Inhibition der nicht-enzymatischen Bräunung in Lebensmitteln

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1 Inhibition der nicht-enzymatischen Bräunung in Lebensmitteln Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten Der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Zur Erlangung des Doktorgrades Vorgelegt von Taleb Khider Aus Syrien

2 Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung : 17 Dezember 2007 Vorsitzender der Prüfungskommission: Erstberichterstatter: Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Prof. Dr. Monika Pischetsrieder Prof. Dr. Ing. Heike Dörnenburg

3 Danksagung Allen voran ergeht mein herzlichster Dank an meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. Monika Pischetsrieder für die Aufnahme in Ihre Arbeitgruppe, die engagierte Betreuung der Arbeit und die wissenschaftliche und persönliche Unterstützung in den Jahren der Promotion. Besonders bedanken möchte ich mich auch für die finanzielle Unterstützung im letzten Jahr sowie die Unterstützung bei den Stipendienanträgen. Mein Dank gilt weiterhin Frau Prof. Heike Dörnenburg für die Übernahme des Gutachtens meiner Arbeit sowie Herrn Prof. Dr. Dr. Rudi Van Eldik für die Prüfung im Nebenfach im Bereich Analytische Chemie und Herrn Prof. Dr. Peter Gmeiner für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes. Für ihre Freundschaft und allgemeine Hilfsbereitschaft möchte ich mich bei meinen Kolleginnen und Kollegen bedanken. Schließlich sei noch ein ganz besonderes Dankeschön an meinen Eltern ausgesprochen, ohne die ich wohl meine gesamte bisherige akademische Laufbahn nicht in diesem Maße hätte verwirklichen können. Außerdem danke ich dem Hochschulministerium der Syrisch Arabischen Republik, mit deren Unterstützung die Durchführung dieser Arbeit hier in Deutschland erst ermöglicht wurde. Taleb Khider

4 Für meine Eltern

5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis...5 Verwendete Abkürzungen und Formeln...9 Ein- und Drei-Buchstabencode der proteinogenen Aminosäuren Bräunungsreaktionen Die enzymatische Bräunung Die nicht-enzymatische Bräunung Bedeutung der nicht-enzymatische Bräunung in Lebensmitteln Inhibition der nicht-enzymatischen Bräunung in Lebensmitteln Bedeutung von AGEs in der Medizin AGE-Inhibitoren in der Medizin Typ A: Substanzen, die Aminogruppen der Aminosäuren inaktivieren (Zuckerkonkurrenten) Typ B: Substanzen, die freie Carbonylgruppen blockieren Typ C: Metallchelatbildende Verbindungen Typ D: Dicarbonylfänger Typ E: Inhibition des Abbaus von Amadori-Produkten Typ F: Spaltung von Quervernetzungsprodukten Zu Zeit verfügbare chemische AGE-Inhibitoren Aminoguanidin Carnosin Tenilsetam OPB Pyridoxamin Ziel der Arbeit Inhibition der Maillard-Reaktion in Lebensmitteln Inhibition der Bräunung eines Lactose-Lysin-Modellsystems Einfluss des Inhibitorzusatzes auf den ph-wert der Proben Inhibition der CML-Bildung in einem Lactose-Lysin-Modellsystem Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Inhibition der Maillard-Reaktion von Lactose mit β-casein Eigenschaften des β-casein Bestimmung von CML in β-casein-lactose Maillard-Reaktionsmischung mittels kompetitivem ELISA CML-β-Casein Bestimmung mittels einer nicht-kompetitiver ELISA-Methode...42 Prinzip des nicht-kompetitive ELISAs

6 Inhatsverzeichnis 4.4. Untersuchung einer möglichen Kreuzreaktion des CML-Antikörpers mit β-casein Sulfit-Addukten Inhibition der Imidazolon-Bildung in Lactose-β-Casein-Maillardmischungen Imidazolonbestimmung Untersuchung der β-casein-lactose Maillard-Mischung mittels MALDI-TOF- MS Prinzip der MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS Massungen des nativen β-caseins nach partieller enzymatischer Hydrolyse Theoretisch zu erwartende Peptidfragmente des mit Lactose erhitzten β-caseins MALDI-TOF-MS-Analysen des nativen und glykierten β-caseins nach partieller enzymatischer Hydrolyse MALDI-TOF-MS-Analyse von intaktem nativem und glykiertem β-casein Einfluss der Reaktionsbedingung auf den Lactose-induzierten Abbau von β-casein Einfluss der Temperatur und der Erhitzungsdauer auf den Proteinabbau in Anwesenheit des Zuckers Einfluss der Zuckerart auf den Proteinabbau von glykiertem β-casein Untersuchung zur Stabilität anderer Protein-Zucker- Modellsysteme Zusammenfassung und Diskussion Inhibition der Maillard-Reaktion in einer erhitzten Lactose-Pepton-Mischung Einleitung Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Bräunung einer Lactose-Pepton-Mischung Einfluss des Inhibitorzusatzes und der AGE-Bildung auf die ph-werte der Lösungen Inhibition der CML-Bildung in einer erhitzten Lactose- Pepton-Mischung Inhibition der Bildung von fluoreszierenden Produkten in erhitzten Lactose- Pepton-Mischungen Inhibition der Lactulosylaminbildung in einer erhitzten Lactose- Pepton- Mischung Lactulosylaminbestimmung Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Lactulosylamin-konzentrationen in der erhitzten Lactose-Pepton-Mischung Statistische Bewertung der Ergebnisse Anwendung des GLM-Verfahrens Duncan-Gruppierung der Testsubstanzen bezogen auf ihre Fähigkeit, verschiedene Parameter der Maillard-Reaktion zu inhibieren Korrelation zwischen den Faktoren Bräunung, Bildung von CML, fluoreszierenden Maillard-Produkten und Lactulosylamin Zusammenfassung und Diskussion Inhibition der Maillard-Reaktion in Milch Inhibition der Bräunung in Magermilch Photometrische Bestimmung der Bräunung in rekonstruierter Magermilch

7 Inhaltsverzeichnis Einfluss der Erhitzung und des Inhibitorzusatzes auf den ph Wert der Proben Faktoren, die die Phasentrennung verschiedener Milchproben beeinflussen Einfluss des Inhibitorzusatzes...83 Untersuchung von fettarmer Milch (1.5% Fett)...84 Untersuchungen von rekonstruierter Magermilch Einfluss der Pufferkonzentration Einfluss der Inhibitorkonzentration Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Isolierung, Strukturaufklärung und Inhibition der Bildung eines Maillard- Produktes aus einer Lactose-Lysin-Reaktionsmischung Einfluss von Natriummetabisulfit auf Produktspektrum einer Lactose-Lysin Maillard-Mischung Einfluss der Zeit auf die Bildung des Maillard-Produkts Isolierung von 2-Hydroxymethylfuran aus der Reaktionsmischung Identifizierung von 2-Hydroxymethyl-furan durch spektoskopische Methoden Zusammenfassung und Diskussion Experimenteller Teil Chemikalien, Lösungsmittel und Verbrauchsmaterial Chemikalien Lösungsmittel Verbrauchsmaterialien Puffer und Lösungen Geräte- und Analysensysteme Inhibition Der Maillard-Reaktion in Lactose-Lysin-Mischung Inhibition der Bräunung Inhibitoren, die im Modellsystem verwendet wurden Inhibition der CML-Bildung Synthese von AGE-Lactose-Lysin Durchführung des polyklonalen CML-ELISA-Tests Inhibition der Maillard-Reaktion in β-casein-lactose-mischung CML-Bestimmunug der β-casein-lactose Maillard-Produkten mittels kompetitivem ELISA Synthese von AGE-β-Casein Durchführung des kompetitiven ELISA Tests CML-β-Casein-Bestimmung mittels nicht-kompetitivem ELISA Synthese von AGE-β-Casein Durchführung des nicht -kompetitiven ELISA Tests Imidazolonbestimmung mittels ELISA MALDI-TOF-Messung Probenvorbereitung Partielle enzymatische Hydrolyse der glykierten β-casein-proben mit Glu-C MALDI TOF-MS- Analytik von AGE- β-casein Synthese von AGE- α-lactalbumin oder β-lactoglobulin SDS-PAGE

8 Inhatsverzeichnis Das Trenngel Das Sammelgel Elektrodenpuffer Probenpuffer Probenvorbereitung für SDS-PAGE Fixierung / Färbung / Entfärbung Inhibition der Maillar-Reaktion in Lactose-Pepton-Mischung Vorbereitung der Proben Bestimmung von Maillard Produkten Bestimmung der Bräunung Bildung von flureszierenden Produkten Bestimmung der CML-Bildung Bestimmung von Lactulosylamin Inhibition der Bräunung in Milch und Magermilch Inhibition der Bräunung in der Magermilch Inhibition der Bräunung in der Milch Isolierung und Strukturaufklärung eines Lactose-Lysin-Maillard-Produktes Einfluss des Inhibitorzusatzes auf Lactose-Lysin Maillard-produkte Isolierung des 2-Hydroxymethyl-Furans aus der Probe Struktur der aus Lactose-Lysin Maillard-Produkten isolierten Substanz Zusammenfassung der Dissertation Summary Literaturverzeichnis Liste der Testsubstanzen

9 Verwendete Abkürzungen und Formeln Verwendete Abkürzungen und Formeln Ab. Abb. ABS AGE ALT-711 AS Aß BSA CBZ CML COSY CVs Da DAD DETAPAC DHA DTF DTT EDTA ELISA GO HMF HPLC HSA M.R. MALDI MGO Abschnitt Abbildung Absorption Advanced Glycation Endproduct N-phenacyl-4,5-dimethylthiazolium bromide Aminosäure ß-amyloid peptide Bovines Seriumalbumin Carbobenzoxygruppe Schutzgruppe für Aminofunktionen Carboxymethllysin Correlation Spectoscoy Values of the Concentration Dalton Diodenarraydetektor Diethylentetraaminpentaacetic Acid Diethylentetraaminpentaessigsäure Dehydroxy ascorbic acid 1-Deoxy-1-p-Toluidine-D-Fructose Dithiothreitol Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt Enzyme linked immunosorbent assay Enzymgekoppelter Immuntest Glyoxal Hydroxymethylfurfural High performance liquid chromatography Hochleistungsflüssigkeitchromatographie Humanes Serumalbumin Maillard Reaktion Matrix assisted laser desorption/ ionsation Matrix-unterstützte Laserdesorption/ Ionsation Methyglyoxal 9

10 Inhatsverzeichnis MWCO MW NMR NO OLETF OMA PBS Phos ROS RNS StABW TFA TMB TNF-α TOF TP TPP TWEEN 20 Molecular Weight cut off Molekulargewichtsausschluss Mittelwert Nuclear magnetic resonance spectroscopy Kernmagnetresonanz spektroskopie nitric oxide Otsuka-Lang-Evans-Tokushima Fat Oxalic acid monoamide Phosphate buffered saline Phosphatgepufferte Kochsalzlösung Phosphoserinreste reactive oxygen species reactive nitrogen species Standardabweichung Trifluoroacetatic acid Trifluoroessigsäure 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidine Tumor Necrosis Factor-α Time of flight Flugzeit Thiamin- monophosphat Thiaminpyrophosphat Handelsname des nichtionischen Detergenz Polyaa 20 Sorbitan-Monolaurath 10

11 Verwendete Abkürzungen und Formeln Ein- und Drei-Buchstabencode der proteinogenen Aminosäuren A Ala Alanin C Cys Cystein D Asp Asparaginsäure E Glu Glutaminsäure F Phe Phenylalanin G Gly Glycin H His Histidin I Ile Isoleucin K Lys Lysin M Met Methionin N Asn Asparagin P Pro Prolin Q Gln Glutamin R Arg Arginin S Ser Serin T Thr Theonin U Sec Selenocystein V Val Valin W Trp Tryptophan Y Tyr Tyrosin 11

12 Einleitung 1. Bräunungsreaktionen Während der Verarbeitung und der Lagerung von Lebensmitteln treten häufig Bräunungsreaktionen auf. Bei der Herstellung von Gemüseprodukten findet diese Bräunung z.b. durch die mechanische Beschädigung von frischen Ausgangsprodukten statt 1. Die Bräunung hat normalerweise einen negativen Einfluss auf die sensorischen Eigenschaften der Produkte. Neben den Veränderungen in der Farbe verschlechtert sich auch das Aroma und es tritt eine Abnahme der Nährwert des Produkts auf 1-3. Die Bräunung der Lebensmittel beruht auf der enzymatischen und nicht enzymatischen Oxidation der Phenole, sowie auf der Maillard Reaktion, die auftritt, wenn Mischungen von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und reduzierenden Zuckern erhitzt werden 4. Im Allgemeinen ist es schwierig zu ermitteln, ob die Bräunung nur enzymatisch oder nicht-enzymatisch abgelauft ist, außer wenn die Enzyme, die für die enzymatische Bräunung verantwortlich sind, in dem Nahrungsmittel abwesend sind oder inaktiviert wurden. In diesem Fall treten nur nicht-enzymatische Reaktionen auf Die enzymatische Bräunung Die enzymatische Bräunung ist ein bedeutendes Problem bei einer großen Anzahl von Waren, besonders bei Früchten wie Aprikosen, Äpfeln, Birnen, Pfirsichen, Bananen und Trauben, bei Gemüse wie Kartoffeln, Pilzen und Kopfsalat sowie bei essbaren Meerestieren wie Garnelen, stacheligen Hummern und Krabben. Die Färbung begrenzt die Lagerzeit vieler verarbeiteter Nahrungsmittel und stellt auch ein Problem in der Produktion von getrocknetem und gefrorenem Obst und Gemüse dar 6. Falls es notwendig ist, die helle Farbe eines Produktes zu erhalten, das geschnitten oder getrocknet wird, ist eine Vorbehandlung erforderlich. Die Vorbehandlung hemmt nicht nur die enzymatische Bräunung während der Verarbeitung, sondern verhindert oft auch die nichtenyzmatische Bräunung während der Lagerung. Die enzymatische Bräunung stellt jedoch nicht immer einen Nachteil dar, sondern trägt zur erwünschten Farbe und zum Aroma mancher Produkte wie Rosinen, Pflaumen, Kaffee, Tee und Kakao bei 6. Die enzymatische Bräunung ist eine Verfärbung, die entsteht, wenn Monophenole der Pflanzen oder der Schalentiere in Anwesenheit von atmosphärischem Sauerstoff und der Polyphenoloxydase a zu den o-diphenolen hydroxyliert und am Ende zu den o-chinonen weiteroxidiert werden 4,7. Die Chinone kondensieren und reagieren nicht-enzymatisch zum Beispiel mit anderen Phenolen oder Aminosäuren zu schwarzen oder roten Pigmenten von unbestimmter Struktur 8. Polyphenoloxydase (PPOs) (1,2-Benzinediol: Sauerstoffoxydo- 12

13 Einleitung Reduktase) sind kupferhaltige Enzyme, die die Tyrosinase, Diphenoloxydase, o-diphenolase, Benzkatechinoxidase, Catecholase und Phenolase einschließen8. PPOs sind in einigen Bakterien und Pilzen, in fast allen höheren Pflanzen, einschließlich Weizen, Tee, Kartoffel, Gurke, Artischocke, Kopfsalat, Birne, Papaya, Traube, Pfirsich, Mango, Apfel und Kakaosamen, in einigen Arthropoden und in allen Säugetieren vorhanden. In allen Fällen scheinen diese mit einer Pigmentierung im Organismus verbunden zu sein, eine Schutzfunktion zu haben und somit eine lebenswichtige Rolle zu spielen 2,9. In Pflanzen sind lösliche und membrangebundene PPOs beschrieben. Das PPO-Gen ist im Kern kodiert und im Cytoplasma transkribiert; das gebildete Pro-PPO wird dann zum Chloroplast transportiert, wo es durch in eine Protease eine aktive Form gespalten wird 2. Man nimmt allgemein an, dass Pilz-PPOs vier Untereinheiten enthalten, obgleich unter einigen Bedingungen in den octamerischen Formen gefunden werden. Bis jetzt haben alle entdeckten PPOs die Fähigkeit, o-dihydroxyphenol in o-chinone mit Sauerstoff als Sekundärsubstrat umzuwandeln (Catecholasetätigkeit). Jedoch nicht alle PPOs hydroxylieren Monophenole. Ein Mechanismus für die Oxidation der Monophenole und der Diphenole wird in Abbildung (1) vorgeschlagen. Abbildung 1: Vorgeschlagener kinetischer Mechanismus der Oxidation von Phenolen zu Chinonen durch die Polyphenoloxydase im Neurospora crassa 2 Die o-dihydroxyphenole, zu denen auch 3,4-Hydroxyphenylalanin (DOPA) und Tyrosin gehören, sind die wichtigsten Substrate der PPOs in den höheren Pflanzen. Als Folge bilden 13

14 Einleitung diese durch Oxidation der OH-Gruppen Chinonen, die eine große Rolle bei der Bräunung spielen können. Das Enzym Phenylalanin-Ammoniaklyase (PAL) ist ein Teil des Biosynthesewegs von phenolischen Verbindungen. Inaktivierung der PAL und dadurch die Biosynthese der phenolischen Verbindungen ist deshalb eine Methode, um die enzymatische Bräunung von Früchte und Gemüse zu verhindern 2. Weiterhin sind die Enzyme verhältnismäßig hitzelabil. Eine Hitzeinaktivierung der PPO ist durchführbar, indem Temperaturen von >50 C angewendet werden, kann aber zu nicht erwünschten Änderungen in der Farbe, der Aromen oder Struktur führen 10. Infolgedessen muss auch der Ausschluss von Sauerstoff und/oder die Anwendung von Inhibitoren wie Säuren, Halogeniden, phenolischen Säuren, Sulfiten, Chelatbildnern wie Ascorbinsäure, Chininkopplern wie Cystein und verschiedenen substratbindenden Mitteln in Betracht gezogen werden6. Die wichtigsten Faktoren, die die Rate der enzymatischen Bräunung von Früchten und Gemüse beeinflussen, sind die Konzentrationen der aktiven PPOs und der phenolischen Substanzen, der ph-wert, die Temperatur und der Sauerstoff Partialdruck. Das ph-optimimum der PPOs liegt zwischen 5 und 7. Die Absenkung des ph-werts mit Zitronen- (Zitronensaft), Äpfel- oder Ameisensäure auf 4 oder geringer kann deshalb angewandt werden, um die Bräunung in Säften, Fruchtscheiben, Avocados etc zu inhibieren. Eine weitere Abnahme des ph-wertes auf < 4 z.b. mit Zitronensäure, kann auf Grund der Komplexbildung mit Kupferionen im aktiver Zentrum zur Inaktivierung des Enzyms führen Die nicht-enzymatische Bräunung Die nicht-enzymatische Bräunung ist eine Verfärbung, die hergerufen wird durch: Die Maillard-Reaktion, in der Carbonylverbindungen, wie reduzierende Zucker, Aldehyde, Ketone und Aminen, wie Aminosäuren, Peptiden, Proteinen 12. Endprodukte der Caramellisierung oder Pyrrolse von Kohlenhydraten 5, wobei die Erhitzung von Zuckern über den Schmelzpunkt unter alkalischen oder sauren Bedingungen stattfindet 12. Bräunung der Ascorbinsäure durch deren spontanen thermischen Abbau unter aeroben und anaeroben Bedingungen in Anwesenheit oder in Abwesenheit von Aminoverbindungen 5. 14

15 Einleitung Bräunung der Lipide durch die Oxidation ungesättigter Fettsäuren, wodurch Carbonylverminderung gebildet weden, die polymerisieren. Diese Reaktion kann durch Ammoniak, Amine oder Proteine beschleunigt werden 5. Die Maillard-Reaktion kann in drei Stufen unterteilt werden: In der frühen Phase bilden sich Glykosylamine, die in einer Amadori-Umlagerung weiter reagieren. Eine mittlere Phase, in der ein Abbau der Zucker und Amadori-Produkte durch Dehydratisierung und andere Prozesse erfolgt Eine späte Phase, die Aldolkondensationen, Polymerisierungen und die Bildung stickstoffhaltiger Hetrocyclen und farbiger Produkte,der so genannten Melanoidine beeinhaltet 12. Abbildung 2: Allgemeines Schema der Maillard-Reaktion Der Schlüsselschritt ist die Amadori-Umlagerung, bei der unstabile Ketosylamine gebildet werden, welche enolisieren und zu einer Reihe von Reaktionen der mittleren Phase führen

16 Einleitung Maillard-Produkte scheinen die enzymatische Bräunung deutlich inhibieren zu können. Ihre starker Inhibitionswirkung könnte mit ihren antioxidativen Eigenschaften zusammenhängen 10, welche z.b. auch die Lipide vor einer Oxidation schützen 13. Neben diesen Vorteilen begrenzen Maillard-Reaktionen die Lagerbeständigkeit verschiedener getrockneter Früchte und Gemüse, Zitrusfruchtprodukte und Säfte 14,15. Ascorbinsäure ist der reaktivste Bestandteil von Orangensaftgetränken, der zu Bildung von braunen Pigmenten führt, was in Anwesenheit von Sauerstoff und Aminosäuren beschleunigt wird 16. Die Vitamin C-Bräunung führt damit zum Abbau und zum Verlust dieses wichtigen Vitamins, sowie unter anderen zur Produktion von Furfuralen. Vitamin C und seine Abbauprodukte reagieren auch mit Aminosäuren in einer Maillard-ähnlichen Reaktion 17. Zusätzlich zur Verfärbung verursachen die nicht-enzymatischen Bräunungsreaktionen somit auch die Zerstörung von Nährstoffen wie zum Beispiel der essentiellen Aminosäuren und Vitaminen. Darüber hinaus verringern sie die Proteinverdaubarkeit, inhibieren Verdauungsenzyme und stören den Mineralmetabolismus durch Metallionenkomplexierung. Diese Prozesse spielen vor allem in Milchprodukte eine große Rolle Weiterhin können, insbesondere in erhitzten Fleisch, Maillard-Produkte vorkommen, die möglicherweise giftige und mutagene Eigenschaften besetzen 12,22. Obwohl die nicht-enzymatische Bräunung eine Qualitätsverminderung in vielen Produkten hervorruft, ist die Maillard-Reaktion in einigen Lebensmitteln auch erwünscht, wie z.b. in Backwaren, gerösteten Nüssen und gebratenem Fleisch. Um den Mangel an Farbentwicklung während des Kochens mit Mikrowellen bei bestimmten Nahrungsmitteln auszugleichen, können relevante Ausgangsprodukte der Bräunung dem Lebensmittel zugegeben werden 23,24. Darüber hinaus besteht das Aroma vieler Nahrungsmittel wie z.b. Kaffee aus flüchtigen Produkten, die durch nicht-enzymatische Bräunungsreaktionen während der thermischen Behandlung entstehen Bedeutung der nicht-enzymatische Bräunung in Lebensmitteln Durch die nicht enzymatische Bräunung wird der Genusswert von erhitzten Lebensmitteln wesentlich bestimmt. Die Ausbildung eines typischen Lebensmitteln Koch-, Back-, Brat-, oder Röst- Aromas ist hierbei an erster Stelle zu nennen. Dafür sind die zahlreichen heterocyclischen sowie nicht-cyclischen Verbindungen verantwortlich, die ab der fortgeschrittenen Phase gebildet werden. Weiterhin wird durch die Farbbildung insbesondere 16

17 Einleitung beim Backen und Rösten eine charakteristische Bräunung erreicht 25. Der Geschmack wird z.b. durch die Bildung von Röstbitterstoffen beeinflusst 26. Diese Veränderungen sind in dem für das jeweilige Lebensmittel typischen Umfang gewünscht und charakteristisch. Darüber hinausgehende Veränderungen können zum offflavor führen. Dies trifft auch auf Umsetzung zu die für ein Lebensmittel nicht typisch sind aber z.b. infolge längerer Lagerung auftreten 25,27. Neben den organoptischen Eigenschaften nimmt die nicht-enzymatische Bräunung auch direkten Einfluss auf die nutriven Eigenschaften. Hierbei spielt besonders die Verfügbarkeit der essentiellen Aminosäuren eine große Rolle. Die chemische Modifikation einer Aminosäure kann dazu führen, dass diese vom Körper nicht mehr für Proteinbiosynthese genutzt werden kann. In diesem Zusammenhang schenkt man besonders Lysin Aufmerksamkeit. Zu einer Modifikation der essentiellen Aminosäuren kommt es erst im Verlauf der fortgeschritten Phase, Wobei insbesondere Verluste bei den schwefelhaltigen Aminosäuren zu verzeichnen sind. Daneben wird in diesem Stadium eine Abnahme der Verdaulichkeit des gesamten Proteins beobachtet, welche die Verfügbarkeit sämtlichen einschränkt 27,28. Die Minderung der biologischen Wertigkeit des Proteins einzelner Lebensmittel ist beim gesunden Erwachsenen und einer gemischten Kost in der Regel kein Problem. In einigen Fällen wo nur eine sehr begrenzte Anzahl von Lebensmitteln als Ernährungsrundlage dient wie z.b. bei Säugligernährung ist jedoch erhöhte Aufmerksamkeit und die Anwendung besonders schonender Technologien beton 28. Eng Verknüpft mit der Stabilität und Haltbarkeit von Lebensmitteln sind antioxidativ wirksame Stoffe. Beim Erhitzen von Lebensmittel kommt es zum Abbau von natürlichen Antioxidationsmitteln. Gleichzeitig erfolgt aber auch eine Bildung von neuen antioxidativ wirksam Verbindungen im Zuge der Maillard-Reaktion wie dies z.b. bei Milchprodukte gezeigt werden konnte 28,29. Antioxidativ wirksam Maillard-Produkten wird auch in vivo eine positive Rolle zugeschrieben werden 30,31 konnten beispielsweise nachweisen, dass Bestandteile aus einem Peptid-Glycose-Reaktionsgemisch aus Miso, einem gebräunten Sojaprodukt, auch in vivo antioxidativ wirken. Die Aktivität gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies konnte insbesondere bei Peptid-Glucose-Reaktionsprodukten, Amadori- Produkten Modell-Melanoidien und Melanoidinen aus verschieden Lebensmitteln wie Kaffee und Miso gezeigt werden. Die Produkte der Maillard- Reaktion werden kontrovers im Zusammenhang mit möglichen mutagenen und karzinogenen Wirkungen diskutiert. In Modellansätzen und Lebensmitteln 17

18 Einleitung konnten z.b. heterocyclische aromatische Amine identifiziert werden, welche sich in vitround in vivo- Testsystemen als potente Mutagene und Karziogene zeigten 32. Gleichzeitig werden jedoch auch antimutagene und anti-karzinogene Effekte durch Bräunugsprodukte beobachtet, wobei insbesondere der antioxitativen Aktivität der Melanoidine eine Schlüsselrolle zugeschrieben wird 33. Die Maillard- Reaktion kann dazu benutzt werden die funktionellen Eingeschaften von Lebensmittelproteinen unter ausschließlicher Verwendung natürlicher Lebensmittelbestandteile gezielt zu verändern. So kann z.b. durch Konjungation eines 43 kda Sojaproteins mit Galaktomannan die Löslichkeit insbesondere im isoelekttrischen Bereich, die Hitzestabilität sowie die emulgierenden Wirkung stark verbessert werden, diese Modifikation beseitigt gleichzeitig die Allergenität dieses Sojaproteins Inhibition der nicht-enzymatischen Bräunung in Lebensmitteln Mehrere Faktoren können die Bildung von braunen Melanoiden in den Lebensmitteln beeinflussen. Unter diesen sind ph-wert, Temperatur, Feuchtigkeitsgehalt, Erhitzungszeit, sowie Konzentration und Struktur der Ausgangsverbindungen zu nennen Die Bräunungsrate erhöht sich mit steigender Temperatur 6, so dass eine Reduktion der Temperatur während Lagerung diese Prozesse somit verlangsamen kann. Weiterhin beschleunigt ein alkalischer ph-wert die Reaktionen sehr und führt zu Veränderungen des Produktspektrums 12. Das Verringern des Feuchtigkeitsgehaltes durch Wasserentzug kann die Reaktionen inhibieren, deren optimale Aktivität von der Wasseraktivität abhängig ist. Dieses Verfahren kann aber nur durchgeführt werden, wenn das getrocknete Produkt in dieser Form für den Verbraucher verwendbar ist und eine Lagerung unter Ausschluss von Feuchtigkeit gewährleistet werden kann 40. Das Verpacken unter Schutzgas ist extrem nützlich, wenn die zu verpackenden Produkte Sauerstoff enthalten. Durch Verwendung von Inertgas wird die Möglichkeit der Lipidoxidation verringert, so daraus folgende die Bräununsreaktionen verhindert werden 41. Außer Temperatur, Sauerstoff, ph-wert und Feuchtigkeit kann die nicht-enzymatische Bräunung auch von anderen Faktoren beeinflusst werden. Die Bräunungsrate von Aldosen ist z.b. im allgemein höher als die von Ketosen und die von Pentosen und kurzkettigen Carbonylverbindungen höher als die von Hexosen. Basische Aminosäuren bräunen im Allgemeinen leichter als saure Aminosäuren. Ihre Bräunungsaktivität folgt folgender Ordnung: Lysin > β-alanin > α-alanin > Glutaminsäure

19 Einleitung Weiterhin werden chemische Inhibitoren werden benutzt, um die Bräunungsreaktionen während der Produktion und Lagerung verschiedener Nahrungsmittel zu begrenzen. Häufig werden dabei Sulfit, Bisulfit, Thiole und Calciumsalze verwendt Sulfit und Bisulfite inhibieren z.b. die Umwandlung von D-Glukose zum 5- Hydroxymethylfurfural, sowie die Umwandlung von Ascorbinsäure zu Furfural aufgrund einer Blockierung der reduzierenden Gruppen (Abbildung 3). Infolgedessen wird die Furfuralbildung blockiert und die Produktion farbiger Pigmente verhindert. O O O OH HO C O O C O O C O CH O O C HO C Oxidation O C + H 2 O O C - CO - H 2 2 O HC OH HC HC HC OH HO CH HO HO CH HO CH HO CH CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH Ascorbinsäure Dehydroascorbinsäure 2,3-Diketogluconsäure Xyloson O O OH -H 2 O O Furfural X O CH -2 +SO 3 C OH O O S O CH CH CH 2 OH CH C OH CH CH CH 2 OH - H 2 O CH C O CH CH CH 2 OH Abbildung 3: Inhibition der Bildung von Furfural aus Ascorbinsäure nach Zusatz von Bisulfiten 45,46. Der Inhibitionseffekt von Calziumsalz liegt in der Chelatisierung der Aminosäuren durch das Calcium. Neben dem guten Einfluss der Sulfite auf die Bräunung stehen auch Nachteile für die Gesundheit der Konsumenten z.b. die Sulfite reduzieren z.b. stark die Bindung von Sauerstoffs an Blutfarbstoff Hämoglobin und können Thiamin zerstören. Thiamin ist lebenswichtig für die Energieproduktion, die Funktion des Nervensystems und die Proteinbiosynthese. Dazu gibt es viele Menschen, bei denen eine so genannte Sulfit- Empfindlichkeit vorliegt. Auf Grund dieser Nachteile der Sulfite, wird nach alternativen chemischen Inhibitoren der Maillard-Reaktion gesucht 47. In diesem Zusammenhang muss festgestellt werden, dass nicht nur Bedarf besteht, die späteren Reaktionen der nicht-enzymatischen Bräunung zu inhibieren, sondern auch die frühen Reaktionen, da diese zu einer Blockierung essentieller Aminosäuren und damit zu einer Reduktion des Nährwert führen. 19

20 Einleitung 1.5. Bedeutung von AGEs in der Medizin AGEs (advanced end-products of the Maillard reaction) konnten bereits an verschiedenen Proteinen und Zellen im Körper wie roten Blutkörperchen 48, Augenlinsenprotein 49, Hautcollagen 50 oder Lipoproteinen 51 nachgewiesen werden. Die AGE-Bildung ist umso ausgeprägter, je länger die biologische Halbwertszeit des Proteins und je höher die Glucosekonzentration ist. So findet man einen hohen AGE-Spiegel, bedingt durch einen erhöhten Blutzuckerspiegel, insbesondere bei Diabetes mellitus. Aber auch aufgrund der verringerten AGE-Ausscheidung bei Niereninsuffizienz, sowie aufgrund der langen Inkubationszeit allgemein bei Alterungsprozessen sind die AGE-Konzentrationen erhöht 52. Nicht nur aus Zuckern, sondern auch aus Fettoxidationsprodukten können sich AGEs bilden 53, die man streng genommen advanced lipooxidation end-products (ALEs) nennt. So entsteht Carboxymethyllysin (CML) nachgewiesenermaßen nicht nur durch Glykierungsreaktionen, sondern auch bei der Reaktion von Proteinen mit Oxidationsprodukten mehrfach ungesättigter Fettsäuren 54. Der Einfachheit halber wird im Weiteren jedoch ausschließlich von AGEs gesprochen. Durch die Bildung von AGE-Strukturen ändern sich Ladung, Hydrophobizität und die Tertiärstruktur von Proteinen. Aufgrund dessen kann es zu schwerwiegenden Veränderungen der Eigenschaften und Funktionen von Proteinen, wie Enzymen, Carrierproteinen und Rezeptoren kommen. In vielen Untersuchungen wurde mittlerweile ein Zusammenhang zwischen einem erhöhten AGE-Spiegel und verschiedenen Krankheiten wie Diabetes mellitus 55, chronischer Niereninsuffizienz 56, grauem Star 57, Amyloidose 58, Alzheimer 59 und Arteriosklerose 60 nachgewiesen. Ob die erhöhten AGE-Konzentrationen Ursache oder nur Folge dieser Krankheiten sind, ist noch nicht vollständig geklärt. Allerdings tragen die strukturellen Veränderungen von Proteinen durch Glykierung zur Entstehung vieler Folgeerkrankungen von Diabetes mellitus wie Augenlinsentrübung und diabetischer Nephropathie bei. Neben diesen Mechanismen, bei denen eine veränderte Tertiärstruktur von Proteinen, der eine pathogene Wirkung von AGEs verursachen, wurden mittlerweile auch rezeptorvermittelte Reaktionen als Ursache für den schädlichen Einfluss von AGEs auf den Körper gefunden. So wurden mittlerweile AGE-Rezeptoren auf verschiedenen Zelltypen entdeckt 61, die bei Bindung von AGEs zelluläre Reaktionen auslösen können beispielsweise wurde der Rezeptor RAGE Rezeptor für advanced glycation end products identifiziert 62, von dem 20

21 Einleitung gezeigt werden konnte, dass er CML bindet und diese Wechselwirkung zu inflammatorischen Reaktionen führt. Man nimmt an, dass dieser Reaktionsweg eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Arteriosklerose spielt 63. In Organen mit hohem Ascorbinsäuregehalt scheint auch die Ascorbylierung wesentlich zur Modifikation von Proteinen beizutragen. So enthalten beispielsweise Augenlinsen hohe Konzentrationen an Ascorbinsäure von bis zu 3 mm 64, die dort durch das UV-Licht sehr leicht zu Dihydroxyascorbisäre (DHA) oxidiert werden kann. Bei Untersuchungen der langlebigen Augenlinsenproteine wurden hohe Konzentrationen an Ascorbylierungsprodukten wie Oxalsäuremonoamid (OMA) gefunden 65. Die Ergebnisse mehrerer Studien weisen auf einen Zusammenhang zwischen Ascorbylierung und Entstehung von grauem Star hin 66, AGE-Inhibitoren in der Medizin Bei der Suche nach Arzneistoffen gegen die AGE-bedigten Schädigungen bei Diabetes, Niereninsuffizienz, Alzheimer, und für anderen Erkrankungen wurden in der Vergangenheit zunächst in In-vitro-Modellsystemen die AGE-inhibierende Wirkung verschiedener Substanzen getestet, die als AGE-Inhibitoren wirken. Khalifah und al. 68 haben die Inhibitoren der AGE-Bildung nach ihrer Wirkung auf die Maillard-Reaktion klassifizieren (gekennzeichnet durch die Buchstaben A-F) (Abb.4) 68. Abbildung 4 : Klassifikation der AGE-Inhibitoren

22 Einleitung Typ A: Substanzen, die Aminogruppen der Aminosäuren inaktivieren (Zuckerkonkurrenten) Typ A Inhibitoren (Zuckerkonkurrenten) reagieren mit freien Aminogruppen, um Reaktionen von Zuckern mit Aminosäure zu verhindern. Beispiele solcher Inhibitoren sind Aldehyde, Pyridoxal-Phosphat oder Acetylsalicylsäure Da es nicht möglich ist, alle Proteinaminogruppen im Körper zu blockieren und es denkbar ist, dass lebenswichtige Enzyme inaktiviert werden können, können diese Substanzen in den Konzentrationen, in denen sie als AGE-Inhibitoren eingesetzt werden müssen, als Arzneistoffe nicht verwendet werden Typ B: Substanzen, die freie Carbonylgruppen blockieren Inhibitoren der Kategorie B reagieren mit Carbonylgruppen, einschließlich denen der Aldoseund Ketosezucker und inaktivieren sie, bevor sie mit Proteinen reagieren. Diese Mittel wirken auf mehr als einer Stufe der Maillardkaskade. Aminoguanidin z.b. reagiert als Hydrazin mit der Carbonylgruppe der Amadori-Produkte, Glyoxal (GO) und Mehyglyoxal (MGO) 72. Aminoguanidin und andere Hydrazinwirkstoffe, wie Hydralazin, Isoniazid und Gentamicin, rufen jedoch möglicherweise Nebenwirkungen hervor, da sie Carbonyl-verbindungen im Körper, besonders Pyridoxal-Phosphat depletieren können 73. Antioxidatative wirksame Thiole, wie z.b Glutathion, können auch die Carbonylverbindungen deaktivieren Typ C: Metallchelatbildende Verbindungen AGE-Inhibitoren dieses Typs, wie DETAPAC, Phytat und Penicillamin 74,75 funktionieren als chelatbildende Verbindung. Übergangsmetalle proxidativ wirken und damit die AGE-Bildung fordern, kann in vitro die Inaktivierung von redoxaktiven Metallionen zu einer Inhibition der Maillard-Reaktion führen. Im Körper sind jedoch redoxaktive Übergangsmetalle in der Regel an Trägerproteine wie Ferrition, Transferrin, Laktoferrin oder Ceruloplasmin gebunden, so dass sie nicht an Oxidationsreaktione beteiligt sind. Deswegen scheint es nicht sinnvoll die Glycoxidation in vivo mit diesen Substanzen zu inhibieren Typ D: Dicarbonylfänger Inhibitoren des Typs D, wie Aminoguanidin und L-Arginin blockieren reaktive Dicarbonylzwischenprodukte, wie Glyoxal, Methyglyoxal, Glucosone unter Bildung von 22

23 Einleitung Triazinen und Imidazolonen 72,76. Bei verschiedenen Krankheiten wie z.b. Diabetes ist die Konzentration an reaktiven Dicarbonylverbindungen durch verschiedene Stoffwechsel-wege erhöht. So wird z.b. Methylglyoxal aus den Triosephosphaten oder Aceton und 3- Deoxyglucoson aus Fructose-3-Phosphat gebildet. Da Dicarbonylverbindungen eine sehr höhere Aktivität haben AGEs zu bilden als Zucker, könnte die Blockierung dieser Intermediate die Maillard-Reaktion in vivo effektiv zurückdrängen Typ E: Inhibition des Abbaus von Amadori-Produkten AGE-Inhibitoren des E -Typs z.b. die Amadoriase ist auf Amadori Addukten gerichtet. Die Amadoridase, die von Bodenbakterien gebildet wird, katalysiert die oxidative Deglykierung von Amadori-Produkten unter Bildung der entsprechenden Aminosäuren, des Glucosons und Sauerstoffsuperoxidation 77,78. Bisher konnte dass zwei Isoenzyme der Amadoriase (I, II) aus Aspergillus-sp gereinigt wurden. Die beide bauen Amadori-Produkte mit niedrigem Molekulargewicht ab, die z.b. an Aminen oder Aminosäuren gebunden sind. In höheren Organismen sind Amadoriasen bis jetzt nicht gefunden worden Typ F: Spaltung von Quervernetzungsprodukten Inhibitoren des Typs F schließen Thiazoliumsalz wie Phenacylthiazoliumbromid (PTB) und ALT-711 ein Diese Substanzen leiten sich von Thiamin (Vitamin B1) ab, das selbst als Inhibitor der AGE- Bildung wirken kann 82. PTB und Alt-711 spalten bereits gebildete Quervernetzungsprodukte, anstatt ihre Bildung zu verhindern. Ihr therapeutisches Bedeutung besteht deshalb darin, dass sie die Komplikationen aufheben, die in vivo durch Dicarbonylverbindung hervorgerufen werden. Als zugrunde liegender Mechanismus wurde vorgeschlagen, dass diese AGE-Quervernetzungsprodukte, die durch α Dicarbonylverbindungen hervorgerufen werden, spalten. Jedoch gibt es bisher keinen Nachweis dafür, dass α Dicarbonylverbindungen bei der Bildung von AGE- Quervernetzungs-produkten in vitro oder in vivo eine Rolle spielen Zu Zeit verfügbare chemische AGE-Inhibitoren Es gibt prinzipiell zwei Mechanismen, wie AGE-Inhibitoren physiologisch wirken können, nämlich durch Verminderung des Gesamtgehalts an AGEs oder durch die Veränderung der Zusammensetzung der AGEs. Inhibitoren der ersten Gruppe verringern die AGEs- Konzentrationen in Plasma und Gewebe und damit ihre pathophysiologischen Effekte 23

24 Einleitung zurückzudrängen. Ein zweiter möglicher Effekt von AGEs-Inhibitoren könnte die chemische Änderung bestehender oder der neu gebildeter AGEs sein, indem sie z.b. pathologisch aktive AGEs zu nicht-aktiven Produkten abbauen. In den folgenden Abschnitten werden einige der bekannten AGE-Inhibitoren vorgestellt (Tabelle 1). Produktname/ chemischer Name Wirkung Chemische Struktur Pimagedin/ Aminoguanidin Reaktion mit 1,2-Dicarbonylverbindungen und reaktive Sauer oder Sitckstoff Arten; Chelatbindildner von Übergangmetallen H 2 N HN NH NH 2 Carnosin (n=1) Homocarnosin (n=2) Antioxidantien und Chelatbindildner von Übergangmetallen N H N NH COOH NH 2 n CAS 997/ Tenilsetam [(±)-3-(2-Thienyl)-2-piperazinon] Inhibition der Quervenetzung von Proteinen sowie Pyrralin und fluoreszierenden M.P S O O NH O NH OPB- 9195/ 4-Oxo-N-phenyl-4,5- dihydro-2-[(1-methylethyliden) hydrazino]-5-thiazolacetamid Fängt reaktive Carbonylverbindungen ab, Chelatbildner von Übergangmetallen, Inaktivierung von Hydroxylradikalen NH O S NH N N CH 3 CH 3 R Pyridoin (R=OH)/ Pyridoxamin (R=NH 2 ) Chelatbildner mit Übergangsmetallen; Reaktion mit reaktiven Carbonylverbindungen HO OH N CH 3 N-Phenacyl-1,3-thiazoliumbromid Spaltung von Proteinquervernetzung, Chelatbildner von Übergangsmetallen O Br N S N-Phenacyl-4,5-dimethyl-1,3- thiazoliumchlorid (Alagebriumchlorid; ALT-711) Spaltung von Proteinquervernetzung, Chelatbildner von Übergangsmetallen O Cl N S NH NH Metformin Reduzierung der Konzentration an Methylgloxal N N H NH 2 Tabelle 1: Chemische Strukturen von AGE Inhibitoren Aminoguanidin Aminoguanidin wurde als,,pimagedine von der Firma Alteon enwickelk, um die Reaktion von Glucose mit Proteinen in vivo zurückzudrängen. Damit sollen Komplikationen vermindert werden, die z.b. bei Diabetes oder der Alterung durch kovalente Proteinquervernetzung hervorgerufen werden. Als Derivat des Hydrazins kann Aminoguanidin reaktive Carbonylverbindungen, die während der Maillard-Reaktion entstehen, wie z.b. Amadori-Produkte, abfangen und so ihre Umwandlung zu AGEs verhindern. 24

25 Einleitung Es wird vermutet, dass Aminoguanidin vor allem mit den Carbonylgruppen der Amadori- Produkte in glykierten Proteinen reagiert, sie blockiert und so weitere Reaktionen inhibiert, die zu Bräunung und Fluoreszenzentwicklung führen würden. Weiter führende Studien haben jedoch gezeigt, dass Aminoguanidin die Amadori-Produkte nur bei höheren Konzentrationen und in einem sehr begrenzten Umfang blockiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Mechanismus in vivo vermutlich keine Rolle spielt. Aminoguanidin reagiert nicht nur mit Carbonylgruppen glykierter Proteine, sondern vor allem mit Dicarbonylverbindungen wie Glyoxal, Methylglyoxal oder Desoxyglucosonen. Methylglyoxal reagiert z.b. mit Aminoguanidin unter physiologischen Bedingungen zu zwei isomeren Triazinen, ( +)3-Amino-5-methyl-1, 2, 4-triazin und (-) 3-Amino-6-methyl-1,2,4- triazin 83 (Abbildung 5). Die Dicarbonylverbindungen Methylglyoxal (MG) und 3-Deoxyglucosone (3-DG) zeigen neurotoxische Effekte in kultivierten kortikalen Neuronen. Diese Effekte waren mit der Produktion reaktiver Sa uerstoffspezies verbunden, der eine neuronale Apoptose folgte. Gleichzeitige Behandlung, aber nicht Vorbehandlung, mit Aminoguanidin schützten die Neuronen gegen die neurotoxischen Effekte beider Produkte, MG und 3DG. Methylglyoxal wirkt auch auf die Neuroblastoma Zellenlinie SHSY5Y toxisch, wogegen die Cytotoxizität durch Vorinkubation mit Aminoguanidin vollständig verhindert wurde 84. Abbildung 5: Die Reaktion von Glyoxal, Methylglyoxal, 3-Deoxyglucosone und anderen α,β-dicarbonylverbindungen mit Aminoguanidin. 25

26 Einleitung Die Lipidoxidation führt zur Bildung reaktiver Aldehyde, die toxische Effekte auf Zellen haben können. Aminoguanidin wurde verwendet, um die aus Lipiden stammenden α,βungesättigten Aldehyde wie 4-Hydroxy-nonenal und Malondialdehyd abzufangen. Demnach kann man annehmen, dass Aminoguanidin in vivo Gewebe gegen toxische Produkte schützt, die durch oxidativen Stress aus Lipiden gebildet weden 85. Die Behandlung mit Aminoguanidin reduziert weiterhin die Expression von TNF-α, die NO- Synthese und die Produktion von intraglomerulärem NO - 2 /NO - 3 anregt 86. Eine klinische Studie mit Diabetikern, zeigte, dass die Behandlung mit Aminoguanidin eine statistisch signifikante und klinisch sinnvolle Reduzierung des im Urin ausgeschiedenen Proteins ergab. Dieses Ergebnis führte dazu, dass Pimagedine als der erste AGE- Inhibitor verwendet werden könnte, um die Weiterentwicklung der Nierenkrankheit bei zuckerkranken Menschen zu verlangsamen Carnosin Carnosin (β-alanyl-l-histidin) ist ein natürlich vorkommendes Dipeptid, das im Gehirn und im Muskel von Säugetieren, einschließlich der Menschen, in hohen Konzentrationen vorkommt. Es hat stark antioxidative, metallchelatbildende und antiglykierende Eigenschaften. Letzteres ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass es in Konkurrenz zu bevorzugten Glykierungsstellen der Proteine tritt. Als Folge verlängert es die Lebensdauer kultivierter menschlicher Fibroblasten, tötet modifizierte Zellen und schützt Zellen gegen Aldehyde und Peptidfragmente des Amyloids. Weiterhin inhibiert es in vitro die Bildung von Proteinquervernetzungsprodukte, Carbonylverbindungen, AGEs und DNA-Proteinquervernetzungsprodukten. Carnosin ist ein Aldehydfänger, z.b. für das Lipofuscin (Alter Pigment und möglicher Vorläufer der Zuckerkrankheit Komplikationen, der,,atherosclerose und der Alzheimerkrankheit) 88,89. Carnosine wurde gezeigt, dass es glykierung und Proteinquervernetzung inhibiert, die bei Peptiden wie z.b. Acetyl-Lys-His-amid (Aβ) oder bei Proteinen wie z.b. Crystallin, Superoxidedismutase (SOD) stattfindet. Es verhindert Glykierung und Quervernetzung, die durch Ribose, deoxyribose, dihydroxyazeton, Dihydroxyazetonphosphat und Fructose ablaufen 89. Carnosin verhindert nach kurzer Inkubation vollständig die Inhibition der Aspartataminotransferaseaktivität durch Glucose-3-Phosphat. Dies deutet darauf hin, dass es durch endogene Aldehyde abfangen könnte

27 Einleitung Weiterhin konnten neurotoxische Effekte von β-amyloidpeptid (Aβ 25-35) auf Endothelzellen des Rattengehirns durch Carnosin inhibiert werden. Substanzen, die ähnliche Eigenschaften haben wie Carnosin, beispielsweise β-alanin, Homocarnosin, der AGE- Inhibitor Aminoguanidin und die Superoxiddismutase (SOD), schützen die Zellen ebenfalls, jedoch nicht so effektiv wie Carnosin. Der Wirkmechanismus des Carnosin liegt vermutlich in seinen antiglykierenden und antioxidativen Eigenschaften. Sowohl die AGE-Bildung als auch oxidativer Stress führen zu Schädigungen von Neuronen und Endothelzellen, welche für die Alzheimererkrankung mitverantwortlich sind Tenilsetam Tenilsetam ((R)CAS 997: (+/-)-3-(2-Thienyl)-2-piperazinon) wurde zuerst als antifür weitere Polymerisierungsreaktionen blockiert. Am ischämische, dann als Arzneimittel von,,cassella (jetzt Aventis) eingeführt und erfolgreich für die Behandlung von Alzheimer-Patienten verwendet 92. In vitro inhibierte Tenilsetam die Proteinquervernetzung, die durch AGE-Bildung von Glucose oder Fructose verursacht wurde. So wurde Kollagen z.b. für 4 Wochen mit 100 mm Glukose inkubiert, was eine reduzierte enzymatische Hydrolysierbarkeit zur Folge hatte. Diese konnte durch Coinkubation mit 100 mm des Tenilsetam wieder zum Ausgangniveau gesenkt werden 93. Die Bildung von AGE-Quervernetzungsprodukte des Amyloidpeptid konnte ebenfalls durch die AGE-Inhibitoren Tenilsetam, Aminoguanidin und Carnosin vermindert werden 94. Als Mechanismus wurde vorgeschlagen, dass Tenilsetam kovalent an glykierte Proteine bindet und so die reaktiven Stellen wahrscheinlichsten reagiert es mit Amadori Produkten und kann demnach als Typ E-AGE- Inhibitor (Inhibition des Abbaus von Amadori-Produkten) angesehen werden. Um festzustellen, ob Tenilsetam die Maillard-Reaktion in vivo inhibiert, wurden zuckerkranke Ratten täglich mit (50 mg/kg) Tenilsetam behandelt. Der Diabetes induzierte Bildung von fluoreszierenden AGEs und Pyrralin in der Nierenrinde und in der Aorta konnte durch die Gabe von Tenilsetam unterdrückt werden. Es wurde deshalb postuliert, dass Tenilsetam als AGE-Inhibitor Komplikationen in Folge von Diabetes verhindern könnte

28 Einleitung OPB-9195 OPB-9195 (2-Isopropylidenhydrazono-4-Oxo-Thiazolidin-5-ω-Lacetanilid) inhibiert in vitro, konzentrationsabhängig effektiv die Bildung der beiden Quervernetzung und die Bildung von AGEs 96. In vitro-behandlung von murinen Fibroblasten und Thymozyten mit Glyoxal verursachten umfangreiche Tyrosinphosphorylierungen von mehreren Proteinen, die durch die Zugabe von OPB-9195 inhibiert werden konnte. In einem Rattenmodell für Diabetes mellitus Typ II führten AGEs zu einer erhöhten Expression von Wachstumsfaktoren, wie TGF-beta und endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) in den Nieren. Die war nach Behandlung mit OPB-9195 verringert 97. Daraus wurde geschlossen, dass das Thiazolidinderivat OPB-9195, die Weiterentwicklung der diabetesabhängigen glomerulären Sklerose bei den Ratten durch Erniedrigung der AGE-Konzentrationen im Serum und der Inhibition der glomerulären AGE- Ablagerung zurückdrängt 98. AGEs oder Glycoxidationprodukte, wie Carboxymethyllysin (CML) oder Pentosidin und Lipoxidationprodukte, wie Malondialdehyd- und 4-Hydroxy-nonenal-Proteinaddukte wurden in reichen fetthaltigen Streifen der Intima und in Makrophagen identifiziert. Nach einer Ballonoperation an Herzarterien von Ratten, ein Modell für die Verdickung der Intima, waren in den Arterien diese vier Addukte nachweisbar. Orale Einnahme von OPB-9195, ein Inhibitor für Glycoxidation- und Lipoxidationreaktionen, verhinderte effektiv in den Ratten die intimale Verdickung als Folge der Ballonverletzung Pyridoxamin Durch Inkubation mit Ribose konnten Proteine hergestellt werden, die reich an Amadoriaddukten sind. Diese Zwischenprodukte wurden dann benutzt, um Verbindungen zu identifizieren, die spezifisch die irreversible Umwandlung der Amadori-Produkte zu AGEs inhibieren. Durch dieses Verfahren wurden verschiedene Post-Amadori-Inhibitoren getestet, wobei Pyridoxamin- und Thiaminpyrophosphat die stärkste Inhibitonsrate zeigten, die selbst die Wirkung von Aminoguanidin überstieg 68,82. Pyridoxamin inhibiert weiterhin die Bildung von Proteinaddukten, die während der Lipidperoxidation in vitro entstehen, indem es die reaktiven Zwischenprodukte abfängt 100. Weiterführende Studien habe jedoch gezeigt, dass die Ergebnisse nicht unbedingt auf die Situation in vivo übertragbar sind. 28

29 Ziel der Arbeit 2. Ziel der Arbeit Während der Zubereitung und Herstellung von Lebensmitteln laufen vielfältige chemische Reaktionen ab. Wichtig ist hierbei vor allem, die Maillard-Reaktion,die zur Bildung von Aromastoffen, Antioxidatien und vor allem auch braunen Farbstoffen, den Melanoidinen führt. Aus diesem Grund wird die Reaktion auch nicht-enzymatische Bräunung genannt. Je nach Produkt kann die Bräunung erwünscht (Brotkruste, gebratenes Fleisch) oder unerwünscht (Trockenprodukte, Milchprodukte) sein. Da die unerwünschte nichtenzymatische Bräunung zu großen technologischen Problemen führt, wird nach Möglichkeiten gesucht, diese Prozesse wirksam zu unterdrücken. Zurzeit wird vor allem Sulfit als wirksamer Inhibitor eingesetzt. Auf Grund von toxikologischen Bedenken, wird jedoch nach alternativen Möglichkeiten gesucht. In der medizinischen Biochemie erfolgten in den letzten Jahren große Bemühungen Wirkstoffe zu suchen, die eine AGE-Bildung unterdrücken. AGEs sind Reaktionsprodukte von Zuckern und Proteinen, die im menschlichen Organismus nach Mechanismen analog zur Maillard Reaktion gebildet werden. Diese Reaktionen finden vor allem bei Diabetes, Niereninsuffizienz und der Alterung statt und können wiederum krankheitsbezogene Komplikationen bewirken. Ziel dieses Projekts ist es, zu testen, ob AGE-Inhibitoren, die in der Medizin verwendet werden, die nicht enzymatische Bräunung in Lebensmitteln z.b. im Milchmodellsystem und in der Milch unterdrücken können. Weiterhin soll der Einfluss einiger Bräunungsihibitoren auf die Bildung verschiedener Maillard-Produkte, wie Lactulosylamin, fluoreszierenden Produkte und CML untersucht wurde. 29

30 Lactose-Lysin-Maillard-Produkte 3. Inhibition der Maillard-Reaktion in Lebensmitteln 3.1. Inhibition der Bräunung eines Lactose-Lysin-Modellsystems Die Inhibition der Maillard-Reaktion ist nicht nur ein wichtigstes Ziel in der Lebensmitteltechnologie, da die resultierende Produkte zu Qualitätseinflußen in Bezug auf Aussehen, Geruch, Geschmack und Nährwert führen können, sondern auch in der Medizin, da Glykierungsprodukte zu pathologisch wirken können. In der Literatur ist deshalb eine Reihe von Substanzen beschrieben, die verschiedene Aspekte der Maillard-Reaktion unterdrücken können. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, systematisch zu untersuchen, ob diese Verbindungen in der Lage sind, die nicht-enzymatische Bräunung in einem Lebensmittelmodell zu unterdrücken. Es wird der Einfluss der folgenden 31 Substanzen auf die Bräunung getestet: Prolin, Glutamin- und Asparaginsäure, Histidin, Tryptophan, Kupfer (II)- und Eisen (III) -Chlorid, Zimtsäure, Kojisäure, o-phenylendiamin, Carnosin, Pyridoxamin, Kaliumsorbat, Natriumbenzoat, Natriumcitrat, Arginin, Aminoguanidin, Kreatin, Semicarbazid, Glutathion, Liponsäure, Cystein, N-α-Acetylcystein, Mercaptoethanol, Natriummetabisulfit, Natriumsulfit, Taurin, Thiamin, Pyridoxin, Acetylsalicylsäure und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Diese Substanzen wurden in der Literatur als Inhibitoren für die Bildung von mutagenen heterozyklischen Aminen in Fleisch beschrieben 101, sowie als Inhibitoren der Bräunung im Lysin-Glucose-Modellsystem 102, als Inhibitoren für die Maillard-Produkte im bovinen Linsenprotein 103, als Bräunungs-Inhibitoren in Früchten und Fruchtgetränken 17,104,105, als Inhibitoren der nicht enzymatischen Glykierung in vitro 106, als Inhibitoren für Lipidoxidation 100,107 oder auch als Abfänger von Dicarbonylzwischenprodukten 108. Um den Einfluss der ausgewählten Substanzen auf die Bräunung der Proben zu testen, wurden Mischungen von Lactose und Lysin in Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 50 mm) der verschiedenen Inhibitoren für 30 Minuten bei 120 C (Abschnitt 7.3.1) erhitzt. Die Absorptionen der Proben wurden bei 420 nm in angemessenen Verdünnungen bestimmt. Die Ergebnisse in den Abbildungen 6 A-D dargestellt. 30

31 Lactose-Lysin-Mallird-Produkte Absorption mma 5 mm 10 mm 20 mm Prolin Asparaginsäure Glutaminsäure Histidin Natriumcitrat Kreatin Eisen (III)Chlorid Kupfer(II) Chlorid Zimtsäure 50 mm Absorption Kojisäure Arginin Taurin o-phen ylendiamin Carnosin Py ridoxamin Kaliu msorbat Natriu mbenzoat Ami noguanidin Tryptophan Liponsäure B 0 mm 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm Absorption Natriummetabisulfit Cystein Natriumsulfit Thiamin Acetylsalicylsäure ohne inh. 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm C Absorption Pyridoxin Gluthation N-Acetylcystein Mercaptoethanol Semicarbazid EDTA D ohne Inh. 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm Inhibitor-Art und Konzentration Abbildung 6: Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Bräunung im erhitzten Lactose-Lysin- Modellsystem. Die Absorptionen wurden bei 420 nm vermessen. Die Ergebnisse in Abbildungen C, D stellen der Mittelwert ± SD von 3 Messungen dar. 31

32 Lactose-Lysin-Maillard-Produkte Die in Abbildung 6A dargestellten Substanzen zeigen keinen deutlichen Einfluss auf die Bräunung. Das bedeutet, sie können die Bräunung in den Proben nicht inhibieren, während die Substanzen in Abbildung 6B, die Bräunung verstärkt haben. Im Gegensatz dazu zeigen die übrigen Substanzen (Abbildungen 6C und D) einen deutlichen inhibitorischen Effekt auf die Bräunung, der mit steigender Inhibitorkonzentration zunahm. Um die Inhibitionsaktivität der Proben vergleichen zu können, wurde die Inhibitionsrate bei jeder zugegebenen Inhibitorkonzentration anhand der folgenden Gleichung berechnet: Inhibitionsrate der Probe (%) = 100-((Absorption der nicht-inhibierten Probe / Absorption der inhibierten Probe)*100). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Inhibitor/ Inhibitionsrate(%) Inhibitorkonzentration 5 mm 10 mm 20 mm 50mM Natriummetabisulfit 36,23 80,90 92,74 97,86 Acetylsalicylsäure 22,15 39,78 65,70 96,54 N-Acetylcystein 35,90 54,24 75,15 94,27 Gluthation 31,72 51,66 77,46 94,07 Cystein 26,35 41,83 58,90 85,96 Thiamin 33,73 46,93 62,5 83,73 Semicarbazid 14,78 26,86 45,88 80,19 Mercaptoethanol 24,02 33,82 55,78 70,88 Natriumsulfit 13,24 22,27 64,82 68,62 Pyridoxin 15,51 29,73 44,13 53,36 EDTA 16,95 18,78 35,62 44,77 Tabelle 2: Inhibitionsrate der Bräunung im Lactose-Lysin-Modellsystem in Abhängigkeit von Inhibitorkonzentration und Inhibitorart. Die Inhibitionsrate der Bräunung nimmt, abhängig von der Inhibitorart, mit erhöhten Konzentration der Inhibitoren zu. Man kann die Aktivität der Inhibitoren nach ihrer Inhibitionsrate bei der Inhibitorkonzentration (10mM) ordnen: Natriummetabisulfit > N-α-Acetylcystein > Glutathion > Thiamin > Cystein > Acetylsalicylsäure > Mercaptoethanol > Pyridoxin > Semicarbazid > Natriumsulfit > EDTA Einfluss des Inhibitorzusatzes auf den ph-wert der Proben Die Bildung von nicht-enzymatischer Bräunungprodukten ist vom ph-wert abhängig. Deshalb wurde getestet, ob der Inhibitorzusatz zu starken Veränderungen der ph-werte in den Proben führt. In diesem Fall wäre es möglich, dass ein scheinbar inhibitorischer Effekt 32

33 Lactose-Lysin-Mallird-Produkte auf eine Veränderung des ph-werts zurückzuführen ist. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 veranschaulicht. Inhibitor /ph 0mM 5mM 10mM 20mM 50mM Natriumbisulfit 6,55 6,54 6,49 6,46 6,21 Natriumsulfit 6,56 6,56 6,51 6,49 6,44 Cystein 6,53 6,48 6,47 6,46 6,44 Prolin 6,52 6,47 6,46 6,45 6,44 Semicarbazid 6,51 6,50 6,45 6,42 6, 24 Pyridoxin 6,51 6,48 6,46 6,34 6,11 Thiamin 6,53 6,44 6,39 6,31 6,04 Aminoguanidin 6,52 6,52 6,53 6,56 6,73 Glutaminsäure 6,49 6,44 6,33 6,25 5,98 Asparaginsäure 6,47 6,43 6,35 6,25 5,99 Acetylsalicylsäure 6,53 6,4 6,30 6,17 5,62 Taurin 6,52 6,45 6,44 6,36 6,21 Histidin 6,49 6,47 6,43 6,44 6,52 Mercaptoethanol 6,47 6,57 6,57 6,58 6,58 EDTA 6,53 6,47 6,44 6,41 6,36 Natriumcitrat 6,52 6,50 6,49 6,48 6,47 o-phenylendiamin 6,49 6,44 6,42 6,49 6,74 Pyridoxamin 6,53 6,29 6,17 6,10 6,00 Kreatin 6,52 6,50 6,42 6,41 6,432 Eisen (III) Chlorid 6,49 6,56 6,575 6,60 6,60 Kojisäure 6,49 6,42 6,38 6,33 6,29 Arginin 6,49 6,35 6,34 6,35 6,46 Tryptophan 6,49 6,37 6,35 6,30 6, 26 Natriumbenzoat 6,49 6,38 6,36 6,35 6,38 Kaliumsorbat 6,49 6,42 6,39 6,39 6,37 Ascorbinsäure 6,49 6,34 6,27 6,20 6,01 Zimtsäure 6,49 6,39 6,33 6,27 6,07 Kupfer(II)Chlorid 6,49 6,59 6,60 6,61 6,66 Calcium-Chlorid 6,49 6,57 6,59 6,60 6,63 N-Acetylcystein 6,49 6,47 6,45 6,42 6,27 Nicotinsäure 6,49 6,44 3,37 6,30 6,03 Glutathion 6,49 6,38 6,31 6,27 6,11 Liponsäure 6,49 6,47 6,46 6,43 6,35 Carnosin 6,47 6,40 6,36 6,39 6,39 Tabelle 3: ph-werte der unter 2.1 beschriebenen erhitzten Proben. 33

34 Lactose-Lysin-Maillard-Produkte Die Proben wurden vor der Erhitzung in 0,1 M PBS (ph 6,8) Puffer, wie unter Abschnitt beschrieben, vorbereitet. Tabelle 3 zeigt, dass in Abwesenheit eines Inhibitors der ph-wert der Proben während der Erhitzung um durchschnittlich 0.3 sinkt. In Anwesenheit eines Inhibitors war der ph- Abfall geringfügig schwächer oder stärker ausgeprägt. Insgesamt waren die Veränderungen der ph-werte jedoch zu klein, um die beobachteten inhibitorische Effekt zu erklären. Es wurde deshalb davon ausgegangen, dass die Verbindungen direkt zu einer Verminderung der Bräunung führen Inhibition der CML-Bildung in einem Lactose-Lysin- Modellsystem Da das AGE Nε-(Carboxymethyl)lysin ein stabiles Endprodukt der Glykierung da rstellt, ist sein Gehalt meist höher als der Gehalt von anderen AGEs. Daher ist es eines der wichtigsten und bislang wohl das am besten charakterisierte AGE 109. CML dient als Marker für oxidativen Stress und als Indikator für Abbauprozesse in Lebensmitteln, die durch Hitze oder durch Lagerung ausgelöst werden CML kann durch drei verschiedene, kon kurrierende Mechanismen gebildet werden 99. Bei der Glycoxidierung lagert sich die Schiffsch e Base um, welche sich zu nächst durch die Reaktion von Glucose und Lysin bildet. 110,111. Das Amadori-Produkt wird dann oxidativ zu CML und Erythonsäure abgebaut 112. Über den alternativen Weg der autoxidativen Glycosylierung wird CML durch die Reaktion von Lysin und Glyoxal gebildet. Glyoxal entsteht durch metallkatalysierte Autoxidation von Glucose 74,113. Im dritten Reaktionsweg, dem so genannten Namiki-weg, entstehen zwei Kohlenstoff-Fragmente, unter anderem Glyoxal, durch Fragmentierung und Oxidation der Schiffchen Base 114. Abbildung 7: Vereinfachte Darstellung der Entstehung von CML 99 34

35 Lactose-Lysin-Mallird-Produkte Um Hinweise auf den Inhibitionsmechanismus der Verbindungen, die in den vorhegenden Untersuchen am wirksamster waren, zu erhalten, wurde ihr Einfluss auf die Bildung einzelner Maillard Produkte untersucht. Dazu wurde zunächst der Einfluss der Inhibitoren auf die Entstehung von CML gem essen. Lactose Lysin Mischungen wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen verschiedener Inhibitoren für 30 Minuten bei 120 C erhitz. Nach entsprechenden Verdünnungen wurden die Proben für CML- eingesetzt (Abschn itt 7.5.1). CM L wurde mittels ELISA unter Verwendung eines polyklonalen anti-cml Antikörpers (Abschnitt 7.5.2) bestimmt. Bestimmung Prinzip des kompetitiven ELISAs Die Bestimmung von CML in den Lactose-Lysin- Mischungen erfolgte mit einen kompetitiven enzymgekoppelten Immunosorbent Assay (ELISA). Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit einer konsta nten Menge an CML-modifiziertem Protein belegt. Die noch freien Bindungsstellen der Vertiefungen blockiert man mit unmodifiziertem Protein, das im Überschuss zugegeben wird (=blocking). Man nützt bei diesen beiden Schritten die Eigenschaften von Proteinen aus, sich unspezi fisch an Kunststoff zu binden. Die Platten wurden dann mit den zu untersuchenden Proben, die in stark verdünntem anti-cmlgelöst wurden, inkubiert (Antikörper-Rektion). Je höher die Kon zentration an den Antiserum gesuchten Modifikationen in den Proben ist, desto weniger Antikörper bindet an die Platte. Anschließend erfolgt die Detektion der gebundenen Antikörper mittels eines Sekundär- der an den ersten A ntikörper bindet (=label ing). Verwendet wird beispielsweise Antikörpers, ein Antikörper gegen Kaninchen-IgG, der in Ziegen gewonnen wurde. Dieser Antikörper trägt ein Enzym, das eine Farbreaktion katalysiert. Nach Zugabe eines Leukofarbstoffes kann über eine Messung der Extinktion des gebildeten Farbstoffs die Menge des gebundenen Antikörpers sichtbar gemacht werden. Die Farbreaktion sollte dann durch Zugabe von Schwefe lsäure abgebrochen wer den, wenn die Extinktionswerte in etwa bei 1,5 liegen, da bei höheren Extinktionen das Lambert-Beersche Gesetz nicht m ehr gültig ist. Eine steigende Analytenkonzentration bewirkt eine Erhöhung der Inhibition und damit gleichzeitig eine Verringerung der Absorptio n, da weniger Antikörper an die Platte binden. Die Ergebnisse Jede Probe wurde viermal gemessen und die CML-Konzentrationen werden als Mittelwerte in der Tabelle 4 dargestellt. 35

36 Lactose-Lysin-Maillard-Produkte Natriummetabisulfit Pyridoxin Cystein Inibitor Konzentration ABS 1 ABS 2 ABS 3 ABS 4 ABS 5 MW A Stab. A CML-konz. 0mM 1,57 1,45 1,35 1,4 1,4 1,24 0, ,25 15mM 1,42 1,39 1,36 1,35 1,28 1,27 0, ,32 10mM 1,45 1,4 1,46 1,37 1,31 1,4 0, ,27 20mM 1,64 1,59 1,65 1,56 1,54 1,6 0,05 637,57 50mM 1,5 1,45 1,48 1,44 1,46 1,47 0, ,89 0mM 1,61 1,57 1,71 1,61 1,52 1,6 0,07 623,5 5mM 1,4 1,46 1,52 1,73 1,69 1,56 0,14 822,58 10mM 1,44 1,44 1,5 1,61 1,61 1,52 0, ,06 20mM 1,39 1,4 1,44 1,48 1,71 1,48 0, ,32 50mM 1,01 1,39 1,44 1,45 1,61 1,38 0, ,46 0mM 1,3 1,35 1,38 1,42 1,62 1,42 0, ,7 5mM 1,54 1,49 1,57 1,62 1,78 1,6 0,11 632,88 10mM 1,33 1,42 1,47 1,44 1,52 1,44 0, ,67 20mM 1,44 1,53 1,54 1,68 1,63 1,56 0,1 803,38 50mM 1,95 1,93 1,99 2,11 2,1 2,01 0,08 Nd ng/ml Tabelle 4: CML-Bestimmung in einer erhitzten Lactose-Lysin-Mischung, der unterschiedliche Konzentrationen von verschiedenen Inhibitoren zugegeben worden war. Die Quantifizierung erfolgte mittels ELISA unter Verwendung eines polyklonalen anti-cml Antikörpers. Man sieht anhand dieser Tabelle, dass die CML-Konzentration in den Lactose-Lysin- Mischungen mit steigender Inhibitorkonzentration nicht abnimmt. Möglicherweise stören die zugesetzten Inhibitoren die CML-Bestimmung mittels ELISA. Aus diesem Grund wurde in den folgenden Versuchen die inhibitorische Wirkung der Testsubstanzen auf die CML-Bildung in Lactose-Protein Mischungen untersucht. Dieses System hat den Vorteil, dass nicht verbrauchter Inhibitor vor der ELISA-Bestimmung leicht durch Dialyse entfernt werden kann. Ein weiterer Vorteil ist die sehr viel höhere Affinität des polyklonaler CML-Antikörpers gegen Protein gebundenes CML im Vergleich zu freiem CML Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse In diesem Abschnitt wurde der Einfluss von 31 Substanzen auf die Bräunung im Lactose- Lysin-Modellsystem getestet. Die Inhibitoren Natriummetabisulfit, Natriumsulfit, Cystein, N-α-Acetylcystein, Mercaptoethanol sowie Glutathion zeigten eine starke inhibitorische Wirkung auf die Bräunung. Die Thiole können dabei an unterschiedliche Stufen der Maillard Reaktion eingreifen 42,43. 36

37 Lactose-Lysin-Mallird-Produkte R 1 O H + R 2 NH 2 H + R 1 OH NH 2 + R 2 -H 2 O Kohlenhydrate Amine,z.B. Proteine Hemiketal R 1 CH NH R 2 braune Produkte Schiff base R 1 O H + R 2 SH R 1 CH (OH) S R 2 Thiol Thiolhemiketal -H 2 O R 1 CH (OH) S R 2 + R 2 SH R 1 CH (SR 2 ) Thioketal Abbildung 8 : Möglicher Inhibitionsmechanismus der nicht-enzymatischen Bräunung durch Thiole nach Friedman 43 Im Gegensatz dazu werden die Effekte des Sulfits weniger gut verstanden, obgleich es eine größere nukleophile Reaktivität als die Thiole besitzt. Es wurde vorgeschlagen, dass Natriumsulfite oder Natriummetabisulfite in flüssigen Lebensmitteln Sulfitionen bilden können (Abb.9), die z.b. mit 3,4-Dideoxy-hexosulos-3-en (DDH) zur stabilen 3,4-Dideoxy-4-sulfohexosulose (DSH) reagieren 115. S 2 O H 2 O 2 HSO 3 HSO 3 - SO H + Abbildung 9: Bildung von Sulfitionen in flüssigen Lebensmitteln nach Zusatz von Natriummetabisulfit bzw. Natriumsulfit. CHO CHO CHO C O O C O - H + C O CH CH : CH O - 2 CH O - H C O S O O S O C H CHOH O - CHOH CHOH CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH + S O - 3, 4-Dideoxyhexosulos- 3-en 3, 4-Dideoxy- 4-sulfohexosulose Abbildung 10: Bildung von DSH aus DDH und sulfithaltigen Substanzen 99. DSH hat eine geringre Aktivität im Bräunungsprozess als DDH, weil es wahrscheinlich keine α, β-ungesättigten Carbonylzwischenprodukte bilden kann, die den größten Einfluss auf den 37

38 Lactose-Lysin-Maillard-Produkte Bräunungsprozess haben sollen 99. Man kann die höhere inhibitorische Aktivität des Natriummet abisulfit im Verg leich mit Natriumsulfit durch die Reaktionsgleichungen in Abb. 9,10 erklären. Ein Molekül Metabisulfit setzt zwei Sulfiti onen frei, w elche mit zwei Dicarbonylzwischenprodukten reagieren können. Nicht alle schwefelhaltigen Substanzen konnten jed och die Bräunung inhibieren. So verstärkt z.b. Liponsäure die Bräunung sogar (Abb.6 B). Die Rolle von Aminoguanidin bei der Inhibition der Bildung von fluoreszie renden AGEs aus Dicarbonylzwischenprodukten oder spät eren Lipidoxdationprodukten wurde in Abschnitt beschrieben. Jedoch findet man in der Literatur keine Informationen über die Rolle von Aminogaunidin auf die Inhibition der Bräunung. Abbildung ( 6 B) zeigt, d ass Aminoguanidin ebenso wie Kreatin die Bräunung unter den angege benen Reaktionsbedingungen vers tärkt. Folglich konnten sie die letzte Phase der Maillard-Reaktion entweder nicht inhibieren oder sie bilden mit Carbonyl- oder Dicarbonylverbindungen Zwischenprodukte, die zu braunen Triazinen weiter reagieren 83. Lehman 103 schlag Semicarbazid als Inhibitor für die Maillard-induzierte Protein- vor. Die Ergebnisse in Abbildung (6 D) zeigten, dass es auch die Bräunung Quervernetzung inhibiert. Die Wirkung ist jedoch schwächer als die der Thiole oder von Sulfit. Obwohl Carnosin, Taurin und Arginin 103 als Inhibitoren für die AGE-Bildung oder Protein- inhibiert werden kann, verstärkt diese Verbindung die Quervernetzung wirken, konnten sie unter den hier gewählten Bedingungen die Bräunung nicht inhibieren (Abb.6 B). Möglicherweise weisen die Addukte von Inhibitor und Maillard- Zwischenprodukten eine braune Farbe auf. Obwohl durch die Reaktion von o-phenylendiamin mit α-dicarbonylverbindungen die AGE- Bildung sowie die Protein-Vernetzung Bräunung, was auf farbige Chinoxalinaddukte zurückgeführt werden könnte 103,116,117. EDTA inhibiert den oxidative Abbau der Ascorbinsäure und somit z.b. die Bräunung von Traubensaft 118. Jedoch zeigte es unter den gewählten Bedingungen nur eine schwache inhibitorische Wirkung auf die Bräunung. Pyridoxin und alle Vitamin B 6 Derivate wie Pyridoxal, Pyridoxal-Phosphat und Pyridoxamin können als Inhibitoren der Post-Amadori-Produkte, der Lipoxidation in vivo, der Bildung von fluoreszierenden AGEs, CML oder frühren Maillard-Zwischenprodukten wie Glyoxal oder Glycolaldehyd 68 wirken. Abbildung 6 D zeigt, dass Pyridoxin die Bräunung inhibieren kann, im Gegensatz zu Pyridoxamin, das cyklische Glyoxal- oder Glycolaldehyd-Pyridoxamin-Addukte bilden kann 108, die möglicherweise zu farbigen Produkte führen. 38

39 Lactose-Lysin-Mallird-Produkte Thiamin (Vitamin B1) und seine Derivate wie Thiaminpyrophosphat (TPP) und Thiaminmonophosphat (TP) können die AGE-Bildung in BSA/Glucose-Mischungen inhibieren 82. Abbildung (5 A) zeigt, dass Thiamin auch die Bräunung zurückdrängt. Es wurde gezeigt, dass einige Aminosäuren entweder die Bildung von mutagenen heterocyclischen Aminen (Tryptophan, Prolin) 101, die Protein-Quervernetzung (Arginin) 103 oder die Bräunung inhibieren. Die oben vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass in dem hier gewählten System diese Aminosäuren entweder keinen Einfluss auf die Bräunung haben (Prolin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure), oder sie sogar verstärken (Arginin, Tryptophan). Zimtsäure, Kojisäure und Benzoesäure-Derivate sind effektiv als Komplexmittel 119 oder Inhibitoren der Polyphenoloxidation und Mutagenbildung 8, zeigen jedoch unterschiedliche Wirkungen auf die nicht-enzymatische Bräunung. Kojisäure verstärkt im Gegensatz zur Acetylsalicylsäure die Bräunung (Abb.6 A, B), während Zimtsäure, trotz seiner Aktivität als Inhibitor der enzymatische Bräunung in Apfelsaft, keinen Einfluss auf die nicht-enzymatische Bräunung zeigt. Es wurde weiterhin die Wirkung der drei Konservierungsstoffe Kaliumsorbat, Natriumbenzoat und Natriumcitrat auf die Bräunung getestet. Hierbei ergab sich, dass zwei von ihnen, Kaliumsorbat und Natriumbenzoat, die Bräunung verstärken können, Natriumcitrat jedoch keinen Einfluss hat. Die Anwesenheit von Eisen (III)- und Kupfer (II)-Ionen spielt einen große Rolle bei der Zucker-Autoxidation, die zur AGE-Bildung führt, sowie bei Glycoxdations-reaktion. Die Ergebnisse in Abbildung (6 A) zeigen jedoch, dass eine weitere Zugabe dieser Ionen keinen Einfluss auf die Bräunung hat. Schließlich wurde versucht, mittels eines kompetitiven ELISAs mit polyklonalen anti-cml- Antikörpern die CML-Konzentrationen in einer erhitzten Lactose-Lysin-Mischung zu bestimmen, wobei die Bräunung in den Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen unterschiedlicher Inhibitoren verhindert wurde. Es wurde erwartet, dass die CML- Konzentration mit steigender Konzentration der Inhibitoren abnehmen würde. Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen jedoch, dass die CML-Konzentrationen schwanken, ohne dass ein deutlicher Einfluss der Inhibitoren auf die CML-Bildung erkennbar wäre. Es wurde vermutet, dass die Ursache der schwankenden CML-Konzentrationen eine Reaktion der nicht umgesetzten Testsubstanzen mit den CML-Antikörpern sein könnte. Aus diesem Grund wurde in den folgenden Experimenten die Versuche mit Zucker-Protein Maillard Lösungen wiederholt. 39

40 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte 4. Inhibition der Maillard-Reaktion von Lactose mit β- Casein 4.1. Eigenschaften des β-casein β-casein ist einer der Caseinfraktionen der Milch (α, β, χ, γ). Es macht % des Proteins der aus Milch und hat eine ähnliche Eigenschaften wie α S1 -Casein. Die Variante A2 besteht aus einer Peptidkette mit 209 Resten und einem Molekulargewicht von 24.5 kda. Die 5 Phosphoserinreste sind in den Positionen 1-40 lokalisiert, die darüber hinaus praktisch die gesamten ionisierbaren Reste des Moleküls enthalten. Die 5 Positionen enthalten dagegen vorwiegend Reste mit apolaren Seitenketten. Insgesamt ist die Struktur des Moleküls mit polaren Kopf und apolarem Schwanz als seifenähnlich zu bezeichnen. Aus CD- Messungen folgt, dass β-casein ca. 9% α-helix und ca. 25% β-struktur enthält. Temperatursteigerung führt zu einer Erhöhung der β-struktur auf Kosten des aperiodischen Anteils. Die Selbstassoziation ist endotherm. Das Protein ist mit Ca +2 bei den in der Milch vorkommenden Konzentrationen fällbar. Bei T 1 C ist es aber auch das Calciumsalz gut löslich. Abbildung 11: Aminosäuresequenz von bovinem β-caseinmilchprotein (Variante A2) 40

41 Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte 4.2. Bestimmung von CML in β-casein-lactose Maillard- Reaktionsmischung mittels kompetitivem ELISA Lactose-β-Casein Mischungen wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen von Natriummetabisulfit, dem effektivsten Bräungsinhibitor, für 30 Minuten bei 120 C erhitzt (Abschnitt 7.4.1). Die Proben wurden dialysiert und dann gefriergetrocknet. Aus den gefriergetrockneten Proben wurden Lösungen von 1mg/ml Protein in Wasser hergestellt. Diese Lösungen wurden für die CML-Bestimmung verwendet. Die CML-Bestimmung wurde, wie im Abschnitt beschrieben, durchgeführt. Die Platten wurden mit 0,5µg/ml CML-HSA belegt. Die noch freien Bindungsstellen der Vertiefung blockiert man mit fettarmer Milch. Dazu wurden dann gleichzeitig verdünnte Lösungen der Proben oder des CML-Standards und des CML-Antiserums gegeben. Dabei findet eine Konkorenzreaktion zwischen dem Antigen, mit dem die Platte belegt wurde, und dem CML-β-Casein der Proben um das zugegeben CML-Antiserum statt. Je höher die CML- Konzentration der Proben ist, desto geringer ist die Menge an ungebundenem Antiserum, das mit dem CML-HSA reagieren kann. Danach entfernt man das nicht mit dem CML-HSA gebunden Antiserum. Anschließend bindet ein Enzym gekoppelter sekundärer Antikörper an den ersten Antikörper. Nach Zugabe eines Leukofarbstoffes (TMB-Lösung) kann über eine Messung der Extinktion des gebildeten Farbstoffs die Menge des gebundenen Antikörpers sichtbar gemacht werden. Die Farbraktion kann mit einer verdünnten Schwefelsäure gestoppt werden. In Tabelle 5 sind CML-Gehalte der β-casein-lactos lard-reaktionsmischungen, die mittels kompetitivem ELISA bestimmt wurden, dargestellt. Man sieht, dass die CML-Konzentration in den β-casein-lactos lard-mischungen keine erkennbare Tendenz zeigte. In diesem Versuch kann jedoch ausgeschlossen werden, dass die zugesetzten Inhibitoren stören, da die Proben vor den ELISA-Messungen dialysiert wurden. Konzentration von Natriummetabisulfit Absorption (ABS 1 ) ABS 2 ABS 3 ABS 4 ABS 5 MW SD berechnete CML- Konzentration ng/ml 0mM 0,161 0,155 0,132 0,119 0,132 0,140 0, ,92 15mM 0,152 0,142 0,163 0,200 0,203 0,172 0, ,37 10mM 0,168 0,173 0,155 0,131 0,147 0,155 0, ,34 20mM 0,161 0,156 0,154 0,205 0,204 0,176 0, ,54 50mM 0,174 0,191 0,195 0,194 0,167 0,184 0, ,69 Tabelle 5: CML-Konzentration in β-casein-lactos lard Reaktionsmischungen, die in Anwesenheit unterschiedlicher Inhibitorkonzentrationen erhitzt wurden. CML wurde mittels kompetitivem ELISA unter Verwendung eines polyklonalenen Antikörpers bestimmt. 41

42 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte Im Folgenden wurde deshalb versucht, die ELISA-Bedingungen zu optimieren. Besonderes Augenmerk wurde zunächst auf das Protein gelegt, mit dem die Platte belegt wurde. Tabelle 6 zeigt die CML-Gehalte in den gleichen β-casein-lactose Maillard Reaktionsmischungen, die im letzten Versuch bereits vermessen worden waren. Für diese Versuche wurde der gleiche kompetitive ELISA verwendet, nur das hier die Platten mit 15µg/ml AGE-β Casein belegt wurden. Konzentration von Natriummetabesulfit Absorption (ABS 1 ) ABS2 ABS3 ABS4 MW SD Berechnete CML-Konzentration ng/ml 0 mm 0,164 0,202 0,183 0,183 0,183 0, ,42 5 mm 0,110 0,106 0,20 0,125 0,115 0, ,72 10 mm 0,120 0,150 0,151 0,200 0,155 0, ,75 20 mm 0, ,107 0,111 0,105 0, ,40 50 mm 0,084 0,098 0,098 0,113 0,098 0, ,24 Tabelle 6: CML-Bestimmung in β-casein-lactos lard Reaktionsmischungen, die in Anwesenheit unterschiedlicher Inhibitorkonzentrationen erhitzt wurden. CML wurde mittels kompetitivem ELISA unter Verwendung eines polyklonalenen Antikörpers bestimmt. Die Platten wurden dazu mit AGE-β Casein beleg. Erneut schwanken die CML-Werte, ähnlich wie bei den vorgehenden Messungen, wobei eine Tendenz nicht erkennbar ist. Dashalb wurde festgestellt, dass das Antigen, dies zur Belegung der Platten verwunendet wurde nicht die Ursache der Schwankung der CML-Werte war. Zur Bestimmung der CML-ß-Casein-Konzentration, wurde deshalb eine nicht-kompetitive ELISA-Methode verwendet CML-β-Casein Bestimmung mittels einer nicht-kompetitiver ELISA-Methode Prinzip des nicht-kompetitive ELISAs Beim nicht-kompetitiven ELISA handelt es sich um die einfachste Variante des ELISAs. Hierbei wird das Antigen auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Handelt es sich beim Antigen um ein Protein, kann es direkt eingesetzt werden, da Proteine unspezifisch an Kunststoffe binden. Ist das Antigen kein Protein, muss es an ein Protein gekoppelt werden, über das es somit an die Mikrotiterplatte gebunden wird. Freie Bindungsstellen am Kunststoff werden durch ein anderes Protein z.b. Magermilch blockiert, damit der anschließend zugegebene enzymmarkierte Antikörper nicht unspezifisch an die Platte binden kann. Die 42

43 Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte Farbreaktion zur Detektion wird durch Zugabe eines entsprechenden Substrates für das am Antikörper gebundene Enzym gestartet. Hierbei ist das erhaltene Signal direkt proportional zur Konzentration des Antigens. Eine Variante der Methode verwendet zwei Antikörper, wobei der erste nicht-enzymmarkierte Antikörper gegen das Antigen gerichtet ist. Der zweite Antikörper ist enzymmarkiert und erkennt spezifisch den ersten Antikörper. Dies kann durch eine erhöhte Signalintensität zu einer gesteigerten Empfindlichkeit führen, wenn der erste Antikörper in der Lage ist an mehr als einen der gegen ihn gerichteten enzymmarkierten Antikörper zu binden. Ergebnisse Die gleichen Proben, die für die CML-Bestimmung mittels kompetitivem ELISA (Abschnitt 7.4.2) verwendet wurden, werden mittels nicht-kompetitivem ELISA untersucht. Die Ergebnisse sind in Abbildung 12 dargestellt. ABS 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0, Konzentration von Natriummetabisulfit (mm) Abbildung 12: Die Abhängigkeit der Absorption bzw. CML-Konzentration und Natriummetabisulfit Konzentration in Lactose-β-Casein-Maillard-Mischungen. CML wurde mittels nicht- kompetitivem ELISA unter Verwendung eines polyklonalenen Antikörpers bestimmt. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SD v on vier Messungen darge stellt. Die Abbildung macht deu tlich, dass die Absorption bzw. die CML-Konzentration mit steigender Inhibitorkonzentration ebenfalls s teigt, wa s im Gegens atz zur Erwartung steht, dass Natriummetabisulfit die Bildung v on späten Maill ard Produkten inhi biert. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die Inhibition der Bräunung durch Umwandlung von Amadori-Produkten in CML erfolgt. Das Amadori-Produkt kann als Ausgangverbindung für farbige Melanodine fungieren, während das CML ein farbloses Endprodukt darstellt. 43

44 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde der Einfluss von Aminoguanidin auf die CML- Konzentration in den Lactose-β-Casein-Maillardmischungen mittels nicht-kompetitivem ELISA getestet. Aminoguanidin inhibiert die CML-Bildung 120, aber nicht die Bräunung (Abb.6 B). Dazu wurde eine Lactose-β-Casein Maillardmischung ähnlich wie in den vorhergehenden Versuchen hergestellt, mit dem Unterschied jedoch, dass Aminoguanidin statt Natriummetabisulfit zur Inhibition verwendet wurde. Die folgende Abbildung zeigt die Relation zwischen die Absorption bzw. die CML- und der Aminoguanidin-Konzentration. 1,2 ABS 0,8 0, 4 0, Konzentration von Aminoguanidin (mm) Abbildung 13: Die Absorption bzw. CML-Konzentration in einer Lactose-β-Casein-Maillard- die mit steigende Konzentration an Aminoguanidin erhitzt worden war. CML wurde mittels Mischung, nicht-kompetitivem ELISA unter Verwendung eines polyklonalenen Antikörpers bestimmt. Die Ergebnisse wurde als Mittelwerte ± SD von vier Messungen dargestellt. Die Versuche führten ebenfalls zu keinem eindeutigen Ergebnis. Es konnte jedoch ausgeschlossen werden, dass dies auf Probleme mit der ELISA-Methode zurückzuführen ist, da zwei unterschiedliche Testsysteme verwendet wurden. Die Ergebnisse sind höchst wahrscheinlich jedoch auch nicht auf eine Umwandlung des Amadori-Produkts in CML rückzuführen, da die zu erwartende Inhibition der CML-Bildung durch Aminoguanidin nicht beobachtet wurde. Eine weitere mögliche Ursache für die steigende Absorption nach Zusatz von Natriummetbisulfit wäre, dass der Inhibitor während des Erhitzens mit β-casein ein Epitop bildet, mit dem der CML-Antikörper kreuzreagiert. 44

45 Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte 4.4. Untersuchung einer möglichen Kreuzreaktion des CML- Antikörpers mit β-casein Sulfit-Addukten β-casein Natrimummetabisulfit-Mischungen wurden mit oder ohne Lactose für 30 Minuten bei 120 C erhitzt, dialysiert und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in bi-destelliertem Wasser in einer Konzentration von 1mg/ml gelöst. Die CML-Gehalte der Proben wurden mittels nicht kompetitivem ELISA, wie unter Abschnitt 4.2 beschrieben, untersucht. Die Ergebnisse sind in Abb.12 dargestellt. 1,2 0,9 ABS 0,6 0,3 0, Konzentration von Natriummetabisulfit (mm) Abbildung 14: CML-Bestimmung mittels nicht kompetitiven ELISA in β-casein Reaktions- Mischungen, die in Anwesenheit von Natriummetabisulfit mit oder ohne Lactose erhitzt wurden. β -Casein erhitzt mit Lactose und Natriummetabisulfit β Casein erhitzt mit Natriummetabisulfit ohne Lactose Differenz der beiden Messwerte Die Ergebnisse wurde als Mittelwerte ± SD von vier Messungen dargestellt. Die Absorption bzw. die Konzentration an CML in den β-casein-maillardmischungen steigt im Gegensatz zu den β-caseinlösungen, die in Abwesenheit von Lactose erhitzt wurden, mit steigender Konzentration von Natriummetabisulfit. Die CML-Konzentration von β-casein- Maillardmischung steigt entsprechend, wenn die CML-Konzentration von erhitztem ß-Casein als Negativ-Kontrolle abgezogen wird. Diese Ergebnisse, insbesondere die der Proben ohne Zuckerzusatz, beweisen, dass Sulfitionen Proteinaddukten bilden, die mit dem Antikörper kreuzreagiert. Möglicherweise findet ein Abbau des glykierten Proteins statt, wobei das abgebaute Casein dann durch die Dialyse aus der Lösung entfernt werden würde. Eine weitere Möglichkeit wäre, dass der Zusatz von Natriummetabisulfit tatsächlich zu einer erhöhten CML-Bildung führt. Um diese Hypothese zu testen, wurde in den Proben ein weiteres spätes Maillard-Produkt, das Imidazolon, mittels ELISA bestimmt. 45

46 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte 4.5. Inhibition der Imidazolon-Bildung in Lactose-β-Casein- Maillardmischungen Prinzip des kompetitiven Imidayolon-ELISAs Die Imidazolon-Bestimmung wurde, wie im Abschnitt beschrieben, durchgeführt, wobei die Platten mit 0,5µg/ml Imidazolon-HSA belegt wurden. Die noch freien Bindungsstellen der Vertiefung blockiert man mit unmodifiziertem Protein (fettarmer Milch). Darauf hin wurden gleichzeitig verdünnte Lösungen der Proben oder des Standards und ein monoklonaler anti- Imidazolon-Antikörper dazu gegeben. In diesem Schritt findet eine Konkurenzreaktion zwischen dem Antigen, mit dem die Platten belegt wurden und dem Imidazolon-β-Casein der Proben um den zugegeben Antikörper statt. Je höher die Imidazolon-Konzentration der Proben ist, desto weniger Antikörper liegt frei vor und kann an dem Imidazolon-HSA binden. Anschließend entfernt man den nicht mit dem Imidazolon-HSA gebunden Antikörper und detektiert diesen mit einem Enzym markierten zweiten Antikörper. Nach Zugabe eines Leukofarbstoffes (TMB-Lösung) kann über eine Messung der Extinktion des gebildeten Farbstoffs die Menge des gebundenen Antikörpers sichtbar gemacht werden. Die Farbreaktion kann mit einer Schwefelsäurelösung gestoppt werden. Imidazolonbestimmung Lactose-β-Casein Mischungen wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen von Natriummetabisulfit, dem effektivsten Inhibitor der Bräunung, für 30 Minuten bei 120 C erhitzt (Abschnitt 7.4.1). Die Proben wurden dialysiert und dann gefriergetrocknet. Aus den gefriergetrockneten Proben wurden Lösungen von 1mg/ml Protein in Wasser hergestellt. Bei den Lösungen handelt es sich um die gleichen Proben, bei denen auch CML bestimmt wurde. In Abbildung 15 wird die Absorption bzw. die Konzentration von Imidazolon in Abhängigkeit von der Natriummetabisulfit-Konzentration in der Lactose-β-Casein-Mischung dargestellt. 46

47 Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte 1,5 1,2 ABS 0,9 0,6 0, Konzentration von Natriummetabisulfit (mm) Abbildung.15: Imidazolonbestimmung mittels kompetitiven ELISA in β-casein Reaktions- Mischungen, die in Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen an Natriummetabisulfit mit Lactose erhitzt wurde. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SD von vier Messungen dargestellt. Auch die Versuche zeigte keine inhibitorsche Wirkung von Natriummetbisulfit auf die Imidazolonbildung. Die Imidazolonbildung wurde ebenfalls in den Proben gemessen, die unter Zusatz von Aminoguanidin erhitzt wurden. 0,6 0,4 ABS 0, Aminoguanidinkonzentration (mm) Abbildung 16: Imidazolonbestimmung mittels kompetitiven ELISA in β-casein Reaktions- Mischungen, die in Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen an Aminoguanidin mit Lactose erhitzt wurde. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SD von vier Messungen dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Zusatz von Aminoguanidin keinen deutlichen Einfluss auf die Imidazolonbildung hat. Die Abbildungen 12, 13, 15 und 16 zeigen, dass die unerwarteten Ergebnisse nicht auf die Art des Inhibitors oder die eingesetzte Antikörper zurückzuführen ist. Eine Erklärung wäre. Weiterhin ein Abbau des glykierten Proteins stattfindet und das abgebaute Casein würde dann durch die Dialyse aus der Lösung entfernt werden. 47

48 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte 4.6. Untersuchung der β-casein-lactose Maillard-Mischung mittels MALDI-TOF- MS Prinzip der MALDI-TOF-MS Spectrometry / Matrix-unterstützte Laserdesorptions / Ionisations-Flugzeit- Massenspektrometrie) ist eine relativ neue Analysenmethode, entwickelt zur Messung der Molmasse von chemischen Verbindungen, die durch herkömmliche Massenspektrometer nicht oder nur sehr schwer zu bestimmen sind. Zu diesen Verbindungen gehören z.b. thermisch labile Polymere oder schwerflüchtige Substanzen. Es handelt sich bei dieser Methode um eine Weiterentwicklung der für massenspektrometrische Untersuchungen Die MALDI-TOF-MS (Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-Of-Flight-Mass- genutzten Laser Desorption. Der ursprüngliche Anwendungsbereich der MALDI-TOF-MS 121,122 waren Proteine, glykierte Proteine und andere Polymere kamen später hinzu. Die Probe wird auf einem Probenteller mit einer Matrix cokristallisiert und durch Laserbeschuss in die Gasphase desorbiert. Durch Protonenübertragung von Matrix-Molekülen auf die Proteine/Peptide entstehen Protein-/Peptidionen, die in einem elektrischen Feld beschleunigt werden. Durch Messung der Flugzeit der Ionen auf einer Driftstrecke lässt sich auf die Masse der erzeugten Protein-/Peptidionen zurückschliessen 123. Mittels MALDI-TOF-MS Messungen kann man nicht nur die Reinheit eines Proteins sondern auch sein relatives Molekulargewicht bestimmen. Das bedeutet, dass kleine Veränderungen im Molekulargewicht, z.b. durch Addukte, die durch die Reaktion mit Lactose entstehen, ermittelt werden können MALDI-TOF-MS Massungen des nativen β-caseins nach partieller enzymatischer Hydrolyse Es wurde ein MALDI-TOF-Massenspektrum des nativen β-caseins nach Hydrolyse mit Glu- C, wie unter Abschnitt ,3 beschrieben, durchgeführt. Unter den angewendeten Bedingungen spaltet die Endoproteinase Glu-C hochspezifisch Peptid-Bindungen C-terminal zu den Aminosäuren Glutaminsäure und Asparaginsäure. Da die Auflösung der MALDI- TOF-MS Spektren mit abnehmender Masse steigt, kann somit eine verbesserte Auflösung erreicht werden. Die Massen der Peptide, die durch eine Datenbankrecherche erhalten wurden (Tabelle7), wurden mit den Signalen des erhaltenen Massenspektrums (Abb.17) vergleichen. 48

49 Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte Abbildung 17: MALDI-TOF- Massenspektrum des nativen β-caseins nach Hydrolyse mit Glu-C. Durch die Datenbankanalyse kann den gefundenen Peptiden die Aminosäure Sequenz zugeordnet werden. Nachdem Lactose Hauptsächlich mit Lysin und Argeninresten reagiert, sind für diese Arbeit vor allem Peptide interessant, die eine dieser beiden Aminosäuren enthalten. In früheren Arbeiten war bereits gezeigt worden, dass durch die Reaktion mit Lactose und Lysin und Arginin vor allem die späten Maillard-Produkte CML bzw. Imidazolon gebildet werden 124,125. Die Reaktion von Lactose und einer Lysinseitenkette eines Proteins, könnte sich ein Amadori-Produkt mit einer Massendiffernz von Da oder CML, mit einer Massenzunahme von 58 Da bilden. M=324 Da M=58 Da Die Anwesenheit von Arginin im Protein könnte zur Imidazolonbildung führen, wobei die Massenänderung den Wert +144 erreicht. Protein-R-Protein Protein-R-Protein Lactose Hydrolyse Glucose Galactose NH NH HN C NH 2 N NH O C 4 O 3 H 9 Imidazolon M=144 Da Diese Änderungen der Masse der Proteinfragmente sollte mittels MALDI-TOF Messung des glykierten Proteins nachgewiesen werden können. 49

50 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte theoretische gefundene Modifikation Masse (Da) Masse (Da) Phos: Phos: Phos: Phos: 30, 32,33, Phos: 30, 32,33, Phos: 30, 32,33, Phos: 30, 32,33,34 Peptidsequenzen KFQSEE LEELNVPGE SITRINKKIE KFQSEEQQQTE KFQSEEQQQTE KFQSEEQQQTEDE LEELNVPGEIVESLSSSEE IVESLSSSEESITRINKKIE RELEELNVPGEIVESLSSSEE SITRINKKIEKFQSEEQQQT EDE IVESLSSSEESITRINKKIE KFQSEE RELEELNVPGEIVESLSSSE ESITRINKKIE Tabelle 7: Die theoretisch ermittelten und mit MALDI-TOF-MS gefundenen Massen der Proteinfragmente des nativen β-caseins nach Hydrolyse mit Glu-C Theoretisch zu erwartende Peptidfragmente des mit Lactose erhitzten β-caseins Wie in der Tabelle 8 dargestellt, kann errechnet werden, welche Peptidfragmente aus dem mit Lactose erhitzten Casein zu erwartet sind, wenn die Modifikationen Lactulosyllysin, CML, und Imidazolon zugelassen wurde. Diese kann man mit den gefundenen Massen der MALDI- Messung vergleichen. Wenn ein Proteinfragment mit einer Masse von 827 Da, das nur einen Lysinrest enthält, mit Lactose reagiert, erwartet man bei einer MALDI-Messung drei Signale. Den ersten für die Masse des Poteinfragments selbst (827 Da), den zweiten für das Amadori Produkt (1152 Da) und den dritten für das CML-Addukt (886 Da). Enthält ein Proteinfragment jedoch mehrere Lysin- und/oder Argininreste, die mit Lactose reagieren könnten, erwartet man bei der MALDI-Messung mehrere Signale. Die Anzahl der Signale ist zirka doppelt so hoch wie die Anzahl an Lysin- und Arginin-Resten. Im Allgemeinen erwartet man bei glykiertem β-casein ein komplexes MALDI- TOF-Spektrum 50

51 Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte natives Peptid (Da) Peptidsequenz Amadori-Produkt ( M=324 Da) CML ( M=58 Da) KFQSEE Imidazolon ( M=144 Da) SITRINKKIE KFQSEEQQQTE KFQSEEQQQTE KFQSEEQQQTEDE IVESLSSSEE SITRINKKIE RELEELNVPG EIVESLSSSE E SITRINKKIEKF QSEEQQQT EDE IVESLSSSEESITR INKKIE KFQSEE RELEELNVPGEIVES LSSSE ESITRINKKIE mehrere CML und Imidazolon-Addukte 1318 (2CML) 1404 (CML+Im.) 1462 (2CML+Im.) 2398 (2CML) 2484 (CML+Im.) 2542 (2CML+Imm.) 2941 (2CML) 2999 (3CML) 3027 (CML+Im.) 3085 (2CML+Im.) 3143 (3CML+Im.) 3142 (2CML) 3200 (3CML) 3228 (CML+Im.) 3286 (2CML+Im.) 3344 (3CML+Im.) 3933 (2CML) 4105 (2Im.) 4019 (CML+Im.) 4077 (2CML+Im.) 4163 (CML+2Im.) Tabelle 8: Die theoretisch zu erwartende Peptidfragmente des mit Lactose erhitzten β-caseins uter Berucksichtigung von Amadori-Produkte, CML und Imidazolonbildung MALDI-TOF-MS-Analysen des nativen und glykierten β-caseins nach partieller enzymatischer Hydrolyse In der Abbildung 18 sind sowohl die MALDI-TOF-Spektren des nativen als auch des glykierten β-caseins dargestellt, wobei das letztere in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen an Natriummetabisulfit erhitzt worden war. Die Proben wurden, wie im Abschnitt 7.10 beschrieben, vorbereitet. Die Proteine wurden vor den Messungen mit MALDI-TOF-MS partiell enzymatisch hydrolysiert. 51

52 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte Abbildung 18: MALDI-TOF-Massenspektren nativem β-casein (1), β-casein, welches ohne (2) bzw. in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Natriummetabisulfit 5mM (3); 10mM (4); 20mM (5); 50mM (6) mit Lactose erhitzt wurde. Das Spektrum des nativen β-caseins zeigt zusätzlich zu den theoretisch erwarteten Peptiden, Signale, die wahrscheinlich auf genetische Varianten des β-caseins zurückzuführen sind. Für das Spektrum des β-caseins, das ohne Zusatz des Inhibitors glykiert wurde, erwartet man ein komplexes Spektrum mit vielen Peptidsignalen, findet jedoch ein einfaches Spektrum (Spektrum 2 der Abbildung 18) mit nur zwei Peptidsequenzen. Ein ähnliches Bild ergibt sich für die Spektren von β-casein, das in Anwesenheit des Inhibitors Natriummetabisulfit (5, 10, 20, 50 mm) glykiert wurde (Spektren 3-6). Die Anzahl der Signale nimmt dabei, entgegen der Erwartung, mit zunehmender Inhibitor-Konzentration zu. Weiterhin ist auffällig, dass in allen erhitzten Proben die Signalintensität gegenüber dem nativen Casein stark zurückgeht. Tabelle 9 zeigt einen Vergleich zwischen den theoretisch erwarteten (Tabelle 8) und den tatsächlichen gefundene Signalen (Abb.18). welcher die nativen Peptide noch Amadori-, CML-, oder Imdazolonaddukte konnten in diesen Proben nachgewiesen werden. 52

53 Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte theoretisch erwartete Signale (Da) gefundene Signale (Da) Tabelle 9: Vergleich zwischen den theoretisch erwarteten und den tatsächlichen gefundenen Signalen von β-casein, welches ohne bzw. in Anwesenheit verschiedener Konzentrati onen von Natriummetabisulfit 5 mm; 10 mm; 20 mm; 50 mm mit Lactose erhitzt wurde. Um diesem Phänomen weiter nach zu gehen, wurden Spektren unverdaute Reaktions- Mischungen, die mit Lactose und unterschiedlicher Inhibitorkonzentrationen erhitzt worden waren, aufgenommen MALDI-TOF-MS-Analyse von intaktem nativem und glykiertem β- Casein In der folgenden Abbildung sind die MALDI-TOF Spektren des intakten β-caseins dargestellt, wobei die Proben, wie unter Abschnitt 7.10 beschrieben, behandelt worden waren. Man erkennt im ersten Spektrum des unerhitzten β-caseins ein Signal bei 24 kda, welches dem β-casein entspricht, und ein Signal bei etwa 20 kda, das durch ein Fragment des β- Caseins hervorgerufen wird. Beim Spektrum des glykierten β- Caseins erwartet man zusätzlich zum Signal des β-caseins ein Signal mit einer Masse höher als 24 kda, das zum glykierten β-casein gehört. Bei Spektren der anderen Reaktionsmischungen, zu denen Inhibitor zugesetzt wurde, sollte das Signal für glykiertes β Casein wieder zu gunsten des unmodifizierten β-caseins zurückgedränkt sein. Allerdings konnte in keinen der Spektren der erhitzten Caseinlösung ein Protein detektiert werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass β- Casein während der Hitzeeinwirkung abgebaut wurde. 53

54 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte Abbildung 19: MALDI-TOF-Massenspektren von unverdautem β-casein. Vergleich von nativem (1) mit β-casein, das ohne (2) oder mit verschiedenen Konzentrationen von Natriummetabisulfit 5mM(3); 10mM (4); 20mM (5); oder 50mM (6) in Anwesenheit von Lactose erhitzt worden war. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Proteinzusammensetzung in den Reaktionsmischungen mittels Gelelktrophorese untersucht Einfluss der Reaktionsbedingung auf den Lactose-induzierten Abbau von β-casein Einfluss der Temperatur und der Erhitzungsdauer auf den Proteinabbau in Anwesenheit des Zuckers In weiteren Versuchen wurde getestet, ob die Temperatur und die Erhitzungsdauer in Anwesenheit des Zuckers einen Einfluss auf den Proteinabbau haben. Diese Untersuchungen sollten dazu den Proteinabbau während des Erhitzungsprozesses in Lebensmitteln besser verstehen zu können. Dafür wurden folgende Proben vorbereitet: 1-1mg/ml β-caseinlösung (in 0,1M PBS; ph=6,8) 2-1mg/ml ohne Zuckerzusatz erhitzte β-caseinlösung (in 0,1 M PBS; ph=6,8) 3- Eine Mischung von 1mg/ml β-caseinlösung mit 0,1M Lactose (in 0,1M PBS; ph=6,8) wurde ohne Inhibitorzusatz erhitzt 4- Mischung 3 wurde in Anwesenheit von 5 mm Na 2 S 2 O 5 erhitzt 54

55 5- Mischung 3 wurde in Anwesenheit von 10 mm Na 2 S 2 O 5 erhitzt 6- Mischung 3 wurde in Anwesenheit von 20 mm Na 2 S 2 O 5 erhitzt 7- Mischung 3 wur de in Anwesenhe it von 50 mm Na 2 S 2 O 5 erhit zt Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte Die Proben wurden unter Variation der Reaktionszeit un d Temp eratur erhitzt. Die Reaktionsmischungen wurden dan n mittels SDS-PAGE untersucht. Die Ergebniss e sind in der Abbildung 20 darge stellt. I n der Abbildung 20A, in der Gel der das Proben, die für 30 Minuten bei 120 C erhitzt wurden, dargestellt sind, sieht man nur eine Bande des unerhitzten β-caseins (Probe1) und eine etwa schwächere β-casein-bande in der Probe (Probe 7), die in Anwesenheit von 50 mm Natriummetabisulfit glykiert wurde. Daraus kann man schließen, dass die hohen Temperaturen zum Proteinabbau der glykierten Proben führen können, und wobei Natriummetabisulfit den Proteinabbau verhindern teilweise konnte. Die Gele in Abbildung 20 B bis D zeigen weiterhin, dass der Abbau des Geiseins Praktisch nur in Anwesenheit der Lactose Stattfindet (A) β - Casein -Lactose- Mischungen wurden bei 120 C (B) β - Casein- Lactose- Mischungen wurden bei 80 C Stunden 30 Minuten erhitzt für 24 Stunden erhitzt (C) β -Casein-Lactose-Mischungen wurden bei 80 C (D) β -Casein-Lactose-Mischungen wurden bei 50 C für 6 Stunden erhitzt für 14 Tage erhitzt Abbildung 20: Einfluss der Temperatur und der Erhitzungsdauer auf den β-caseinabbau nach Reaktion mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natriummetabisulfut in Anwesenheit von Lactose. Die Bandennummer bezieht sich auf die in Abschnitt eingeführte Proben Bezeichnungen. 55

56 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte In der Abb. 20 B sind die Gele der Reaktionsmischungen dargestellt, die bei 80 C für 24 Stunden erhitzt wurden. Bei diesem erscheint nicht nur das native β-casein, sondern auch das β-casein in den Proben fünf und sechs, die mit 10 und 20 mm des Inhibitors glykiert wurden. Allerdings waren die Banden nicht deutlich. Dies bedeutet, dass bei niedriger Temperatur der Proteinabbau abnimmt. Der Abbau des glykierten β-caseins wird weiterhin verringert, wenn man die Proben nur für 6 Stunden bei 80 C erhitzt (Abb.20 C). Bei einer niedrigeren Temperatur (50 C) führt erst eine lange Inkubationszeit von 14 Tagen zu einem deutlichen Proteinabbau. Demnach wird durch Zusatz des Inhibitors, niedrigen Temperaturen und kürzere Erhitzungsdauer der Abbau des glykierten β-caseins verringert, kann jedoch nicht vollständig verhindert werden. Zusammenfassend konnte mit Hilfe der Gelelektrophorese bestätigt werden, dass in den erhitzten β-caseinlösungen ein Proteinabbau stattgefunden hatte. In keinen dieser Mischungen konnte eine Bande detektiert werden (Abb.20) Einfluss der Zuckerart auf den Proteinabbau von glykiertem β- Casein In den nächsten Experimenten wurde untersucht, ob der Proteinabbau selektiv durch die Reaktion mit Lactose hervorgerufen wird, oder ob auch andere Zucker diese Effekte hervorrufen können. Um diese Frage zu beantworten, wurde der Abbau des β-caseins durch Ribose während der Erhitzung in Abwesenheit und Anwesenheit von Nartriummetabisulfit als Inhibitor getestet β-casein-ribose-mischungen wurden bei 80 C für 3 Stunden erhitzt. Abbildung 21: Abbau von β- Casein während der Glykierung mit Ribose in Anwesenheit oder Abwesenheit von Natriummetabisulfit. Die Probenbezeichnug entspricht der unter Abschnitt 4.7.1, wobei Lactose durch Ribose ersetzt wurde 56

57 Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte In Abbildung 21 ist ein SDS-PAGE Gel einer Reaktionsmischung, in der eine Ribose β- Casein Mischung für 3 Stunden bei 80 C erhitzt wurde. In den Reaktionsmischungen, denen kein Inhibitor zugesetzt worden war, konnte kein β- Casein detektiert werden. Der Proteinabbau konnte durch den Zusatz von Natriummetabisulfit konzentrationsabhängig inhibiert werden. Der Abbau von β-casein wurde sowohl in den Reaktionsmischung beobachtet, die mit Ribose als auch mit Lactose erhitzt worden waren. Der Effekt war stark abhängig von der Reaktionszeit und Temperatur. Der Proteinabbau konnte in beide Mischungen konzentrationsabhängig vollständig oder teilweise durch Zusatz von Natriummetabisulfit inhibiert werden Untersuchung zur Stabilität anderer Protein-Zucker- Modellsysteme Wegen der Instabilität von β-casein in Anwesenheit von Zuckern ist dieses Protein nicht geeignet, um di CML-Bildung mittels ELISA zu bestimmen. Deshalb wurden weitere Versuche durchgeführt, um ein Protein-Zucker Modellsystem zu finden, in dem das glykierte Protein stabil bleibt. Dabei wurden verschiedene Reaktionsmischungen untersucht, die in Tabelle 9 beschrieben sind. Die Protein-Zuckermischungen wurden in PBS-Puffer (0,1M; ph 6,8) gelöst und unterschiedlich lang mit verschiedenen Konzentrationen an Natriummetabisulfit erhitzt. Aus Tabelle 10 geht hervor, dass das glykierte BSA (7 Tage Inkubation bei 50 C) sowie das glykierte β-casein (Ab und 3.7.2) unabhängig von der Zuckerart abgebaut wurden. Die Abbaurate war jedoch abhängig von der Erhitzungsdauer und der Inhibitorkonzentration. Bei Verwendung von Lysozym, α-lactalbumin, β-lactoglobulin oder BSA (bei hoher Inkubationstemperatur) wurden die Proteine ausgefällt. Die ph-werte der Proben wurden vor und nach der Inkubation gemessen, wobei keine bedeutende Änderung beobachtet wurde, die zur Denaturierung des Proteins geführt haben könnte. 57

58 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte Protein Zucker Temperatur Erhitzungs- Dauer Beobachtung α-lactalbumin 20 mg/ml Lactose 25 C 2 Stunden Zusatz des Inhibitors führt zur Präzipitätion des Protein β-lactoglobulin 20 mg/ml Lactose 50 C 3 Stunden trübe Lösung bei allen Proben 70 C 3 Stunden das Protein fällt in allen Proben aus Ribose Lysozym oder 100 mg Lactose 100 mm 120 C 5 Minuten 70 C 4 Stunden 50 C 7 Tage das Protein fällt in allen Lösungen aus der Niederschlag ist braun Das Protein fällt in allen Lösungen aus der Niederschlag ist braun Das Protein fällt in allen Lösungen aus der Niederschlag ist braun BSA 10mg/ml Ribose oder Lactose 100 mm Trübung der Proben, die ohne Zuckerzusatz unter Zusatz von 120 C 5 Minuten 50mM des Inhibitors erhitzt wurden. in allen Proben, denen Zucker zugegeben wurde, fällt das Protein aus 70 C 4 Stunden Trübung bei den Lösungen der Proben, die ohne Zuckerzusatz erhitzt wurden. In allen glykierten Proben fällt das Protein aus 50 C 7 Tage Proteinabbau in allen glykierten Proben Tabelle 10: Stabilität unterschiedlicher Protein-Zucker Maillard-Mischungen Zusammenfassung und Diskussion Aufgrund der effektiven Inhibitorwirkung von Natriummetabisulfit auf die Bräunung einer Lysin-Lactosemischung wurde erwartet, dass dieser Inhibitor auch die CML-Bildung verringert. Wurde jedoch β-casein mit Lactose in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen an Natriummetabisulfit erhitzt und CML mittels kompetitiven ELISA bestimmt, wurde dieser Effekt nicht beobachtet. Die Werte schwankten viel mehr ohne erkennbaren Trend um den CML-Gehalt der nicht inhibierten Probe. Dieses Ergebnis war 58

59 Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte unabhängig davon, ob CML-HSA oder CML- β-casein zur Belegung der ELISA-Platten verwendet wurde. Deshalb wurde weiterhin eine nicht-kompetitive ELISA-Methode getestet, um die CML- Konzentrationen in den erhitzten Lactose-β-Casein-Proben zu bestimmen, zu denen unterschiedliche Konzentrationen an Natriummetabisulfit und Aminoguanidin als Inhibitoren zugesetzt wurden. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigten, dass die gemessene CML- Konzentration mit steigender Inhibitorkonzentration in beiden Fällen zunimmt. Dieses Ergebnis ist den Erwartungen entgegengesetzt und schwer erklärbar. Deshalb wurde getestet, ob sich durch die Reaktion von Natriummetabisulfit mit β-casein ein Epitop bildet, das mit dem CML-Antikörper kreuzreagiert. β-casein wurde deshalb mit Natriummetabisulfit in Anwesenheit und Abwesenheit von Lactose erhitzt. Der CML-Gehalt in den Proben wurde durch das nicht kompetitive ELISA Verfahren bestimmt. In Abwesenheit von Zuckern war jedoch praktisch kein CML nachweisbar, das heißt dass aus Sulfit kein Epitop gebildet wurde, das mit dem CML- Antikörper kreuzreagiert. Um weiter zu untersuchen, ob die schwankenden CML-Konzentrationen, die in den Proben mit Lactose und Inhibitor gemessen wurden, ein Effekt ist, der auf den Antikörper zurück zu führen ist, wurden in den gleichen Proben die Imidazolonkonzentrationen mit Hilfe eines kompetetiven ELISA gemessen. In diesen Proben wurden sowohl Natriummetabisulfit als auch Aminoguanidin als Inhibitor eingesetzt. Die Imidazolonbestimmung führte zu ähnlichen Messergebnissen, wie die CML-Messungen. Da bekannt ist, dass Aminoguanidin die Bildung von CML und Imidazolon inhibiert 126, wurde angenommen, dass andere unspezifische Effekte auftreten, die die AGE-Messungen störten. Um zu überprüfen, ob tatsächlich erhöhte CML-Konzentrationen durch Erhitzung in Anwesenheit von Natriummetabisulfit gebildet wurden, wurde eine alternative Methode angewendet, um die Bildung von protein-gebundenen Glykierungsprodukten zu detektieren. Nachdem in unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden konnte, dass die Analytik von proteingebundenen Maillard-Produkten mittels MALDI-TOF-MS möglich ist 127,128, wurde diese Methode zur Untersuchung des glykierten Proteins durchgeführt. Dazu wurde β-casein, mit Lactose und verschiedenen Konzentrationen an Natriummetabisulfit als Inhbitor der Bräunung für 30 Minuten sterilisiert. So erhielt man unterschiedlich stark modifiziertes AGEβ-Casein. Nach der Dialyse der Proben und anschließende partielle Hydrolyse mit der Endoproteinase Glu-C wurden MALDI-TOF-Massenspektren aufgenommen. Die 59

60 Lactose-β-Casein-Maillard-Produkte entstandenen Peptidfragmente wurden mit denen von unmodifiziertem, nativen β-casein - um eventuell auftretende Signale, die durch den Selbstverdau des Enzyms hervorgerufen werden, zu erfassen - sowie mit denen, die durch einen theoretischen Verdau in einer Protein- Datenbank (Peptide Mass; y.com) ermittelt wurden, verglichen. Damit können eindeutige Aussagen über die chemische Natur der Modifizierung und über die Glykierungsstelle im Proteinmolekül gemacht werden. Es ist zu erwarten, dass bei der Analyse von glykierten Proteinen mittels MALDI-TOF- MS nach partieller enzymamatischer Hydrolyse durch das Auftreten von nativen und glykierten Peptide mehr Signale detektiert werden. Die Spektre n des glykierten β-caseins zeigten jedoch praktisch keine Peptidfragmente im Gegensatz zum nativen Protein. Eine Erklärung dafür wäre, dass die Glykierung den Proteinabbau fördert. Peptidfragmente würden bei der angewendeten Auf Arbeitung während des Hydrolyseschrits abgetrennt. Diese Hypothese wurde durch MALDI- Messungen des unverdauten nativen und glykierten β- Caseins bestätigt. In den Spektr en des nativen β-c aseins konnte das Protein bei einer Masse von 24 kda detektiert werden. Im Gegensatz dazu konnte in den glykierten Proben kein Proteinsignal gefunden werden. Bei den Proben, denen hohe Konzentrationen an Natriummetabisulfit zugegeben wurden, findet man in den MALDI-TOF-Spektren mehr Signale, was darauf hin deutet, dass der Inhibitor dem Proteinabbau entgegenwirkt. Um zu bestätigen, dass die Proteinglykierung tatsächlich zu einer Proteinfragmentierung führt, wurden die Reaktionsmischungen zusätzlich mittels Gelelektrophorese (SDS-PAGE) untersucht. Dabei zeigte sich, dass die β- Casein-Ban de nach der Reaktion mit Lactose oder Ribose deutlich schwächer wird, bzw ganz verschwindet. Die Erhöhung der Reaktiontemperatur bzw. die Verlängerung der Reaktionszeit, verstärkt den Abbau des Proteins. Der β-caseinabbau führte jedoch nicht zum Erscheinen einer neuer Proteinbande. Der Proteinabbau führt vermutlich zur Bildung von Peptiden, die durch den Dialyseschritt während der Probenvorbereitung entfernt werden. Eine andere Erklärung für diese Beobachtung ist, dass die Glykierung von β- Casein zu einer unspezifischen Fragmentierung des Proteins führt. Der β-caseinabbau konnte konzentrationsabhängig durch den Zusatz von Natriummetabisulfit inhibiert werden. Wegen der Instabilität von β-casein in Anwesenheit von Zuckern ist dieses Protein nicht geeignet, um CML mittels ELISA zu bestimmen. Deshalb wurden weitere Versuche durchgeführt, um ein Protein-Zucker Modellsystem zu finden, in dem das glykierte Protein stabil bleibt. Dabei wurden verschiedene Reaktionsmischungen wie Lactose oder Ribose und 60

61 Lactose-β-Casein-Mallird-Produkte α-lactalbumin, β-lactoglobulin, Lyzozym oder BSA, untersucht. Die Protein-Zucker- Mischungen wurden unterschiedlich lang mit verschiedenen Konzentrationen an Natriummetabisulfit erhitzt. Bei den erhitzten Lactose-Lysozym, -α-lactalbumin, -β- Lactoglobulin oder -BSA Lösungen stellte man jedoch fest, dass bei hoher Inkubationstemperatur das Protein ausgefällt wurde. Das glykierte BSA (7 Tage Inkubation bei 50 C), sowie das glykierte β-casein wurde unabhängig von der Zuckerart, abgebaut. Die Abbaurate war jedoch abhängig von der Erhitzungsdauer und der Inhibitorkonzentration. 61

62 Lactose-Pepton-Maillard-Produkte 5. Inhibition der Maillard-Reaktion in einer erhitzten Lactose-Pepton-Mischung 5.1. Einleitung Peptone sind Gemische aus Peptiden und Aminosäuren, die als Zwischenstufen bei der partieller Hydrolyse von Proteinen, z.b. mit Hilfe von bestimmten Enzymen, wie Pepsin oder Trypsin oder durch chemische Hydrolyse durch Säuren gebildet wurde. Die Peptone sind ebenso wie die Albumosen nicht genau abgegrenzte amorphe, heterogene Mischungen. Meist enthalten sie auch einen beträchtlichen Anteil an freien Aminosäuren. Die aus Casein oder Muskelproteinen hergestellten Peptone verwendet man vor allem zur Herstellung mikrobiologischer Nährböden. Peptone sind auch Bestandteil bestimmter diätetischer Lebensmittel. In der Literatur beschrieben, dass Peptone aus Caseine eine hohe thermische Stabilität aufweisen. Deshalb wurden sie in den nächsten Versuchen als Aminkomponente verwendet Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Bräunung einer Lactose- Pepton-Mischung Mischungen aus Lactose (0.1M) und Pepton (10mg/ml) wurden in PBS (0,1 mm, ph 6,8) gelöst. Zu jeweils 5ml der Lösung wurden, dazu werden verschiedene Konzentrationen ( mm) unterschiedlicher Inhibitoren als Pulver hinzu gegeben. Die Proben wurden dann im Autoklav bei 120 C für 30 Minuten erhitzt und anschließend schnell im Eisbad gekühlt. Die Absorption der Proben wurde nach einem Verdünnungsschritt mittels Spektrophotometer bei 420 nm vermessen. Die Ergebnisse werden in den folgenden Abbildungen dargestellt. 62

63 Lactose-Pepton-Mallird-Produkte 1,2 A 0,9 Absorption 0,6 0,3 ohne Inh. 5 mm 10 mm 20 mm 0 50 mm Natrium metabisulfit Thiamin N atriumsulfit Cystein Se micarbazid 1,2 B Absorption 0,9 0,6 0,3 ohne Inh. 5 mm 10 mm 20 mm 0 50 mm Acetylisylsäure Pyridoxin Acetylcystein EDTA 1,6 C Absorption 1,2 0,8 0,4 ohne Inh. 5 mm 20 mm 50 mm 0 Mercaptoethanol o-phenylendiamin Nicotinsäure Glutathion Inhibitor Abbildung 22 A, B, C: Bräunung einer erhitzten Lactose-Pepton-Mischung in Abhängigkeit von Inhibitorart und -konzentration. Die Ergebnisse stellen der Mittelwert ± SD von 3 Messungen dar. 63

64 Lactose-Pepton-Maillard-Produkte Um die Inhibitoren nach ihrem Inhibitionsrate auf die Bräunung vergleichen zu können, ist in Abbildungen 23 die Inhibitionsrate der Bräunung in Abhängigkeit von der Inhibitiorart und Konzentration dargestellt. 100 A Inhibitionsrat (%) Natriummetabisulfit Thiamin Natriumsulfit Cystein Semicarbazid 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm 90 B tionsrat (%) bi mm 10 mm 20 mm Inhi Acety 0 lsalicyl säure Pyr idoxin Acetylc ystein EDTA 50 mm 70 C 50 Inhibi tionsrat (% ) ol Mercaptoethan o-phenylendi amin Nicotinsäure Glutathion 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm -70 Inhibitor Abbildung 23 A, B, C: Einfluss der Inhibitorart und -konzentration auf die Inhibitionsrate der Bräunung Der beste Bräunungsinhibitor war Natriummetabisulfit mit einer Inhibitionsrate von mehr als 80%, gefolgt von Nα-Acetylcystein mit 78% bis hin zu EDTA mit 27% bei einer 64

65 Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Inhibitorkonzentration von 50 mm. o-phenylendiamin zeigte eine negative Inhibitionsrate, was bedeutet, dass es die Bräunung verstärkte. Eine Erklärung dafür könnte sein, dass die Aminfunktion des OPD die Maillard-Reaktion fördert und die entstehenden Addukte braun gefärbt sind Einfluss des Inhibitorzusatzes und der AGE-Bildung auf die ph-werte der Lösungen Um zu überprüfen, ob die beobachtete Bräunungsinhibition tatsächlich auf eine Reaktion des Inhibitors zurückzuführen ist oder indirekt über eine Änderung des ph-werts während der Reaktion hervorgerufen wird, wurden die ph-werten nach der Erhitzung gemessen (Tabelle 11 ). Inhibitorart / Inhibitorkonzentration 0mM 5mM 10mM 20mM 50mM Natriummetabisulfit 6,41 6,39 6,38 6,33 6,00 Natriumsulfit 6,41 6,36 6,36 6,40 6,51 Cystein 6,41 6,42 6,45 6,49 6,55 Semicarbazid 6,40 6,32 6,31 6,25 6,10 Pyridoxin 6,40 6,39 6,28 6,22 5,94 Thiamin 6,41 6,31 6,27 6,19 5,93 Mercaptoethanol 6,40 6,31 6,30 6,29 6,29 EDTA 6,40 6,31 6,31 6,29 6,23 Pyridoxamin 6,41 6,29 6,17 6,10 6,00 o-phenylendiamin 6,41 6,43 6,47 6,53 6,76 Nα-Acetylcystein 6,40 6,38 6,27 6,23 5,88 Nicotinsäure 6,41 6,39 6,36 6,20 6,03 Glutathion 6,41 6,36 6,23 6,10 5,71 Acetylsalicylsäure 6,41 6,27 6,20 6,01 4,80 Tabelle 11: ph-werte der unter Zusatz verschiedener Inhibitoren erhitzten Pepton-Lactose- Mischungen. Die ph-werte sind die Mittelwerte von drei Messungen. Diese Tabelle zeigt, dass die ph-werte der Proben mit der Bildung der Maillard-Produkte von 6,8 auf 6,4 sinken und dass weder die Inhibitorart noch ihre Konzentration einen größeren Einfluss auf den ph-wert der Proben haben. Demnach ist die Inhibition der Bräunung nur von der Inhibitorart und -konzentration abhängig. 65

66 Lactose-Pepton-Maillard-Produkte 5.4. Inhibition der CML-Bildung in einer erhitzten Lactose- Pepton- Mischung Nach dem sich die erhitzten Lctose-Pepton Mischung als stabil erweisen, wurden sie dazu eingesetzt, die Wirkung der Testsubstanzen auf die CML-Bildung zu untersuchen. Dazu Pepton Lactose-Mischungen in Anwesenheit oder Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen unterschiedlicher Inhibitoren für 30 Minuten bei 120 C erhitzt[vgl. Abschnitt (5.2)]. Die CML- Gehalte der Proben wurden durch einen kompetitiven ELISA- Test mit polyklonalen anti-cml-antikörpern bestimmt. Die Messungen der verdünnten Proben wie unter Absatz (5.2) beschrieben, durchgeführt, wobei die Platten mit CML-HSA belegt wurden. Die Abbildungen 24 A, B, C zeigen die CML-Gehalte in den Lactose-Pepton- Modellmischungen in Abhängigkeit von der Inhibitorart und -konzentration. Um die Standardabweichung zu berechnen, wurde die CML-Bestimmung jeder Probe vier Mal wiederholt und CML- Konzentrationen anhand einer Standardkurve berechnet. CML-Kozentration (µg/ml) 0,6 0,4 0,2 0 Thiamin Cystein Natriumsulfit Semicarbazid Acetylsalicylsäure Pyridoxin A ohne Inh. 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm CML-Konzentration (µg/ml) 0,6 0,4 0,2 0 Acetylcystein Glutathion Nicotinsäure o-phenylendiamin Inhibitor EDTA Mercaptoethnol Natriummetabisulfit B ohne Inh. 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm Abbildungen 24 A, B: Inhibition der CML-Bildung in einer erhitzten Lactose- Pepton-Mischung in Abhängigkeit von Inhibitorart und konzentration. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SD von 4 Messungen dar. 66

67 Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Die Abbildungen verdeutlichen, dass die CML-Konzentration in den erhitzten Lactose- Pepton-Mischungen mit steigender Inhibitorenkonzentration abnimmt. Manche Substanzen, wie o-phenylendiamin, inhibieren die CML-Bildung, obwohl sie die Bräunung verstärken. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass o-phenylendiamin mit Zwischenprodukten der Maillard-Reaktion, wie Dicarbonylverbindungen stabile farbige Maillard-Produkte bilden, die eine weitere Reaktion, z.b. zu CML, verhindern. Um die Inhibitoren nach ihrem Einfluss auf die CML-Bildung zu ordnen, wurde die Inhibitionsrate anhand der folgenden Gleichung berechnet: Inhibitionsrate = (Absorption der inhibierten Probe/ Absorption der nicht inhibierten Probe)* 100 dung 100 B Inhi biti onsra te de r CML-Bil (% ) s Acetylcy tein Gluta thion Nicotinsäure o-phenylendiamin Inhibitor EDTA Merc aptoethnol Natrium metabisulfit 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm g (% ) 100 A ildun ML-B er C tiosr ate d I nhibiamin Thi Cys tein N atriumsulfit Semicarbazid Acetylsalic ylsäure Pyridoxin 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm Abbildungen 25 A, B: Mischung in Abhängigkeit von Inhibitorart und -konzentration Inhibitionsrate der CML-Bildung in einer erhitzten Lactose-Pepton- Man sieht, dass die Inhibitionsrate der CML-Bildung mit der steigenden Inhibitorkonzentration steigt. Die Art des Inhibitors hat einen starken Einfluss auf die Inhibitionsrate. Die Inhibitionsrate sinkt in folgender Reihenfolge: 67

68 Lactose-Pepton-Maillard-Produkte Acetylsalicylsäure > Nα-Acetylcystein > Glutathion > Semicarbazid Natriummetabesulfit > Cystein>.. > EDTA> o-phenylendiamin Inhibition der Bildung von fluoreszierenden Produkten in erhitzten Lactose- Pepton-Mischungen Als weitere Produktklasse der Maillard-Reaktion wurden als nächstes fluoreszierender Produkte untersucht. Auch hier wurde wieder Einfluss der 13 aktiven Bräunungsinhibitoren weitergetestet. Lactose-Pepton-Mischungen wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Konzentrationen unterschiedlicher Inhibitoren für 30 Minuten bei 120 C erhitzt (Abschnitt 4.2). Die Fluoreszenz der Proben wurde bei 440 nm (Emission) nach Anregung bei 370 nm (Excitation) mit einem Fluorimeter gemessen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 26 dargestellt. 68

69 Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Abbildung 26 A, B, C: Inhibition der Bildung fluoreszierender Produkten einer erhitzten Lactose- Pepton-Mischung. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SD von drei Messungen dar. Die Abbildung 26 zeigt, dass die Bräunungsinhibitoren drei verschiedene Effekte auf die Bildung von fluoreszierenden Produkten haben können: Cystein und OPD inhhibieren die Bildung fluoreszierender Produkte. Natriumbisulfit, Pyridoxin, Thiamin, Mercaptoethanol, EDTA, Nα-Acetylcystein, Nicotinsäure, Glutathion, Semicarbazid und Acetylsalicylsäure können die Bildung von fluoreszierenden Produkten nicht verhindern und verstärken zum Teil die Fluoreszenz. Natriummetabisulfit verstärkt zunächst bei niedrigen Konzentrationen die Fluoreszenz, während es in höheren Konzentrationen inhibierend wirkt. Die Wirkung von Cystein und OPD kann dadurch erklärt werden, dass die Bräunungsinhibition durch die Inhibition der Bildung fluoreszierender Produkte erfolgt. Alternativ können andere Inhibitoren, wie Natriumsulfit, Pyridoxin, Thiamin, Mercaptoethanol, EDTA, Nα-Acetylcystein, Nicotinsäure, Glutathion und Acetylsalicylsäure, die Bräunung verhindern, in dem sie die Bildung nicht-fluoreszierender Produkte verhindern. Natriummetabisulfit verhindert die Bräunung gleichzeitig über beide Mechaninismen. 69

70 Lactose-Pepton-Maillard-Produkte 5.6. Inhibition der Lactulosylaminbildung in einer erhitzten Lactose- Pepton- Mischung Das Amadori-Produkt Lactulosylamin stellt eines der ersten Produkte der Maillard-Reaktion dar. Deshalb kann die Inhibitionswirkung der Testsubstanzen auf die Bildung von Lactulosyamin wichtige Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus erlauben Lactulosylaminbestimmung Die Lactose-Lysin-Mischung wurde in Abwesenheit oder Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 50 mm) von verschiedenen Inhibitoren für 30 Minuten bei 120 C erhitzt. Zum Einsatz kamen dabei wieder die 13 aktiven Bräunungsinhibitoren. Die Proben wurden anschließend verdünnt und Lactulosylamin wurde nach der Reaktion Nitro Blue Tetrazolium (NBT) bestimmt 130. Prinzip der Methode Die NBT-Methode wurde von Johnson und al. 131 entwickelt und beruht auf der oxidierbarkeit von Amadori-Produkten in alkalischer Lösung 132. Unter alkalischen Bedingungen haben Amadori-Produkte wie Fructosylamin oder Lactulosylamin ein reduzierendes Potential, das sich von anderen reduzierenden Substanzen wie Glukose, Lactose oder unstabilen Schiffbasen, wie die N-Glucosylamin-Derivate, unterscheidet 133. Mittels Spektrophotometer wurden die Absorption von NBT, das von Lactulosylamin in den Proben reduziert wurde, bei 530 nm vermessen. Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe von 1- Deoxy-1-morpholino-D-fructose (DMF) als Standard. Dazu wird werden die Absorption des reduzierten NBTs, in den Proben nach 10 und 15 Minuten gemessen. Die daraus resultierende Standardgerade für DMF ist in Abbildung 27 dargestellt. 70

71 Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Differenz zwische der Absorption nach 10 und 15 min bei 530 nm 0,2 0,15 0,1 0,05 y = 0,0002x - 0,0017 R 2 = 0, DMF Konzentration (µm) Abbildung 27: Standardkurve des NBT-Tests unter Verwendung von 1-Deoxy-1-morpholino-Dfructose Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Lactulosylamin- konzentrationen in der erhitzten Lactose-Pepton-Mischung Die Proben wurden, wie unter Kapitel (7.5.1) beschrieben, vorbereitet und im Verhältnis (1:10) mit bi-destilliertem Wasser verdünnt. Anschließend wurde die Lactulosylamin- wurde unter Verwendung des NBT-Tests wie in Abschnitt (7.5.2) durchgeführt. bestimmung In der Folgenden Abbildung 28 wird der Einfluss der Inhibitorart und -konzentration auf die Lactulosylaminbildung in den Proben gezeigt. ntration A Lactulosylaminkonze (µm) Na trimmetabisulfit Thiamin Natriumsulfit Cystein Semicarbazid o-p henylendiamin ohne 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm Inhibitor 71

72 Lactose-Pepton-Maillard-Produkte La ct ulos yl amin k onze ntrati on (µ M ) Acetylsalicylsäure Pyridoxin Acetylcystein Nicotinsäure EDTA Mercaptoethanol Glutathion B ohne 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm Inhibitor Abbildungen 28 A,B: in einer erhitzten Lactose-Pepton-Mischung Einfluss der Inhibitorart und konzentration auf die Lactulosylaminbildung Anhand der Ergebnisse wird deutlich, dass Natriummetabisulfit in niedriger Konzentration (bis 10 mm) die Lactulosylaminbildung inhibiert. In höheren Konzentrationen verstärkt es die Bildung trotz der starken inhibitorischen Wirkung des Natriummetabisulfit auf die Bräunung. Die Bräununginhibitoren Natriumsulfit und Mercaptoethnol können die Lactulosylaminbildung nicht inhibieren, ähnlich wie Nicotinsäure, Nα-Acetylcystein, o-phenylendiamin, Cystein und Glutathion, die nur in hohen Konzentrationen (>20 mm) wirksam sind. Die Inhibitoren Semicarbazid, Pyroxidin, Acetylsalicylsäure, EDTA und Thiamin können gleichzeitig die Bräunung und die Lactulosylaminbildung inhibieren. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Art und Konzentration der Testsubstanzen einen großen Einfluss auf die Art der Maillard-Produke (Lactulosylamin, fluoreszierende, braune oder andere Endprodukte) hat, die sie inhibieren können. Weiterhin wurde die Inhibitionsrate der Lactulosylaminbildung berechnet und die Ergebnisse in Abbildung 29 veranschaulicht. 72

73 Lactose-Pepton-Mallird-Produkte 100 A Inibitionsrate (%) Natrimmetabisulfit -150 Thiamin Natriumsulfit Cystein Semicarbazid o-phenylendiamin 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm -200 Inhibitor 100 B 50 rate (%) Inhibitions 0-50 Acetylsaly -100 silsäure Py ridoxin Acetyl cystein Nikot insäure EDTA Mercapto ethanol Gl utathion 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm -150 Inhibitor Abbildung 29: Einfluss der Inhibitorart und konzentration auf die Inhibitionsrate der Lactulosylaminbildung in einer erhitzten Lactose-Pepton-Mischung Für einige Inhibitoren, wie Semicarbazid (71%), Acetylsalicylsäure (62%), Pyridoxin (55%) und EDTA (45%) konnte gezeigt werden, dass sie die Bildung von Lactulosylamin deutlich inhibieren können. Um die Wirkung von reduzierenden Verbindungen sicher beurteilen zu können, bedarf es jedoch weitere Untersuchungen, die ausschließen müssten, dass die Testsubstanzen selbst keinen Einfluss auf die Reduktion von NBT haben Statistische Bewertung der Ergebnisse Der Einfluss der Inhibitorart und -konzentration auf die Bräunung und Bildung von CML, fluoreszierenden Produkten und Lactulosylamin wurde mit dem Statistik-Programm SAS getestet. Außerdem wurde die Abhängigkeit der einzelnen Parameter von einander untersucht. 73

74 Lactose-Pepton-Maillard-Produkte Anwendung des GLM-Verfahrens Zur Ermittlung der Abhängigkeit verschiedener Parameter der Maillard-Reaktion von Inhibitorart und konzentration mit Hilfe des GLM- Verfahrens werden 130 Proben (13 Inhibitoren, fünf verschiedene Konzentrationen pro Inhibitor, jeweils in Doppelbestimmung) miteinander verglichen. Die Ergebnisse der statische Bewertung des Zusammenhangs zwischen den Parametern: Bräunung sowie Bildung von CML, fluoreszierenden Produkten und Lactulosylamin erfolgte mit Hilfe des GLM-Verfahrens. Ein p-wert von <0,0001 (Tabelle 12) zeigt eine starke Abhängigkeit des Parameters von der Inhibitorart und - konzentration. Quelle Anzahl Bräunung CML Fluoreszierende Produkte Lactulosylamin dervariable p-wert p-wert p-wert p-wert Inhibitor (I) 13 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 Konzentration (C) 5 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 I*C 65 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 Tabelle 12: Statistischer Zusammenhang zwischen der Bräunung sowie der Bildung von CML, fluoreszierenden Produkten und Lactulosylamin und der Inhibitorart und konzentration ermittelt durch das GLM-Verfahren Duncan-Gruppierung der Testsubstanzen bezogen auf ihre Fähigkeit, verschiedene Parameter der Maillard-Reaktion zu inhibieren Durch die Duncan-Gruppierung kann man nicht nur ähnliche Einflüsse mehrerer Inhibitoren erfassen, sondern auch den Einfluss der Inhibitoren auf die Bräunung nach ihrer Stärke ordnen. Tabelle 13 zeigt, dass die Inhibitoren Natriummetabisulfit und Nα-Acetylcystein sowie Thiamin und Acetylsalicylsäure eine ähnliche Wirkung auf die Bräunung haben. Die Aktivität der Bräununsinhibitoren fällt in der Reihenfolge: Natriummetabisulfit > Nαacetylcystein > Glutathion > Thiamin > Acetylsalicylsäure > Mercaptoethanol > Nikotinsäure > Pyridoxin >...> EDTA > o-phenylendiamin. Durch die Duncan-Gruppierung wird deutlich, dass Glutathion und Semicarbazid sowie Cystein und EDTA einen ähnlichen Einfluss auf die CML- Bildung haben. 74

75 Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Die Inhibitionsaktivität der CML-Bildung fällt in der Reihenfolge: Semicarbazid = Glutathion > Acetylsalicylsäure > Nikotinsäure >...> Natriumsulfit Bräunung CML Fluoreszierende Produkte Lactulosylamin Duncan Gruppierung Inhibitor Duncan Gruppierung Inhibitor Duncan Gruppierung Inhibitor Duncan Gruppierung Inhibitor A o-phenylendiamin A Na 2 SO 3 A Na 2 S 2 O 5 A Mercapotoethanol B EDTA B Cystein B Thiamin B Na 2 SO 3 C Semicarbazid B EDTA C Nα-Acetylcystein C Nα-Acetylcystein D Na 2 SO 3 C B Mercapotoethanol D C Na 2 SO 3 D EDTA E Cystein C B D o-phenylendiamin D Acetylsalicylsäure E Cystein F Pyridoxin C E B D Pyrodixin E Mercapotoethanol F Na 2 S 2 O 5 G Nicotinsäure C E B D Nα-Acetylcystein F E EDTA G Thiamin G Mercaptoethanol C E F D Thiamin F G Nicotinsäure G o-phenylendiamin H Acetylsalicylsäure C E F D Na 2 S 2 O 5 G Glutathion H Glutathion H Thiamin E F D Nicotinsäure H Pyrodixin H Nicotinsäure I Glutathion E F Acetylsalicylsäure I Semicarbazid I Semicarbazid J Nα-Acetylcystein F Glutathion J Cystein J Thiamin K Na 2 S 2 O 5 F Semicarbazid K o-phenylendiamin K Acetylsalicylsäure Tabelle 13: Duncan-Gruppierung der Testsubstanzen bezogen auf ihre Fähigkeit verschiedene Parameter der Maillard-Reaktion zu inhibieren. A bezeichnet die schwächste Aktivität und K die stärkste. Substanzen mit vergleichbarer Wirkung sind mit denselben Buchstaben gekennzeichnet. Für die fluoreszierenden Produkte zeigte die Duncan-Gruppierung, dass der effektivste Inhibitor o-phenylendiamin war, gefolgt von Cystein und Semicarbazid. Dabei gibt es Ähnlichkeiten zwischen dem Einfluss von Nα-Acetylcystein und Natriumsulfit, zwischen Natriumsulfit und Acetylsalicylsäure sowie zwischen EDTA und Nikotinsäure. Die Duncan-Gruppierung macht weiterhin deutlich, dass es bei der Inhibition der Lactulosylaminbildung nicht nur keine Ähnlichkeit zwischen dem Einfluss der Bräununginhibitoren gibt, sondern auch eine grundlegend andere Reihenfolge der inhibitorischen Aktivität der Testsubstanzen: Acetylsalicylsäure > Thiamin > Semicarbasid > Nikotinsäure > Glutathion >...> Mercaotoethanol. 75

76 Mit dem Programm-SAS wurde auch die Korrelation zwischen unterschiedlichen Faktoren derselben Proben berechnet (Tabelle 14). Es besteht eine positive Korrelation zwischen der Bräunung und der CML-Bildung sowie zwischen der Bildung von fluoreszierenden Produkten und Lactulosylamin. Eine mögliche Erklärung dafür wäre, dass bei höheren Temperaturen in erhitzten Lactose- Peptone-Mischungen zwei unterschiedliche Reaktionsmechanismen gleichzeitig ablaufen können 134 (Abb. 28): Beim dominierenden thermischen Abbauweg von Lactose (80%) entsteht Glyoxal, das mit dem Lysinseitenketten der Peptone r eagiert, um CML zu bilden. Der Rest der Lactose-Abbauprodukte führt über d en Maillard-Reaktion-Weg zur Bildung von braunen Melanoidi nen. Ein Nebenweg (20%) ist die Maillard-Reaktion, bei welcher Lactose mit Peptonen reagiert unter Entstehung von Lactulosylamin, fluoreszierenden Maillard-Produkten, Bräunung und CML. Lactulosylamin und fluoreszierende Maillard-Produkte, sowie CML und Bräunung bilden sich unter den Experimentalbedingungen durch die gleichen Wege das heißt durch der Maillard-Reaktion- bzw. den Lactoseabbau-Weg wobei eines der Vorläufer das andere ist. Daraus ergibt sich eine positive Korrelation zwischen der Bildung von Lactulosylamin von den fluoreszierenden Maillard-Produkten, sowie zwischen der Bildung von CML und der Bräunung. Je mehr Lactose thermisch abgebaut wird, desto höher ist die Konzentration an gebildetem CML und desto stärker ist die Bräunung und desto geringer sind die Konzentrationen der durch Maillard-Reaktion gebildeten Lactulosylamine und fluoreszierenden Maillard-Produkte. So ergeben sich eine negative Korrelation zwischen der Bräunung und CML und der Bildung von Lactulosylamin und fluoreszierenden Maillard- Produkten. Lactose-Pepton-Maillard-Produkte Korrelation zwischen den Faktoren Bräunung, Bildung von CML, fluoreszierenden Maillard-Produkten und Lactulosylamin 76

77 Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Abbildung 28: Mechan ismus der Bildun g von Lactulosyl amin, fluoresziere nder Mailla rd-produkten, CML und Bräunung. Bräunung Fluoreszierende Produkte CML Lactulosylamin Bräunung <.0001 <.0001 Fluoreszierende P rodukte <.0001 CML <.0001 <.0001 Lactulosylamin < <.0001 < < <.0001 <.0001 <.0001 Tabelle 14: Korrelation zwischen Bräunung, Bildung von CML, fluoreszierender Produkte Lactulosylaminbildung und 5.8. Zusammenfassung und Diskussion Durch die Erhitzung von Lactose-Pepton-Mischungen werden unterschiedliche Maillard- Produkte in den Proben gebildet. In diesem Abschnitt wurde der Einfluss einiger Bräunungsinhibitoren auf die Bildung von vier Arten von Maillard-Produkten getestet: braune Maillard-Produkte, fluoreszierende Maillard-Produkte, Carboxymethyllysin (CML) und Amadori-Produkte Lactulosylamin. Die Messungen der Absorptionen der Proben mit und ohne Zusatz unterschiedlicher Konzentrationen von verschiedenen Inhibitoren zeigen Veränderungen im Bräunungs-grad der Proben. Diese Veränderungen sind von der Art und der Konzentration der Inhibitoren abhängig. Die größte Inhibitonsrate der Bräunung wurde durch Natriummetabisulfit und Nα- Acetylcystein (mehr als 80%), die kleinste durch EDTA (bis 27%) erreicht. o-phenylendiamin zeigte eine negative Inhibitionsrate, was heißt, dass diese Substanz die Bräunung verstärkt. 77

78 Lactose-Pepton-Maillard-Produkte Es wurde auch getestet, ob der Zusatz von Inhibitoren und die Maillard-Produktbildung in den erhitzten Proben zu großen Veränderungen des ph-werts führen, da dieser die Bräunung der Proben entscheidend beeinflusst. Die Veränderungen in den ph-werten der Proben waren mit Ausnahme derer bei Acetylsalicylsäure (Tabelle 11) jedoch so geringfügig, dass sie die Bräunung nicht beeinflussen. Ein Vergleich zwischen der Bräunung in Lactose-Lysin und in Lactose-Pepton- Modellsystemen verdeutlicht, dass die Bräunung bei dem Lactose-Lysin-Modellsystem stärker ist als bei den Lactose-Pepton Mischungen. Eine Erklärung dafür wäre, dass Lysin effektiver als die andere Aminosäure an der Bildung von braunen Produkten beteiligt ist 135. Die Inhibitoren zeigten ebenso mehr Aktivität im Lactose-Lysin-Modell als im Lactose- Pepton-Modell. Mit Hilfe eines kompetetiven ELISAs wurden die CML-Konzentrationen in den Lactose- Pepton-Mischungen bestimmt, die in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen verschiedener Inhibitoren erhitzt worden waren. Die CML-Konzentrationen nehmen bei hohen Konzentrationen der ausgewählten Inhibitoren ab. Die CML-Konzentrationen sind wie die Bräunung von Art und Konzentration des Inhibitors abhängig. Anders als bei der Inhibition der Bräunung, waren Acetylsalicylsäure, Nα-Acetylcystein sowie Glutatathion effektiver als Natriummetabisulfit und Semicarbazid die Bildung von CML zu verhindern. Weiterhin wurde der Einfluss der Bräunungsinhibitoren auf die Bildung von fluoreszierenden Produkten in den erhitzten Proben getestet. Nur zwei der verwendeten Bräunungsinhibitoren, Cystein und o-phenylendiamin konnten die Bildung von fluoreszierenden Maillard-Produkten inhibieren. Unter den Versuchbedingungen zeigte nur Pyridoxin eine messbare Eigenfluoreszenz, so dass man davon ausgehen kann, dass die anderen Inhibitoren die Fluoreszenzmessung nicht stören. Die verwendeten Bräununginhibitoren haben einen unterschiedlichen Einfluss auf die Lactulosylaminbildung in den Proben. Bei Verwendung einiger Inhibitoren wie Natriumsulfit und Mercaptoethanol steigt die Lactulosylaminkonzentration mit steigender Konzentration der Inhibitoren. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass diese Inhibitoren die Maillard-Reaktion nach der Bildung des Amadori-Produkts stoppen. Als folge läuft die Reaktion bei erhöhter Inhibitorkonzentration bis zur Bildung von Amadori-Produkten und wird dann gestoppt. Dadurch reichert sich Lactulosylamin an. Cystein, Semicarbazid, Acetylsalicylsäure, Pyridoxin, und EDTA können die Lactulosylamin-Bildung nicht unterdrücken, so dass diese 78

79 Lactose-Pepton-Mallird-Produkte Bräunungsinhibitoren vermutlich an einen anderen Reaktionsweg eingreifen, der unabhängig von der Bildung des Amadori-Produkts ist. Die übrigen verwendeten Bräunungsinhibitoren können die Bildung von Lactulosylamin bis zu bestimmten Konzentrationen inhibieren oder verstärken, so dass die Inhibition der Bräunung wohl über zwei Mechanismen abläuft. Bei der Verwendung von Natriummetabisulfit z.b. nimmt die Konzentrationen von Lactulosylamin bis 10 mm Inhibitorzusatz ab, wobei der Mechanismus der Bräunungs-inhibition durch Inhibition der Bildung von Amadori-Produkten stattfindet. Bei einer hohen Natriummetabisulfit- könnte die Bräunungsinhibition durch die Hemmung anderer konzentration Zwischenprodukte ablaufen. Mög licherweise können die schwefelhaltigen Inhibitoren auch Lactulosylaminbestimmung Andere stören 136,137, was ist noch getestet werden müsste. Die statistische Auswertung der Ergebnisse verdeutlicht, dass eine starke Korrelation zwischen Bräunung, Bildung von CML, fluoreszierenden Produkten und Lactulosylamin und Inhibitorart und -konzentration besteht. Es gibt weiterhin eine positive Korrelation zwischen der Bräunung und der CML-Bildung sowie eine positive Korrelation zwischen der Bildung von Fluoreszenzprodukten und Lactulosylamin. Die statistische Auswertung zeigte auch eine negative Korrelation zwischen der Bräunung und der Bildung von fluoreszierenden Produkten und Lactulosylamin als auch zwischen der CML- und der Lactulosylaminbildung. Eine mögliche Erklärung dafür wäre, dass bei höheren Temperaturen in erhitzten Lactose-Pepton-Mischungen zwei unterschiedliche Reaktionmechanismen gleichzeitig ablaufen können: die Degradation von Lactose und die Maillard-Reaktion. Die erste ist der dominante Reaktionmechanismus, durch den vermutlich, dass 80% des reagierenden Zuckers abgebaut wird. Je höher deshalb die Konzentration von Lactose ist, die direkt abgebaut wird, desto höher ist die Konzentration von gebildetem CML oder die Bräunung, und desto geringer ist die Konzentration des durch die Maillard-Reaktion gebildeten Lactulosylamin oder der fluoreszierenden Maillard-Produkte. So ergeben sich eine negative Korrelation zwischen der Bräunung oder CML und der Bildung von fluoreszierenden Maillard-Produkten. 79

80 Milch-Maillard-Produkte 6. Inhibition der Maillard-Reaktion in Milch 6.1. Inhibition der Bräunung in Magermilch In den weiteren Versuchen sollte untersucht werden, in wie weit die zuvor identifizierten Inhibitoren der nicht-enzymatischen Bräunung auch in einem realen Lebensmittel wirksam sind. Dazu wurde Milch ausgewählt, da die Erhitzung von Milch und Milchprodukten Fehlfärbungen verursacht, die zu erheblichen Qualitätseinflüssen führen. Dazu wurde eine Modellsystem (vgl. Abschnitt 7.6.1) entwickelt, bei dem Magermilchpulver, das in 0,5 M PBS rekonstruiert worden war, in Anwesenheit oder Abwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen verschiedener Inhibitoren für 30 Minuten bei 120 C erhitzt wurde. Während der Erhitzung trennen sich die Proben in zwei Phasen; eine schaumartige feste Phase und eine gefärbte Lösung. Somit konnte die Bräunung leicht in der Lösung analytisch bestimmt werden. Um eine klare Lösung für die Messung der Bräunung zu bekommen, wurden die Proben zentrifugiert. In Abbildung 30 sind verschiedene Proben dargestellt, die mit Natriummetabisulfit, Cystein und Thiamin in unterschiedlichen Konzentrationen erhitzt wurden. Inhibition der Bräunung in Magermilch durch Natriummetabisulfit Inhibition der Bräunung in Magermilch durch Cystein 80

81 Milch-Mallird-Produkte Inhibition der Bräunung in Magermilch durch Thiamin Abbildung 30: Einfluss der Inhibitorart und -konzentration auf die Inhibitionsrate der Bräunung in rekonstruierter Magermilch Die Bräunungsintensität der Proben verändert sich in Abhängigkeit von der Inhibitorart und - konzentration, wobei die Farbe bei den nicht inhibierten Proben dunkelbraun war. Durch Zugabe von 50 mm Natriummetabisulfit blieb die Lösung farblos, von 50 mm Cystein wurden sie gelb und von 50 mm Thiamin blieben die Lösungen braun Photometrische Bestimmung der Bräunung in rekonstruierter Magermilch In den Magermilchproben wurde nur die Wirkung der Inhibitoren getestet, die einen großen Einfluss auf die Bräunung im Modellsystem hatten. Die Absorptionen der Proben wurden bei 420 nm gemessen und in Abhängigkeit von Inhibitorart und -konzentration in den folgenden Abbildungen dargestellt. 3,0 Absorption 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 mm 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm Cystein EDTA Acetylsalicylsäure Pyridoxin Semicarbazid 81

82 Milch-Maillard-Produkte 3,0 so rptio n Ab 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 mm 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm Mercaptoethanol Thiamin Natriumsulfit Nicotinsäure Glutathion Natriummetabisulfit Inhibitor Abbildung 31: Einfluss der verschiedenen Inhibitoren auf die Bräunung in den rekonstruierten Magermilchproben, die in Anwesenheit oder Abwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von verschiedenen Inhibitoren für 30 Minuten bei 120 C erhitzt worden waren. Die Ergebnisse sind als Mittelwert von 3 Messungen ± SD dargestellt. Abbildung 31 verdeutlicht, dass die Bräunung in den Proben mit steigender Konzentration der Inhibitoren abnimmt. Dabei ist die Inhibitionsrate vor allem von der Inhibitorart abhängig. Natriummetabisulfit, sowie Natriumsulfit oder Mercaptoethanol zeigen im Gegensatz zu EDTA oder Nicotinsäure einen großen Einfluss auf die Inhibitionsrate der Bräunung in den Magermilchproben. Die Inhibitionsrate der Bräunung ist bei den Proben im Lactose-Lysin- Modellsystem größer als bei den Magermilchproben, obwohl beide Proben mit den gleichen Inhibitoren in gleichen Konzentrationen behandelt wurden. Eine Erklärung dafür könnte sein, dass Substanzen aus der Magermilchmatrix mit den zugegebenen Inhibitoren reagieren Einfluss der Erhitzung und des Inhibitorzusatzes auf den ph Wert der Proben Die ph-werte der erhitzten Proben (Abschnitt 5.1) wurden gemessen, um einen möglichen Einfluss der ph-wert Veränderungen auf die Inhibition der Bräunung festzustellen. Die E rgebnisse dieser Messung sind in Tabelle 18 dargestellt. Die Mischungen, die ohne Inhibitor erhitzt wurden, zeigten gegenüber den nicht erhitzten Proben eine leichte Absenkung des ph- Wert von 6,8 auf 6,5. In den Proben, die in Anwesenheit der Inhibitoren erhitzt worden 82

83 Milch-Mallird-Produkte waren, waren die ph-werte gegenüber denen ohne Zusatz von Inhibitoren geringfügig erhöht oder verringert. Allgemein konnten jedoch keine bedeutenden ph-wert Änderungen gemessen werden. Inhibitor /ph 0 mm 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm Natriumbisulfit 6,47 6,46 6,47 6,47 6,38 Natriumsulfit 6,47 6,50 6,52 6,55 6,62 Cystein 6,45 6,46 6,46 5,45 6,41 Semicarbazid 6,43 6,44 6,43 6,42 6,35 Pyridoxin 6,47 6,43 6,41 6,37 6,27 Thiamin 6,44 6,42 6,41 6, 37 6,28 Acetylsalicylsäure 6,46 6,43 6, ,12 Mercaptoethanol 6,45 6,43 6,46 6,46 6,47 EDTA 6,47 6,46 6,44 6,40 6,30 N-Acetylcystein 6,47 6,46 6,44 6,41 6,32 Nikotinsäure 6,45 6,44 6,42 6,39 6,31 Tabelle 15: ph-werte der in 0,5 PBS (ph 6,8) rekonstruierten 10%igen Magermilchproben, die in Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen unterschiedlicher Inhibitoren für 30 Minuten bei 120 C erhitzt worden waren Faktoren, die die Phasentrennung verschiedener beeinflussen Milchproben Die Trennung der Proben in zwei Phasen in allen erhitzten Proben, denen Testsubstanzen zugesetzt worden waren, hatte den Vorteil, dass die Bräunung in einer klaren Lösung gemessen werden konnte. Für einen Einsatz in der Lebensmittelproduktion ist dies jedoch nicht akzeptabel. Deshalb wurde der Einfluss verschiedener Faktoren auf die Phasentrennung der Proben getestet Einfluss des Inhibitorzusatzes Zunächst wurde der Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Phasentrennung untersucht. Gleichzeitig wurde in den Proben der ph-wert vor und nach dem Erhitzungsschritt gemessen, um feststellen zu können, ob die Phasentrennung durch eine Veränderung des ph-werts verursacht wird. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 16 und 17 dargestellt. 83

84 Milch-Maillard-Produkte Untersuchung von fettarmer Milch (1.5% Fett) Fettarme Milch wurde in Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von Cystein für 30 Minuten bei 120 C erhitzt, um den Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Phasentrennung der Proben zu untersuchen. Der ph-wert der Proben wurde vor und nach dem Erhitzen gemessen. Inhibitorkonzentration 0 mm 5 mm Cystein 10 mm 20 mm 50 mm Cystein Cystein Cystein ph-wert vor dem Erhitzen 6,72 6,72 6,71 6,67 6,65 ph-wert nach dem Erhitzen 6,42 6,37 6,31 6,24 6,04 Trennung 1 Phase 1 Phase 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen Tabelle 16: Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Proteinpräzipitation in fettarmer Milch, die in Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von Cystein für 30 Minuten bei 120 C erhitzt wurde. Untersuchungen von rekonstruierter Magermilch Der gleichen Versuche wurde mit den Magermilchproben durchgeführt, die zuvor aus Magermilchpulver mit 0,5 M PBS-Puffer (ph 6,8) rekonstruier wurden. Konzentration der Inhibitor ph-wert vor dem Erhitzen ph-wert nach dem Erhitzen 0 mm Cystein 5 mm Cystein 10 mm 20 mm 50 mm Cystein Cystein Cystein 6,79 6,79 6,78 6,78 6,77 6,48 6,45 6,44 6,44 6,41 Trennung 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen Tabelle 17: Einfluss des Inhibitorzusatzes auf die Proteinpräzipitation in fettarmer Milch, die in Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von Cystein für 30 Minuten bei 120 C erhitzt wurden. Der ph-wert bleibt in allen Proben über 4,6, dem Wert, bei dem Casein ausfallen. In den Magermilchproben fallen die Proteine bei allen Inhibitorkonzentrationen sowie bei der Probe, der kein Inhibitor zugegeben worden war aus. Bei den fettarmen Milchproben fallen jedoch die Proteine nur bei einem Zusatz von mehr als 10mM Cystein aus. 84

85 Milch-Mallird-Produkte Die Präzipitation des Caseins ist jedoch nicht nur auf die Anwesenheit der Inhibitoren zurückzuführen, da bei der rekonstruierten Magermilch auch ohne Zusatz von Testsubstanzen eine Phasentrennung zu beobachten ist Einfluss der Pufferkonzentration Weiterhin wurde der Einfluss der Pufferkonzentration auf die Proteinfällung in der erhitzten Magermilchlösung getestet, wobei das Magermilchpulver in Wasser oder in unterschiedlich konzentrierten PBS-Puffern suspendiert wurde. Auch zu diesen Proben wurden unterschiedliche Konzentrationen des Inhibitors Cystein gegeben. Di e Ergebnisse sind in Tabelle 18 dargestellt: 0 mm 5 mm Cystein 10 mm Cystei n 20 mm Cys tein 50 mm Cystein Wasser 1 Phase 1 Phase 1 Phase 2 Phasen 2 Phasen PBS (100mM) 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen 2 Ph asen 2 P hasen Trübung Trübung Trübung Trübung Trübung PBS (500mM) 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen 2 Phasen Tabelle 18: Einfluss der Pufferkonzentration auf das Ausfällen von Proteinen einer erhitzten Magermilchprobe unter Verwendung von Cystein als Bräununginhibitor Diese Tabelle zeigt, dass die Proteine erst bei Zusatz von 20 mm Cystein ausfallen, wenn das Magermilchpulver mit Wasser rekonstituiert wurde. Bei hohen Pufferkonzentrationen fallen die Proteine der Magermilchproben auch ohne Zusatz von Inhibitor aus. Dies bedeutet, dass der Zusatz des Puffers zur Präzipitation der Proteine führt Einfluss der Inhibitorkonzentration In Abschnitt wird gezeigt, dass die Trennung der Proben in zwei Phasen beim Zusatz von 20mM Cystein erfolgt. Deshalb wurde getestet, ob sich durch Kombination mehrer Inhibitoren auf Grund von synergistischen Effekten, die ihibitorische Wirkung bereits bei niedrigeren Konzentrationen erzielen lässt. Damit könnte die Bräunung inhibiert werden ohne dass dabei die Proteine ausfallen. 85

86 Milch-Maillard-Produkte Deshalb wurde der Einfluss des Zusatzes von 10 und 20 mm Natriummetabisulfit bzw. von Mischungen aus jeweils 5 mm Cystein und Thiamin und 10 mm Natriummetabisulfit oder jeweils 5 mm Thiamin und Natriummetabisulfit und 10 mm Cystein (Abbildung 32) getestet. ABS 3,5 3 2, 5 2 1,5 1 0, Lactose-Lysin- hung Misc Magermilch Inhibitoren ohne Inhibitor 10 mm Na 2 S 2 O 5 20 mm Na 2 S 2 O 5 5 mm Thiamin 10 mm Cystein 5 mm Na 2 S 2 O 5 5 mm Cystein 5 mm Thiamin 10 mm Na 2 S 2 O 5 Inhibitionsrate (%) in Magermilch 32,31 % 58,71 % % 63,66 % Abbildung 32: Einfluss einer Mischung von Inhibitoren auf die Bräunung in der Magermilch oder der Lactose-Lysin-Modellmischung. Abbildung 32 zeigt, dass man eine zwei- bis dreifache Gesamtkonzentration anderer Inhibitoren benötigt, um die Inhibitionsrat e von 10 mm Natriummetabisulfit zu erreichen. Bei allen getesteten Inhibitorenkonzentrationen war weiterhin auch eine Phasentrennung zu beobachten. Das bedeutet, dass man wegen Instabilität der Proteinlösung eine Konzentration von 5 mm der Inhibitoren nicht überschreiten darf, um die Bräunung in Milch oder Magermilch zu vermeiden. Bei dieser Konzentration beträgt die Inhibitionsrate der Bräunung nicht mehr als 32% durch Natriummetabisulfit und bei den anderen Inhibitoren weniger als 10%. Allgemein beobachtet man, dass die gleichen Inhibitoren eine größere Wirkung bei Lactose- Lysin-Mischung als bei Magermilch haben. Eine mögliche Erklärung dafür wäre, dass die Inhibitoren mit anderen Substanzen der Magermilchmatrix reagieren, und damit für die Inhibition der Bräunungsreaktion nicht mehr zur Verfügung stehen. 86

87 6.3. Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse Milch-Mallird-Produkte Es wurden zwei neue Testsysteme mit rekonstruierter Magermilch und 1,5% fettarmer Milch entwickelt, mit denen man den Einfluss der Substanzen, die in den Modellmischungen zuvor eine effektive Inhibitonswirkung auf die Bräunung zeigten, auf Milch untersuchen kann. Um die Bräunung photometrisch erfassen zu können, wurde das Magermilchpulver in 0,5 M PBS (ph 6,8) statt in Wasser suspendiert. Der Pufferzusatz führt zu einer Phasentrennung während des Erhitzens, so dass die Bräunung in der resultierenden Lösung gemessen werden kann. Um jedoch auch eine Anwendung in der Lebensmittelproduktion ermöglichen zu können, wurden weiterhin nach Reaktionsbedingungen gesucht, bei denen keine Phasentrennung erfolgt. Dafür wurde der Einfluss verschiedener Faktoren, wie Konzentration der Testsubstanzen sowie des Puffers, auf die Phasentrennung getestet. Dabei wurde festgestellt, dass ni cht nur der Puffer sondern auch die Inhi bitoren, konzentrationsabhängig zu einer Präzipitation der Proteine führten. Eine Erklärung dafür wäre, dass hohe Pufferkonzentrationen die Hydrophobizität der Mizelloberfläche des Milchserums herabsetzen. So ändert sich die Löslichkeit dieser Mizellen und es ergibt sich d aher eine Phase ntennung. Die Inhibitoren können, auch insbesondere bei hoher Temperatur, durch die Reaktion mit Disulfidbrücken die Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine stören, was zur Präzipitation, vor allen der Caseine führen kann. Wegen der Proteinpräzipitation sollte man eine Konzentration des Inhibitors von maximal 5 mm (entspricht einer Inhibitionsrate von maximal 32%) verwenden, um die Bräunung in fettarmer Milch oder Magermilch zu inhibieren. Bei einem Vergleich der inihibitorischen Wirkung der Testsubstanzen auf die Lactose-Lysin- Mischung mit der auf Magermilch wurde festgestellt, dass die gleichen Inhibitoren eine größere Wirkung bei Lactose-Lysin-Mischung als bei Magermilch zeigten. Eine mögliche Erklärung dafür wäre, dass die Inhibitoren mit anderen Substanzen der Magermilchmatrix reagieren, und damit für die Inhibition der Bräunungsreaktion nicht mehr zur Verfügung stehen. 87

88 Isolierung eines Lactose-Lysin-Maillard-Produkte 7. Isolierung, Strukturaufklärung und Inhibition der Bildung eines Maillard-Produktes aus einer Lactose-Lysin- Reaktionsmischung 7.1. Einfluss von Natriummetabisulfit auf Produktspektrum einer Lactose-Lysin Maillard-Mischung In Abschnitt 3 wurde gezeigt, dass Natriummetabisulfit der effektivste Inhibitor der Bräunung war. Deshalb wurde weiterhin sein Einfluss auf die Bildung von Maillard-Produkten getestet. Die Maillard-Produkte einer erhitzten Lactose-Lysin-Mischung wurden mittels HPLC aufgetrennt und somit einen Unterschied zwischen dem Produktspektrum der Reaktionsmischungen, die mit oder ohne Zusatz von Natriummetabisulfit erhitzt wurden, zu erkennen. Dafür wurden die Lactose-Lysin-Mischungen für 5 Stunden bei 120 C erhitzt. Die braune Probe wur de abgeküh lt und durch eine Membrane filtriert. Die Maillard-Produkte der Lactose wurden dann mittels HPLC aufgetrennt. Die chromatographischen Parameter sind in Abschnitt 7.2 beschrieben. Abbildung 33: Chromatogramm einer Maillard-Mischung (0,1M Lactose und 0,02M Lysin in 0,1M PBS Puffer, ph=6,8), die für 5 Stunden bei 120 C erhitzt wurde. Das Hauptprodukt, das bei einer Wellenlänge von 280 nm detektiert wird, ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Bei einer Detektionswellenlänge von 280 nm wurde ein Hauptprodukt detektiert, das nach 26 Minuten eluiert. Es wurde der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von Natriummetabisulfit auf die Bildung dieses Maillard-Produktes mittels HPLC untersucht. 88

89 Isolierung eines Lactose-Lysin-Mallird-Produkte Abbildung 34: Einfluss von Na 2 S 2 O 5 auf die Bildung von Maillard- Produkten in der Maillard- Mischung (0,1M Lactose, 0,02M Lysin), die für 5 Stunden bei 120 C erhitzt wurde. Abbildung 34 zeigt, dass der Hauptpeak des HPLC-Chromatogramms nach Zusatz von 10 mm von Natriumbisulfit zu den Reaktionsmischungen kleiner wurde und von 50 mm vollständig verschwand. Folglich kann der Zusatz von hohen Konzentrationen des Inhibitors die Bildung dieses Produkts vollständig inhibieren. Im Folgenden sollte die Struktur des Produktes identifiziert werden. Dazu wurde dieses Maillard-Produkt mittels präparativer HPLC, wie in Abschnitt 7.3 beschrieben, isoliert Einfluss der Zeit auf die Bildung des Maillard-Produkts Um das unbekannte Produkt von einer möglichst großen Ausbeute isolieren zu können, wurde in diesem Teil der Einfluss der Arbeit der Erhitzungszeit auf die Bildung des Lactose-Lysin- Maillard-Produktes mittels HPLC untersucht. Dazu wurde die Lactose-Lysin-Mischung (0,1M Lactose und 0,02M Lysin in 0,1 M PBS-Puffer; ph 6,8) bei 120 C für14 Stunden erhitzt. Alle 60 Minuten wird eine Probe entnommen und mittels HPLC analysiert. Die Flächen unterhalb der jeweiligen Peaks der Substanz werden prozentual im Verhältnis zu den Gesamtprodukten der Reaktionsmischung dargestellt. Die gebildeten Substanzmengen abhängig von der Erhitzungsdauer sind in der Abbildung 35 dargestellt. 89

90 Isolierung eines Lactose-Lysin-Maillard-Produkte Abbildung 35: Einfluss der Erhitzungszeit auf die Bildung des Hauptprodukts der Lactose-Lysin- Maillard-Mischung. Die Substanz kann in der Probe bereits nach einer Stunde Erhitzungszeit detektiert werden. Nach fünf Stunden entstehen diverse unerwünschte Nebenprodukte. Deshalb wurden fünf Stunden Erhitzungszeit für die präparative Darstellung der ausgewählten Substanz in den folgenden Versuchen verwendet Isolierung von 2-Hydroxymethylfuran aus der Reaktionsmischung Eine Lösung von 0,1M Lactose Monohydrat und 0,02 M Lysin wurde PBS (0.1 M, ph=6,8) 5 Stunden bei 120 C erhitzt und anschließend im Eisbad gekühlt. Der Großteil des Wassers wurde mittels Rotationverdampfer aus der Reaktionsmischung entfernt. Die HPLC-Analyse des Rückstandes und des Destillats zeigten jedoch, dass die unbekante Verbindung unter diesen Bedingungen vollständig in das Destillat überging. Die Substanz wurde deshalb mittels Diethylether aus dem Destillat extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dann größten Teils unter reduziertem Druck abgedampft und die verbleibende Menge an Diethylether wurde im Stickstoffstrom entfernt. Die Substanz wurde aus dem Etherextrakt anschließen mittels präparativer HPLC (Acetonitril/Wasser als Elutionsmittel) isoliert. Das Acetonitril wurde anschließend aus der isolierten Fraktion mittels Rotationverdampfer entfernt und die Substanz wurde erneut aus der verbleibenden wässerigen Phase mit Ether extrahiert. Der Extrakt wurde mittels wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und Ether erneut mit einem Stickstoffstrom aus der Probe entfernt. Die gereinigte Substanz wurde bis zu den NMR- und LC-MS/MS -Messungen bei -20 C im Gefrierschrank aufbewahrt. 90

91 Isolierung eines Lactose-Lysin-Mallird-Produkte 0,4 8,75 ABS bei 219 nm 0,3 0,2 0, Retentionszeit [min] Abbildung 36: HPLC-Chromatogramm des unbekanntes Maillard-Produkts nach Extraktion und Reinigung aus einer erhitzten Lactose-Lysin-Mischung Identifizierung von 2-Hydroxymethyl-furan durch spektoskopische Methoden Nach der HPLC-Trennung und Reinigung des unbekannten Lactose-Lysin-Maillard-Produkts wurde ein Massenspektrum nach positiver Ionisierung angefertigt. Dabei wurde ein Hauptsignal bei einem Molekulargewicht von 98,0 erhalten. Weiterhin konnten vier Fragmente mit den Massen: 81, 69, 54, 45 detektiert wurden. Die Fragmente können durch eine Abspaltung von -OH, -CH 2 OH, und -CH 2 -CH 2 -OH bzw. erklärt werden. Abbildung 37: Massenspektrum des unbekannten Lactose-Lysin-Maillard-Produktes 91

92 Isolierung eines Lactose-Lysin-Maillard-Produkte In dem Massenspektrum der analysierten Probe hat bei der Verdampfkurve keinen deutlichen Peak gezeigt, die normalweise die Ionisationintensität als abhängig von der Vedampfzeit zeigt. Diese Kurve hilft bei der Bestimmung der zugehörigen Fragmente der analysierten Substanz, deshalb wurde LC/MS/MS als alternative Methode verwendet. LC/MS/MS-Spektrum zeigt zusätzlich zu den Substanzfragmenten häufig Wasser, Natrium oder Kalium Addukte der Substanz, was manchmal bei der Bestimmung der Gestammten Masse der Substanz hilft. Für eine LC-MS/MS-Messung wurde eine verdünnte Lösung der Substanz hergestellt und eine Messung der Proben, wie in Abschnitt 8.2 beschrieben, durchgeführt. Si gnalin te nsität [cps] ,9 58, , , ,2 49,9 80, ,1 63,2 78,8 94,8 110,2 126,2 141,7 157,5 173,9 189,2 m/z Abbildung 38: LC-MS/MS-Spektrum des unbekannten Produkts Das Spektrum der Probe zeigt mehrere Signale: m/z: 39 (M -59); 42 (M 56); 50 [M (-OH) - (-CH -OH)]; 56 [(M +1) - (-CH=CH -OH)]; 69 [(M+1)-(-CH -OH)]; 81(M - OH); 99 (M ); 117 [(M+1) +H 2 O]; 165 [(M+1) + H 2 O+ 2Na + ]; 187 (2M+1). Die restlichen Peaks wurden das Elutionsmittel verursacht. Die MS und LC/MS/MS-Spektren zeigen, dass es sich um einen Alkohol mit einem Molekulargewicht von 98 handelt, wobei die mögliche Abspaltungsfragmente: -OH, -CH2OH und -CH 2 CH 2 OH sind. Dazu bestätigen die Wasser- und Natriumaddukte diese Erklärung. Als nächstes wurde eine 1 H-NMR-Messung und 13 C NMR-Messung in CDCl 3 angefertigt. Dabei wurden folgende Signale detektiert: 92

93 Isolierung eines Lactose-Lysin-Mallird-Produkte Abbildung 39: 1 H-NMR-Spektrum des unbekannten Lactose-Lysin-Maillard Produktes. δ(ppm) = 2,59 (s), 4,6 (s), 6,4 (d), 6,46 (d), 7,38 (d). Abbildung 40: 13 C-NMR-Spektrum des unbekannten Lactose-Lysin-Maillard Produktes. Bei dem 13 C NMR-Messung wurden die folgende Signale detektiert: δ (ppm)= 57,4; 107,8; 110,4; 142,6; 154,1. Die Signale der der 13 C NMR und MS-Messungen zeigen, dass die Substanz ein Molekulargewicht von 98 und 5 Kohlenstoffmolekülen besitzt. Die Signale 110,4 und 143,6 werden hervorgerufen durch die Kohlenstoffe C2 und C3 eines Furanrings. Das 93

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