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1 Stichworte zu Inhalten API (atmospheric pressure ionisation) Methoden Ionisierung aus Lösungen ESI (electrospray ionisation) und APCI (atmospheric pressure chemical ionisation) ESI: Spray + Hochsp. > geladene Tropfen verdampfen > geladene Teilchen Bildung von Pseudomolekülionen (Adduktionen) aus polaren Substanzen [M+H] +, [M+Kationen] +, [M-H] -, [M+Anionen] - (vgl. CI, FAB, MALDI) einfache Ladungsübertragung bei niedrigen Molekulargewichten z. B.: Molekül (M) + H + [M + H] + ; bei hohen Konzentrationen auch Selbstaddukte [2M + H] + multiple Ladungsübertragung bei höheren Molekulargewichten (> 1000) z. B.: Peptid (M) + n i H + [M + n i H] n i + Serien höher geladener Ionen (m/z) i im m/z-bereich Dekonvolution von ESI-Spektren: 1. n 1 = [(m/z) 2 - M H]/[(m/z) 1 - (m/z) 2], 2. M U = n 1(m/z) 1 - n 1M H APCI: wie ESI, aber Spray beheizt + Ladungsträger aus Coronaentladung Bildung von Pseudomolekülionen (s. o.) aus unpolaren Substanzen geringere Tendenz zur Bildung mehrfach geladener Ionen, als bei ESI APCI liefert teilweise auch Fragmentionen ESI: Analyse von polaren Substanzen in polaren (protischen) Lösungsmitteln APCI: Analyse von unpolaren Subst. in unpolaren (aprotischen) Lösungsmitteln wie bei CI, FAB, MALDI wenig keine Fragmente, daher kaum Strukturinformation Fragmentierung durch CID (collision induced decomposition) möglich a) induziert durch Stöße mit dem Restgas in der Vorvakuumstufe der API-Quelle source-cid b) bei MS/MS-Experimenten Fragmenierung in der CID-Zelle von Tandemmassenspektrometern (MS1: Precursorionen > CID > MS2: Produktionenspektrum) oder bei MS/MS in Ionenfallen (MS n )

2 3.7 Atmospheric Pressure Ionisation (ESI und APCI) Die Elektrosprayionisation, ESI ist eine weitere weiche Ionisierungsmethode, bei der Ionen der Analyten aus Lösungen außerhalb des Massenspektrometer-Hochvakuums gebildet und in die Gasphase überführt werden. Derartige, bei Atmosphärendruck ionisierende Verfahren werden zusammenfassend als API-Methoden (atmospheric pressure ionisation) bezeichnet, von denen ESI und atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) derzeit die wichtigsten sind. In API-Quellen werden sehr verdünnte Lösungen der Analyten ( molar) aus einer elektrisch geladenen Kapillare versprüht, so dass die mikrokopisch kleinen Tropfen des Sprays eine berflächenladung erhalten. Im Spray verdampft das Lösemittel und sobald die dadurch zunehmende elektrostatische Abstoßung auf der Tropfenoberfläche die Größe der berflächenspannung, die den Tropfen zusammenhält, erreicht (Rayleigh limit), beginnt der Tropfen in kleinere zu zerfallen. Dieser Vorgang, bei dem Mikrotropfen und geladene Moleküle aus der Tropfenoberfläche austreten, wiederholt sich kaskadenartig vielmals, bis geladene, desolvatisierte Addukte aus Ionen und Molekülen übrig bleiben. Atmosperic-Pressure-Ionisationsmethoden: ESI, APCI Elektrospray-Quelle (beispielhaft, es gibt verschiedene Ausführungen) Eigenschaften ESI [M+H] +, [M-H] -, evtl. [2M+H] + von HPLC etc. Flow: nl - 1 ml/min Atmosphärendruck kv Spray- "Plume" Sheath- Gas geladene Tropfen Vorvakuum Ionen MS-Hochvakuum Ionen Alkalimetall u. a. Addukte [M+a] +, [M+K] +, [M+Cl] - Serien hochgeladener Ionen [M+nH] n+, [M-nH] - bei hohem Molekulargewicht Besonders geeignet für polare Substanzen APCI-Quelle Eigenschaften APCI von HPLC etc. Flow: - 2 ml/min Atmosphärendruck beheizt kv C Spray- "Plume" Sheath- Gas zusätzliche Corona-Entladung Vorvakuum Ionen MS-Hochvakuum Ionen Eluent bildet CI-Plasma Ionisiert auch unpolare Substanzen, die in ESI keine Ionen liefern besser geeignet für höhere HPLC-Flußrate Die Elektrosprayionisierung kann bei bei sehr niedrigem Eluentenfluss besonders effizient sein (sehr geringer Substanzverbrauch bei Mikro-ESI, flow größenordnungsmäßig 100 nl/min und ano-esi, flow größenordnungsmäßig 10 nl/min). Das Spray wird dabei ohne zusätzliches Spraygas durch die Hochspannung zwischen Spraykapillare und Einlass in die 1. Vakuumstufe des Massenspektrometers erzeugt. Auf dem Foto ist die Ausbildung des Sprays (Taylor cone) unter diesen Bedingungen zu erkennen. 31

3 Bei Eluentenflussraten oberhalb ca. 2 µl/min wird die Bildung eines stabilen Sprays durch einen Stickstoffstrom unterstützt (Sheath-Gas, ebulizer-gas, pneumatically assisted ESI). Hohe Eluentenflussraten (> 200 µl/min) wirken sich oft negativ auf die Signalintensität aus. Bei APCI wird das Spray-Aerosol durch einen starken Sheath-Gasstrom aus dem Eluenten erzeugt und die Verdampfung des Eluenten im Aerosol durch eine hohe Temperatur des Sprayers beschleunigt. Es können wässrige bis apolar organische Lösungsmittel bei Flüssen bis 2 ml/min eingesetzt werden. Eine Coronaentladung ionisiert das Gasgemisch in der Ionenquelle, wobei aus Molekülen des Eluenten Reaktantgasionen entstehen. Wie bei der chemischen Ionisation bildet sich ein CI-Plasma, das Ladungträger zur Ionisierung der Analysensubstanzen durch Ionen-Molekül-Reaktionen zur Verfügung stellt. Die Chemie der Spray-Ionisierungsmethoden wird stark durch Säure-Base-Reaktionen gesteuert. Basische Substanzen bilden leicht positive Ionen, haupsächlich [M+H] + sowie Kationenaddukte [M+a] +, [M+K] + aber keine negativen Ionen. Säuren spalten leicht Protonen zu [M-H] - ab und neigen zur Anlagerung von Anionen z. B. [M+Cl] -, [M+CF 3 C 2 ] -. Elektronegative Substituenten (itrogruppen, Halogene), wie z. B. bei 2,4-Dinitrophenyl-, Pentafluorbenzyl- oder Perfluoralkanoylderivaten begünstigen die Bildung negativer Ionen und können die Bildung positiver Ionen vollständig unterdrücken. Wie bei der chemischen Ionisation diskutiert, sind Protonen- und Elektronenaffinität einer Substanz die thermodynamischen Größen, die ihre Ionisierbarkeit wesentlich beeinflussen. Viele Substanzen, die weder eindeutig als basich oder sauer einzustufen sind (bzw. auch amphotere Substanzen) können sowohl positive als auch negative Ionen liefern. Dabei kann die Effizienz der Ionisierung durch den ph-wert der Lösung beeinflusst werden. Die Anzahl übertragener Ladungen hängt bei ESI von der Molekülgröße (Molekulargewicht) und der Anzahl saurer oder basischer Zentren des Moleküls ab. Kleine Moleküle ergeben einfach geladene Ionen, wie das tertiäre Amin im unten abgebildeten ESI-Spektrum. Pridinoltest002 # 1-39 RT: AV: 39 L: 1.23E7 T: + c ESI Full ms [ ] H + H H + H 2 CH 3 S m/z

4 Die Substanz wurde als Methansulfonat in 1 millimolarer Lösung (Acetonitril/Wasser 70/30) mit einem Fluß von 10 µl/min in den Sprayer dosiert. Bei dieser sehr hohen Konzentration tritt neben [M+H] + m/z 296 auch ein Addukt, m/z 687 des [M+H] + an das ungeladene Salz (M+CH 3 S 3 H) auf. Bei höheren Molekulargewichten (ab ca. > 1000 amu) werden leicht mehrere Ladungen übertragen, wie das ESI-Spektrum des cyclischen Decapeptids Gramicidin S zeigt (die Strukturformel ist hier ohne addierte Protonen und Ladung dargestellt). gramicidin # 3-23 RT: AV: 21 L: 2.95E6 T: + c ESI Full ms [ ] H Relative Abundance H m/z In einer Konzentration von 4 pmol/ul in Methanol/Wasser 1/1 (entsprechend ca. 4 µmolar) mit einem Fluß von 20 µl/min gemessen, ergibt Gramicidin S hauptsächlich ein doppelt geladenes [M+2H] 2+ Ion, m/z 571,3 sowie das einfach protonierte [M+H] +, m/z 1141,6. Unter APCI-Bedingungen werden weniger leicht mehrere Ladungen übertragen, so dass bei dieser Substanz dann [M+H] + intensiver ist, als [M+2H] 2+. Die Tendenz, mehrere Ladungen zu übernehmen, steigt mit höheren Molekulargewichten bei ESI so sehr an, dass dann einfach geladene Ionen nicht mehr auftreten, sondern Serien vielfach geladener Ionen beobachtet werden. Proteine liefern so [M+nH] n+ Ionenserien, deren m/z-werte sich um eine Protonenmasse und eine positive Ladung unterscheiden; ligonucleotide als Polyanionen entsprechend [M-nH] n- Ionenserien, deren m/z-werte pro zusätzlicher Ladung eine Protonenmasse weniger aufweisen. Da Massenspektren auf einer m/z Skala (Masse pro Ladung) basieren, liegen höher geladene Ionen bei niedrigeren m/z- Werten als geringer geladene. Um aus diesen Ionenserien die Information über das Molekulargewicht der untersuchten Substanz zu gewinnen, muss die Anzahl der Ladungen und damit gleichzeitig die Anzahl der aufgenommenen oder abgegebenen Protonen aus den Massenspektren bestimmt werden (Dekonvolution der Spektren). eben den gemessenen m/z-werten steht dazu eine weitere Information aus den Spektren zur Verfügung: Benachbarte Peaks einer Serie unterscheiden sich durch eine Ladung und eine Protonenmasse. 33

5 sftryps07 #3-94 RT: 0,47-9,76 AV: 73 L: 2,72E4 T: + c ESI Full ms [ 500,00-00,00] ,3 2117, , , ,0 1144, ,2 1374,4 1554,7 2329, m/z 34

6 Dekonvolution von Elektrospray-Massenspektren Betrachte benachbarte n-fach protonierte, n-fach geladene Ionen (m/z) einer Substanz der unbekannten Masse M U, die sich um ein Proton (M H ) und eine Ladung (z = n 1, n 1 + 1) unterscheiden: Dann gilt für benachbarte Signale (m/z) 1 > (m/z) 2 der Ionenserie: (m/z) 1 = [M U + n 1 M H ]/n 1 (1) (m/z) 2 = [M U + (n 1 + 1)M H ]/(n 1 + 1) (2) M U = n 1 (m/z) 1 - n 1 M H (1a) M U = (n 1 + 1)(m/z) 2 - (n 1 + 1)M H (2a) Daraus folgt n 1 (1a = 2a), n 1 (m/z) 1 - n 1 M H = n 1 (m/z) 2 + (m/z) 2 - n 1 M H - M H (3) n 1 = [(m/z) 2 - M H ]/[(m/z) 1 - (m/z) 2 ] (4) so dass die unbekannte Masse M U bestimmt werden kann. Bei iederauflösungsmessungen kann mit M H = 1 gerechnet werden. Bei Hochauflösungsmessungen muss die exakte Masse des Protons (nicht des Wasserstoffatoms) für M H eingesetzt werden. Beispiel: ESI-MS von Rinderpankreas-Trypsin Eine Lösung von ca. 10 pmol/µl Rinderpankreas-Trypsin (entspricht 10 µmolar, 10 µm) in Methanol/Wasser (1/1) wurde bei einem Fluß von 20 µl/min mit einer Spritzenpumpe in den ESI-Sprayer des Massenspektrometers dosiert. Im Spektrum (vgl. S. 34) gehören die Ionen m/z 1664,4 bis 2329,4 einer Serie [M+nH] n+ an, daneben liegen noch Signale anderer Substanzen vor. Die Auswertung nach Gl. (4) und (1a) ergibt 23284,9 als Molekulargewicht. Auswertung: (m/z) 1 > (m/z) 2 M U = n 1 (m/z) 1 - n 1 M H n 1 = [(m/z) 2 - M H ]/[(m/z) 1 - (m/z) 2 ] Gemessene Massen (m/z) (m/z) 1 (m/z) 2 n 1ber n 1 M U 2329,4 2117,6 9, ,0 2117,6 1941,3 11, ,6 1941,3 1792,3 12, ,6 1792,3 1664,4 13, ,9 1664,4 1554,7 14, ,6 M.W ,9 Stabw 2,2 d. h. gemessenes Molekulargewicht: 23284,9 ± 2,2 amu

7 Ionenserien anderer Art werden in den Elektrospray-Massenspektren von ligomerengemischen beobachtet. Dabei gehört jedes auftretende Pseudomolekülion zu einer Substanz der homologen Reihe, die das Gemisch bildet. Die Anzahl der Ladungen ist für alle Ionen einer solchen homologen Reihe gleich und die Massen unterscheiden sich um die Masse jeweils einer monomeren Einheit des ligomers. Das ESI-Spektrum negativer Ionen von synthetischem Polypropylenglycolsulfat zeigt zwei solche Ionenserien (vgl. Spektrum S. ). Im Massenbereich m/z 7 bis m/z 1490 haben die Signale der einen Serie einen Massenabstand von m/z 58. Im Bereich zwischen m/z 378 und 755 liegt die zweite Serie mit einem Massenabstand von m/z 29 zwischen aufeinander folgenden Peaks. Polypropylenglycol hat die Zusammensetzung H-[C 3 H 6 ] n -H (in Massen ausgedrückt ist das 17-[58] n -1) und bei der Veresterung mit Schwefelsäure bilden sich sowohl Monosulfate H-[C 3 H 6 ] n -S 3 H, als auch Disulfate H 3 S-[C 3 H 6 ] n -S 3 H. Der Abstand von m/z 58 in der einen Serie negativer Ionen beruht offensichtlich auf einfach geladenen Anionen der Monosulfate, während der Abstand von m/z 29 (= 58/2) in der anderen Serie offensichtlich auf zweifach negative Anionen der Disulfate zurückzuführen ist. Wie die Rechnung durch Einsetzen der Massen ergibt (wegen des großen n ist bei der monomeren Einheit eine Genauigkeit von zwei achkommastellen erforderlich, für H und S 3 genügen nominelle Massen), liefern Monosulfatanionen [H-[C 3 H 6 ] n -S 3 ] - m/z für n von 11 24, während Disulfatanionen [ 3 S-[C 3 H 6 ] n -S 3 ] 2- zu m/z für n von führen. Monosulfatanionen: [H-[C 3 H 6 ] n -S 3 ] - m/z = 17 + [58,04 x n] +80 n = 11 > m/z 7 n = 24 > m/z 1490 Disulfatanionen: [ 3 S-[C 3 H 6 ] n -S 3 ] 2- m/z = (96 + [58,04 x n] +80)/2 n = 10 > m/z 378 n = 23 > m/z

8 523, , , ,3 610, ,3 639,3 909,4 967,7 1025, ,2 668,3 851,4 1083,7 1141, ,4 1026,7 668,8 968,7 1084,7 910,4 1199,6 697,3 697,8 852,4 1142, ,3 407,2 1027,7 1257,6 794,4 969,6 1085,6 911,5 1258,7 755,3 1315,6 853,4 1201,7 378,2 795,4 970,6 1028,6 1259,6 1373,5 1086,6 912,5 1144,7 1260,7 1431,5 369,2 813,9 854,4 1202,7 1318,6 1490,7 1376, m/z 37