Analytical Services Dr. Ralph Nussbaum

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1 Analytical Services Dr. Ralph Nussbaum Medizintechnisches Zentrum Pauwelsstrasse 19 D Aachen Tel.: Fax:

2 Definition von Verunreinigung und Abbauprodukt Welche Richtlinien gibt es? (FDA, ICH, EMEA etc.) Auswahl geeigneter analytischer Methoden 2

3 Definition von Verunreinigung Ein Bestandteil des Wirkstoffs oder des Fertigarzneimittels, der chemisch nicht dem Wirkstoff, Hilfsstoff oder einem anderen Zusatzstoff entspricht. 3

4 Definition von Abbauprodukt Ein Molekül, das sich z.b. durch Veränderung des Wirkstoffs während der Lagerung bildet (z.b. Deamidierung, Oxidation, Aggregation, Proteolyse, etc.) 4

5 ICH Guidelines zu Verunreinigungen Q3A (R2): Impurities in new drug substances Q3B (R2): Impurities in new drug products Q3C (R3): Guideline for residual solvents Q6A: Specifications: test procedures and acceptance criteria for new drug substances and new drug products: chemical substances 5

6 Q3A (R2): Verunreinigungen im Wirkstoff Maximale Tagesdosis Anzugebender Wert (= reporting value ) Grenzwert Identifizierungs- Qualifizierungs- Grenzwert < 2g/Tag 0.05% 0.10% oder 1.0 mg pro täglicher Einnahme (der tiefere Wert zählt) 0.15% oder 1.0 mg pro täglicher Einnahme (der tiefere Wert zählt) > 2g/Tag 0.03% 0.05% 0.05% 6

7 Gebrauch chromatographischer Techniken bei der Untersuchung von Verunreinigungen CE 18% HPTLC 9% GC 7% HPLC 53% MEKC 3% LC/MS 8% GC/MS 2% 7

8 Beispiel: Chargenvergleich Fluoxetin Hydrochlorid (Ph. Eur.) H N H O F F F Strukturformel Fluoxetin (Antidepressivum) 8

9 HPLC-Chromatogramm: Fluoxetin A) Originalpräparat, B) Wirkstoff aus Italien, C, D) Wirkstoff aus Indien 9

10 EMEA-Guideline CHMP/QWP/251344/2006 Guideline on the limits of genotoxic impurities 10

11 CHMP-Guideline: Genotoxische Verunreinigungen Genotoxische Verbindungen schädigen die DNA bei geringster Konzentration Keine Grenzwertbetrachtung möglich, sondern Risikobewertung Einführung des Threshold of toxicological concern (TCC) 11

12 TTC: Wurde auf 1.5 µg/person/tag festgelegt Basiert auf Daten aus 343 untersuchten Carcinogenen Wahrscheinlichkeit der carcinogenen Potenz < 10-6 beim TTC- Wert 12

13 Gentoxische Verunreinigungen - Entscheidungsbaum: 13

14 Beispiele für genotoxische Verunreinigungen Alkylierende Substanzen: - Alkylhalogenide - Alkylsulfonate - Dialkylsulfate - Epoxide - Aziridine Reaktive Amine: - Aniline - N-Nitroso-Verbindungen Kondensierte Tryicyclen: - DNA-intercalierende Substanzen, z.b. Benzpyrene 14

15 Beispiele für genotoxische Verunreinigungen Substituierte Purine und Pyrimidine: - Einbau in die DNA Hydroperoxide: - Oxidative Schädigung der DNA 15

16 Genotoxische Verunreinigungen als Synthesenebenprodukt z.b. Hydrochloridfällung in Ethanol o. Isopropanol R OH HCl R Cl Alkylierungsmittel! 16

17 Konzentrationsbereiche Prozent [g/100g] ppm [mg/kg] ppb [mg/t] 17

18 Analytische Herausforderungen -Spezifikationsgrenzen von ppm für genotox. VUs gegenüber ppm (0.05% %) für nicht-genotox. VUs -Zeit- und kostenaufwändige Entwicklung speziell zugeschnittener Methoden (z.b. 3 genotox. VUs in einer Syntheseroute 3 Analysenmethoden -Einsatz komplexer Probenvorbereitungen und Analytik -Validierung und Transfer analytischer Methoden (Akeptanzkriterien, Geräteparameter) -Verfügbarkeit von Referenzstandards -Reaktivität der genotox. VUs -Methodenempfindlichkeit und Verschleppung -Fokus auf Empfindlichkeit, nicht auf Trennleistung 18

19 Geeignete analytische Methoden (Top 3) GC-MS - Leichtflüchtige Komponenten - Massendetektion: 50 < m/z < Detektion im SIM (single ion monitoring) mode erhöht Empfindlichkeit und blendet Matrixpeaks aus - Spezielle Techniken wie Headspace-GC-MS, Purge and Trap oder SPME (solid phase micro extraction) erhöhen Empfindlichkeit 19

20 Viracept-Fall: Ethyl-Methansulfonat (EMS) als genotoxische Verunreinigung im Viracept (Nelfinavir) H 3 C O O S O CH

21 GC-Methode zur Bestimmung von EMS und MMS GC: ThermoQuest Trace GC 2000 Detektor: MS Finnigan PolarisQ Ionisation: EI (MMS und EMS) Detektion CI: MMS: m/z = EMS: m/z =

22 TIC MMS (SIM; 10 ppb) EMS (SIM; 10 ppb) 22

23 Geeignete analytische Methoden (Top 3) GC-ECD oder GC-TAE - GC-ECD: Electron Capture Detector, sehr empfindlich bei halogenierten Verbindungen - GC-TAE: Thermal Energy Analyzer, hochempfindlich für Nitrosamine 23

24 24

25 Geeignete Analytische Methoden (Top 3) LC-MS - Schwerflüchtige, polare Komponenten - Massendetektion: 150 < m/z < Detektion im SIR (selected ion recording, LC-MS) oder SIM (selected ion monitoring, LC-MSMS) mode erhöht Empfindlichkeit und blendet Matrixpeaks aus - Spezielle Ionisierungstechniken (ESI, APCI) erhöhen je nach Molekülart die Empfindlichkeit 25

26 HPLC-UV-Chromatogramm ESI-MS (SIR-Mode; 1 ppm) 26

27 Nicht geeignete analytische Methoden (zu geringe Empfindlichkeit) - NMR - HPLC-UV - -GC-WLD oder GC-FID 27

28 Schema einer Kopplung der HPLC an die Massenspektrometrie Hinweis: Zwischen Trennsäule und Ionenquelle kann auch ein weiterer HPLC-Detektor installiert sein. HPLC Analysator Ionenquelle MS- Detektor PC Säule 28

29 Ionenquellen a) ESI (Elektrospray-Ionisation) wird für polarisierbare Substanzen eingesetzt, die in der entsprechenden Lösung Ionen ausbilden können (klassisches Anwendungsgebiet: Peptide). Mehrfach geladene Ionen können evtl. erzeugt werden. Somit können z.b. auch größere Peptide analysiert werden. 29

30 Tropfen mit Ionen Lösungsmittel verdampft im Vakuum, Ionen bewegen sich an die Oberfläche, elektrische Feldstärke nimmt zu Ab einer kritischen elektrischen Feldstärke zerplatzt der Tropfen, Ionen werden emittiert. Ionen gelangen ohne Lösungsmittel ins MS Das Effluat wird versprüht und die Tröpfchen dann getrocknet, so dass nackte Ionen des Analyten zurückbleiben. 30

31 b) APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) Funktioniert ähnlich wie ESI. Die Methode ist für weniger polare Analyten geeignet. Die Lösung des Analyten wird vor der Ionisation verdampft. Die Moleküle werden an einer spitzen Elektrode (corona needle) bei Atmosphärendruck ionisiert. Abbildung von Agilent 31

32 Sinnvolles Vorgehen bei der Untersuchungen mit HPLC-MS 1) Ionisierungsparameter anhand der zu untersuchenden Substanz (oder an vergleichbaren Substanzen) durch Direktinjektion optimieren. 2) Feststellen, welcher Ionisierungsmodus sinnvoll ist (positiver oder negativer Ionisierungsmodus). 3) HPLC-MS-Methode entwickeln. Achtung: Bei negativem Ionisierungsmodus sollten keine sauren Eluenten verwendet werden. 32

33 Kopplung der HPLC an die Massenspektrometrie Hinweise zur Methodenentwicklung / -optimierung Die Methodenentwicklung in Bezug auf die Trennung kann auch mit anderen Detektoren durchgeführt werden Als Eluenten dürfen nur vollständig verdampfbare Stoffe verwendet werden; d.h. keine Phosphat- oder Citratpuffer!!! Mögliche Pufferzusätze sind z.b. Ammoniumacetat, Ammoniumformiat, Ammoniumcarbonat. Zum Ansäuern werden in der Regel Essig-, Ameisen- oder Trifluoressigsäure verwendet. Zum Alkalisieren kann auch Ammoniaklösung verwendet werden (Triethylamin ergibt oftmals ein stärkeres Rauschen!) Nur hochreine Lösungsmittel (HPLC-MS-Qualität!) verwenden. Tipp: Bei der Entwicklung einer neuen HPLC-Methode möglichst von Anfang an auf eine MS-Fähigkeit achten 33

34 Möglichkeiten zur quantitativen Auswertung TIC = Total ion count: Alle Intensitäten der Ionen werden addiert ; Achtung: Nicht immer sind die zu untersuchenden Komponenten auch im TIC zu erkennen (gilt v. a. für Impurities). SIM = Selected Ion Monitoring: Es werden während der Messung nur bestimmte Ionen analysiert. D.h. deutlich besseres Signal- Rausch-Verhältnis; störende Ionen werden ausgeblendet. Die SIM-Parameter werden vor der Analyse festgelegt. EIC = Extracted Ion Chromatogram: Von einem TIC-Chromatogramm werden nur bestimmte Ionenspuren analysiert. D.h. deutlich besseres Signal-Rausch-Verhältnis; störende Ionen werden ausgeblendet. Die Ionenspuren können auch nach der Analyse definiert werden. 34

35 Prinzipielle Vorteile der HPLC-MS Man erhält Informationen über (a) die Molmasse (b) evtl. strukturelle Informationen z.b. Wasserabspaltung -OH-Gruppen Ammoniakabspaltung -NH 2 -Gruppen CO 2 -Abspaltung -COOH-Gruppen Im Vergleich zur Direktinjektion ins MS werden die Substanzen vorher chromatographisch getrennt. Impurities können in Anwesenheit der Hauptkomponente analysiert werden. Achtung: Eine absolute Strukturaufklärung (z.b. Chiralität, Konfiguration) ist mittels HPLC-MS nicht möglich! 35

36 5 Komp.1: Signal in APCI positiv : Signal in APCI negativ 3: Signal in APCI negativ 4: Signal in APCI negativ 5: Signal in APCI negativ, APCI positiv, ESI positiv Abbildung modifiziert nach R.J. Smith, M.L. Webb. Analysis of Drug Impurities Achtung: Bei der Strukturaufklärung von Impurities mittels HPLC-MS ist eine gleichzeitige Aufnahme des UV-Chromatogramms für die Peakzuordnung sehr hilfreich. 36

37 Anwendung von GC-MS GC-MS kann bei der Strukturaufklärung von flüchtigen Verunreinigungen eingesetzt werden. Nicht flüchtige Verunreinigungen sollten besser mit HPLC-MS analysiert werden. aus URL e/dioxin/dioxininformation.html 37

38 Ionisierungsmethoden Elektronenstoss-Ionisation (Electron impact ionization, EI) Meist verwendete Ionisierungstechnik in der GC-MS Ein Elektronenstrahl wird durch die im Hochvakuum verdampfte Probe geschickt. Bei der Kollision der Probenmoleküle mit den Elektronen werden aus den neutralen Molekülen Elektronen herausgeschlagen. Ionisierung der Moleküle zu Radikalkationen Diese Radikalkationen können je nach ihrer Stabilität und abhängig von der Energie der Elektronen weiter zerfallen und Fragmentionen bilden. Verwendung einer genau definierte Elektronenenergie (meist 70 ev) führt zu reproduzierbaren Fragmentmustern / Massenspektren. Bei niedrigerer Energie treten bevorzugt Molekülionen auf. 38

39 Ionisierungsmethoden Chemische Ionisation (CI) Die chemische Ionisation (CI) erzeugt ionisierte Probenmoleküle durch Transfer von Protonen von einem Reaktandgas auf die Probe (oder Protonentransfer von Probe auf Reaktandgas). Reaktandgase: Methan, Isobutan, Ammoniak. Die entstehenden Probenmoleküle sind Pseudomolekülionen [MH] + (im Gegensatz zu M + bei der EI). Die mittels CI gebildeten Ionen haben eine geringere Überschussenergie und fragmentieren dadurch weniger (sanftere Ionisierungsmethode). Bei der chemischen Ionisation können auch negative Ionen entstehen, die man durch Umpolen der Spannungen in der Ionenquelle detektieren kann (negative chemische Ionisation, NCI). 39

40 Ionisierungsmethoden Chemische Ionisation (CI) Beispielhaftes Reaktionsschema bei der CI (Reaktandgas Methan): CH 4+ + CH 4 CH 5+ + CH 3 Ionisierungsreaktionen des Methan CH 3+ + CH 4 C 2 H 5+ + H 2 CH 5+ + XH CH 4 + XH + 2 Protonenübertragung C 2 H 5+ + XH C 2 H 4 + XH + 2 Protonenübertragung C 2 H 5+ + XH C 2 H 6 + X + Hydridübertragung Ionisierung des Reaktandgases erfolgt in der Ionisierungskammer bei etwas 1 Torr. 40

41 Möglichkeiten zur Auswertung TIC = Total ion count: Alle Intensitäten der Ionen werden addiert ; SIM = Selected Ion Monitoring: Es werden während der Messung nur bestimmte Ionen analysiert. D.h. deutlich besseres Signal- Rausch-Verhältnis; störende Ionen werden ausgeblendet. Die SIM-Parameter werden vor der Analyse festgelegt. Für die Strukturaufklärung ist der TIC-Mode geeignet, da sich nur aus diesem Modus aussagekräftige Massenspektren ableiten lassen. Für die Quantifizierung ist der SIM-Modus besser geeignet. 41

42 Hauptanwendungen der GC-MS im Bereich der Impurities GC-MS wird weniger zu einer konkreten Strukturaufklärung komplexerer Moleküle verwendet. Meist Einsatz zur Identifizierung (flüchtiger) oftmals bereits bekannter Komponenten. Da von den bekannten Komponenten meist Standards existieren, kann die Identifizierung mittels Vergleiches der Retentionszeiten und der Massenspektren erfolgen. 42

43 Hauptanwendungen der GC-MS im Bereich der Impurities Bestimmung von Lösungsmitteln (Alkohole, Säuren, Ether, Ester, Ketone, Alkane etc.) Bestimmung von einfacheren Aminen (z.b. Trimethylamin) Bestimmung von möglichen Begleitkomponenten von organischen Säuren (z.b. Ester), die in der pharmazeutischen Industrie als Salzbildner eingesetzt werden. 43

44 Zusammenfassung (1) -Die Analytik ist nicht trivial und muss immer case-by-case produktspezifisch entwickelt werden - Prozessdaten (Synthese, potentielle Nebenprodukte etc.) müssen in die Überlegungen zur Identifizierung einbezogen werden - Die Quantifizierung erfordert den Einsatz komplexer Probenvorbereitungen und Analysentechniken 44

45 Zusammenfassung (2) Identifizierung Strukturaufklärung, GC-MS, LC-MSMS Quantifizierung GC-MS, LC-MSMS Qualifizierung Toxikologische Bewertung 45

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