohlenhydrate und das Immunsystem z.b. Mannosen Bindungspartner für Lektine Mannose Aufnahme von Pathogenen Dendritische Zelle in Ruhe Lektin Aktivierte Dendritische Zelle Präsentation von pathogenen Peptiden Einleitung von gezielten Immunantworten

3 Kohlenhydrate Produkte der Photosynthese Mono- Di- Oligo- und Polysaccharide stellen zusammen mit Lipiden und Proteinen den größten Teil der Nahrung dar Monosaccharide (Glucose, Fructose) Disaccharide (Lactose, Maltose) und Oligosaccharide (Raffinose) sind wasserlöslich und süß = Zucker Polysaccharide (Stärke, Zellulose, Chitin) schlecht oder gar nicht wasserlöslich und geschmacksneutral

4 Monosaccharide Monosaccharide sind die einfachsten Kohlenhydrate. Sie besitzen mindestens 3 C-Atome Monosaccharide haben die Summenformel (CH 2 O) n. Es handelt sich um Aldehyde oder Ketone, mit zwei oder mehreren Hydroxylgruppen Monosaccharide besitzen entweder eine Aldehyd-Gruppe (Aldosen) oder eine Keto-Gruppe (Ketosen). Glycerinaldehyd und Dihydroxyaceton sind Triosen.

5 Monosaccharide und ihre stereochemische Beziehung Monosaccharide sind Stereoisomere mit gleicher Summen- und Strukturformel Unterscheidung: durch räumliche Anordnung der Atome am Molekül both modified figures Stryer: Biochemistry

6 D- und L Zucker Die D- und L-Reihen der Zucker sind wie bei den Aminosäuren definiert nach ihrer Strukturhomologie zu D- und L-Glycerinaldehyd (Emil Fischer, 1891). Bei grösseren Zuckern richtet sich die Einteilung nach D oder L nach demjenigen Asymmetriezentrum, das am weitesten von der Aldehydoder Ketogruppe entfernt ist. D-Glyceraldehyde L-Glyceraldehyde Dihydroxyacetone D-Glucose D-Fructose both modified figures Stryer: Biochemistry

7 Offenkettige Form, Ringform (Halbacetal, Halbketal) all figures Stryer: Biochemistry In wässriger Lösung liegen Zucker weit überwiegend als Ringe vor, sie können aber auch offenkettige Strukturen annehmen. In diesem Zustand haben sie freie Aldehyd- oder Keto-Gruppen.

8 Anomere Durch die Ringschliessung entsteht ein weiteres Asymmetriezentrum. Entsprechend gibt es zwei Varianten der Ringform, a und ß. a bedeuted OH-Gruppe am C1- Kohlenstoffatom unterhalb Ringebene ß bedeuted OH-Gruppe am C1- Kohlenstoffatom oberhalb Ringebene Zucker die sich nur in diesem ringschliessenden C-Atom unterscheiden nennt man Anomere Stryer: Biochemistry Glucose enthält in Lösung ca. 2/3 ß Anomer, ca. 1/3 α Anomer und <1% von der offenkettigen Form.

9 Praktikumsbeispiel 1: Nachweis der Glucose als Aldose Sie weisen im Versuch mit einem Aldehyd-spezifischen Agens (Purpald) nach, daß Glucose eine Aldose ist Dazu wird eine Glucoselösung erhitzt, weil dabei verstärkt Ringöffnung eintritt. Bei Reaktion mit einem Aldehyd bildet das Purpald-Reagenz farbige Produkte. Als Positivkontrolle verwenden Sie eine verdünnte Formaldehydlösung Vorsicht! Purpald ist in 10% NaOH gelöst = Ätzend, Handschuhe tragen!

10 Praktikumsbeispiel 2: Bestimmung des Gleichgewichtes der Phospho-Glucose-Isomerase Reaktion Sie messen im Versuch das Gleichgewicht einer Reaktion aus der Glycolyse, nämlich der Umwandlung von Glucose-6-Phosphat in Fructose-6-Phosphat. Die Reaktion wird durch das Enzym Phosphoglucoseisomerase katalysiert. In vivo liegt hier natürlich ein typisches Fließgleichgewicht vor. Fructose-6-Phosphat reagiert in der Zelle sofort weiter zu Fructose-1,6-bisphosphat. Im Praktikumsbeispiel 2 sollen Sie die Frage beantworten, wieweit diese Reaktion freiwillig auch dann ablaufen würde, wenn nicht die Produkte sofort in der Glycolyse weiter reagieren würden Nelson/Cox: Lehninger Principles of Biochemistry

11 Praktikumsbeispiel 2: Bestimmung des Gleichgewichtes der Phospho-Glucose-Isomerase Reaktion + Phosphoglucoseisomerase

12 Praktikumsbeispiel 2: Bestimmung des Gleichgewichtes der Phospho-Glucose-Isomerase Reaktion

13 Praktikumsbeispiel 2: NADP + /NADPH + H + Sie verwenden einen gekoppelten Test, bei dem durch Reduktion NADPH entsteht, das sich gut nachweisen lässt. NADH und NADPH absorbieren UV-Licht um 340 nm, NAD + und NADP + dagegen nicht. Unser Ansatz: Glucose-6-P + NADP + 6-Phosphogluconolacton + NADPH + H + Diese Reaktion wird von Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase katalysiert. Löffler/Petrides: Biochemie und Pathobiochemie Da für jedes vorhandene Glucose-6-P Molekül ein Molekül NADP + reduziert wird, kann man die NADPH- Konzentration nach Lambert-Beer bestimmen. Die NADPH Konzentration ist nun der Glucose-6-P Konzentration gleichzusetzen.

14 Praktikumsbeispiel 2: Freie Enthalpie Wenn ein System nicht im Gleichgewicht ist, gibt es eine Triebkraft die auf eine Einstellung des Gleichgewichts hindrängt. Diese Triebkraft ist die Änderung der Gibbs'schen freien Energie, ΔG Für eine Reaktion A B lässt sich definieren: [B] ΔG = ΔG + RT ln [A] ΔG ist die Änderung der freien Energie unter Standardbedingungen (1 atm, 25 C, 1 M Konzentration von Substrat und Produkt. R ist die Gaskonstante T ist die absolute Temperatur Für biologische Reaktionen verwendet man ΔG ', dabei ist noch ph = 7

15 Praktikumsbeispiel 2: Freie Enthalpie [B] ΔG = ΔG ' + RT ln [A] bedeutet, man kann ausrechnen, ob eine Reaktion freiwillig abläuft. Bei negativem ΔG (ΔG < 0) erniedrigt sich die Energie des Systems und die Reaktion erfolgt freiwillig. Im Gleichgewicht ist die treibende Kraft ΔG = 0, das heißt [B] [B] ΔG = 0 = ΔG ' + RT ln oder - ΔG ' = RT ln [A] [A] Sie können ΔG ' der Reaktion also aus den Konzentrationen von Substrat und Produkt berechnen. Im Versuch bestimmen Sie ΔG für die Reaktion. Glucose-6-Phosphat Fructose-6-Phosphat

16 Praktikumsbeispiel 2: Freie Enthalpie

17 Praktikumsbeispiel 3: Blutzucker Bestimmung mittels Glucoseoxidase Der Glucosegehalt einer Serumprobe wird mit der Glucoseoxidase (GOD) Methode bestimmt. Das macht man mit dieser Methode auch in der klinischen Diagnostik, z.b. für Diabetes. Glucoseoxidase setzt spezifisch ß-D-Glucose um, so daß keine "false positives" durch andere Zucker verursacht wird. Wir verwenden eine Glucoseoxidase aus einem Schimmelpilz. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt wieder über eine Farbänderung. ß-D-Glucose + FAD-Enzym Gluconolacton + FADH 2 -Enzym FADH 2 -Enzym + O 2 FAD-Enzym + H 2 O 2 H 2 O 2 + farbloses Chromogen 2 H 2 O + Farbstoff FAD = Flavin-Adenin-Dinukleotid (kurz FAD) ist ein Co-Enzym = wird von der Glucoseoxidase als Elektronenüberträger verwendet wird

18 Praktikumsbeispiel 3: Blutzucker Bestimmung mittels Glucoseoxidase

19 Glykiertes Hämoglobin zur retrospektiven Abschätzung der Dauer und der Höhe einer Hyperglykämie (HbA1c) Kontinuierliche Anlagerung von Glucose an freie Aminogruppen von Proteinen z.b. Haemoglobin (Hb) von Erythrozyten (freie Diffusion von Glucose in die Zelle). Das Ausmaß der Glykierung wird durch die relative Konzentration der Reaktionspartner Haemoglobin/Glucose bestimmt. Es entsteht durch die Anlagerung von Glucose an das Haemoglobin (über die Lebensdauer eines Erytrocyten, ca. 120 Tage) eine Mischung aus unterschiedlich glykierter Haemoglobine, welche durch Fraktionierung unterteilt werden können HbA1c = Fraktion, bei gesunden Menschen 4-6%, bezogen auf das Gesamthaemoglobin Bei Diabetiker: Hyperglykämie und dadurch höhere Glykierung von HbA1c d.h. der HbA1c Wert spiegelt einen langfristigen hyperglykämische Zustand am besten wieder