Testbericht Dionex UltiMate 3000 RSLC-Systeme.

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1 Testlabor des HCI ETH Zürich Science City 8093 Zürich Koordinator: Thomas Mäder HCI G Zürich, Testbericht Dionex UltiMate 3000 RSLC-Systeme Inhaltsverzeichnis: Kapitel Thema Seite 1 Allgemeine Betrachtungsweise bei der Beschaffung von HPLC-Geräten 2 2 Einsatz von UltiMate 3000-Systemen an der ETH-Zürich 3 3 Beschreibung der UltiMate 3000-Gerätesysteme in der Forschungsgruppe von 4 Prof. Helma Wennemers 4 Kurzbeschreibung/Schemas der modularen UltiMate 3000-Gerätekomponenten 6 5 Beschreibung der Chromeleon-Software Beurteilung der UltiMate 3000 Gerätesysteme durch die Forschungsgruppe Prof. 8 Helma Wennemers Anhang Chromatogramm eines Forschungsproduktes mit DAD- und MS-Detektion 11 1

2 1. Allgemeine Betrachtungsweise bei der Beschaffung von HPLC-Geräten Die Wahl der UHPLC-/HPLC-Technik zur Lösung eines bestimmten Trennproblems hängt von einer Vielzahl von Parametern ab: 1.1 UHPLC Hochleistungs-Analytik In der Hochleistungs-Analytik werden für schnelle Trennungen kurze und schmale Säulen eingesetzt, enthaltend Trägermaterialien mit Korngrößen 2 µm. Ihr Anschaffungspreis ist zwar relativ hoch, sie sind aber gegenüber klassisch gepackten Säulen viel ökologischer zu betreiben. Kurze Säulen mit Partikeln von 2 µm Durchmesser ergeben zwar hochauflösende Trennungen, jedoch steigt der Energieaufwand, um die Lösungsmittel durchzupumpen. Der Gegendruck kann im Extremfall 1000 bar übersteigen. Die Anforderungen an die Anlagenbauteile sind damit deutlich gestiegen. Apparativ wurden dafür Druckresistente Verschleißteile, schnelle, verschleppungsarme Probengeber und empfindlichere Detektoren mit höherer Datenaufnahmerate entwickelt. Mit dieser von Waters begründete Geräteentwicklung eröffnete sich für die Hochleistungs-Analytik ein neuer Zweig, die UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography). Nachteile der UHPLC-Geräteklassen sind ein hoher Anschaffungspreis, kostspieliger Unterhalt und Service, eine große Empfindlichkeit gegenüber Verunreinigungen in den Eluenten, bei der Injektion der Probe und dem Totvolumen im System. 1.2 Hochleistungs-Analytik mit monolithische Trennsäulen Für die Hochleistungs-Analytik können auch kurze und schmale monolithische Trennsäulen eingesetzt werden, die aus einem einzigen Stab hochreinen nicht modifizierten/modifizierten Kieselgels bestehen und sich durch einen besonders kleinen Strömungswiderstand auszeichnen. Hierbei können normale HPLC-Gerätesysteme mit HPLC Standardmaterialien eingesetzt werden, die nicht den Anforderungen für hohe Gegendrücke entsprechen müssen. 1.3 HPLC Standard-Analytik Für die Standard-Analytik haben sich auch hierbei mit neuen Trägermaterialien in den Trennsäulen die Trennleistungen allgemein massiv verbessert. Für die meisten Trennmethoden ist daher die klassische HPLC-Technik nach wie vor ausreichend. Die neuen HPLC-Systeme auf dem Markt verfügen mittlerweile auch über eine leistungsfähigere Technologie bei der Pumpe, leistungsfähigerer Probeinjektion und Detektion mit höherer Datenaufnahmerate. 1.4 RSLC-Systeme von Dionex Die Gerätemodule der RSLC-Systeme (Rapid Separation Liquid Chromatography) können - für die UHPLC-Hochleistungsanalytik bis 1034 bar, - wie auch für die Standard-Analytik bis 620 bar mit HPLC Standardmaterialien eingesetzt werden. Je nachdem welche Analytik-Anforderungen erfüllt werden müssen, werden RSLC-Geräte entsprechend a oder b bestellt und eingerichtet. Danach richten sich auch die Preise für die RSLC-Systeme. 1.5 Semipräparative Trennungen Für präparative Trennungen werden in der Regel dafür separate HPLC-Anlagen eingesetzt, meist mit höheren Durchflussraten und größeren Dimensionen des Injektionssystem, der Detektorzellen, der Leitungen. Mittels der Standard-Analytik lassen sich optimierte Trennbedingungen von analytischen Anlagen besser und direkter auf präparative Anlagen und Säulen übertragen. Vorzugsweise sollte das Säulenmaterial der analytischen mit der präparativen Säule übereinstimmen. 2

3 1.6 Quaternäre Niederdruckgradienten-Systeme Sowohl in der allgemeinen HPLC-Technik, wie aber auch bei den RSLC- und UHPLC-Systemen haben sich in der ETH die quaternären Niederdruckgradienten-Systeme gegenüber den Hochdruckgradienten-Systemen am besten etabliert. Bei den Hochdruckgradienten-Systemen wird pro Eluent eine separate Pumpe benötigt, da die Eluenten erst im Hochdruckbereich gemischt werden. Bei einem quaternären Niederdruckgradienten-System wird für vier verschiedene Eluenten nur eine Pumpe benötigt. Über zeitgeschaltete Ventile werden die Eluenten im Niederdruckbereich angesaugt und vermischt. Für die normalen analytischen Trennungen, wie auch für präparative Trennungen reichen Niederdruckgradienten-Systeme in der Regel aus. Diese weisen generell eine größere Flexibilität und geringere Anschaffungskosten aus, sind leicht zu bedienen. 2. Einsatz von UltiMate 3000-Systemen an der ETH Zürich, Institut für Organische Chemie 2.1 Für die Ausbildung RSLC-Anlagen werden für das Chromatographie-Praktikum im Hochschulbetrieb verwendet. Ziel der vertieften chromatographischen Ausbildung im Praktikum ist, den Praktikanten folgende Fähigkeiten zu vermitteln: - Für ein bestimmtes Trennproblem die anzuwendende HPLC-Technik definieren und die entsprechende Säule auswählen. - Selbständig die Qualität und Trenneigenschaften einer HPLC-Säule mit Testgemischen erfassen und mathematisch charakterisieren. - Nach der Probeaufarbeitung selbständig die besten Trennbedingungen evaluieren. - Technische Störungen der Geräte rechtzeitig erkennen und allenfalls beheben. - Selbständig Methoden-Validierungen ausführen. Im Rahmen des Praktikums können die Praktikanten nach der ausgearbeiteten Methodenentwicklung in Lebensmittelproben quantitativ Coffein- und optional Theobromin-Bestimmungen ausführen. Dabei ist eine Probenaufarbeitung nötig. Die Quantifizierung erfolgt über eine zu erstellende Kalibration. Die Ausbildung beinhaltet auch Aspekte der Methoden-Validierungen und die Übertragung analytischer Trennbedingungen auf die präparativen Anlagen. Open Access: Open Access bedeutet die freie Nutzung des Gerätes durch die Benutzer, wobei Säule, Eluenten und Methode vorgegeben sind. Voraussetzung für ein funktionierendes Open Access System ist ein integrierter Autosampler, die Vernetzung der Steuerungsrechner und eine adäquate Bedienersoftware. Die Praktikanten füllen nur noch ihre aufgearbeiteten Proben in den Autosampler, geben am PC-Terminal des Systems die Probensequenzen ein und starten selbständig die Analyse. Während das System automatisch die Probensequenzen chromatographiert, können die Praktikanten an anderen PC-Terminals, sofern vorhanden, die Auswertungen vornehmen und protokollieren. 2.2 Für die Forschung Im Institut für Organische Chemie der ETH Zürich haben sich die RSLC-Geräte für die Standard- Analytik bis 600 bar am besten etabliert. Obwohl auch Geräte für die UHPLC Hochleistungs-Analytik bis 1034 bar eingerichtet worden sind, ist bisher im gesamten Institut noch kein Trennproblem bearbeitet worden mit Gegendrücken > 600 bar. Die nachfolgend beschriebenen Geräte werden in der Forschungsgruppe von Prof. Helma Wennemers eingesetzt. Die Forschungsgruppe Wennemers beschäftigt sich mit Peptiden und deren Anwendung in einer Vielzahl von Bereichen. Dabei werden Umkehrphase HPLC-Techniken vor allem zur Reaktionskontrolle, der Reinheitsanalytik und der Reinigung mittels präparativen Anlagen eingesetzt. Zusätzlich dient ein als Normalphase betriebenes System mit chiraler stationärer Phase der Bestimmung der optischen Reinheit von Reaktionsprodukten. Auf Grund der unterschiedlichen Forschungsbereiche einzelner Gruppenmitgliedern sind dabei die individuellen Methodenentwicklungen und ein Open Access - Betrieb der Systeme unabdingbar. 3

4 Kurz-Schema der Forschungsausrichtung der Gruppe Wennemers: Asymmetric Catalysis Collagen Model Peptides Molecular Scaffolds Silver Nanoparticles 3. Beschreibung der UltiMate 3000-Gerätesysteme in der Forschungsgruppe von Prof. Helma Wennemers 3.1 Die UltiMate 3000 RSLC für die Hochleistungs-Analytik bis 1034 bar mit MS-Kopplung HPG-3400RS Binäre Hochdruck-Gradientenpumpe mit SmartFlow TM ; Flussbereich ml/min; max bar (bis 5 ml/min). SRD Kanal Vakuumentgasung. WPS-3000RS Probengeber für Standardvials mit split-loop Prinzip. TCC-3000RS Säulenthermostat; Temperaturbereich C. DAD-3000RS Photodiodenarray-Detektor; nm; Messfrequenz 200 Hz. Dieses MS-gekoppelte UHPLC-System (Dionex Ultimate 3000 mit Bruker AmaZon Speed) wird hauptsächlich zur Reaktionskontrolle und Reinheitsbestimmung verwendet. Typische Analysen von Peptiden werden mit einem steilen Gradienten von 90-10% Wasser/Acetonitril in 15 Minuten unter Verwendung einer 3µm Säule (Reprosil Gold, 120, C18, 3µm, 125x3mm) durchgeführt. Kurze Methoden mit tiefen Minutenbreich erwiesen sich als für Peptide wenig praktikabel. Hingegen werden kleinere, organische Moleküle mit kurzen Methoden von weniger als 5 Minuten getrennt. 4

5 3.2 UltiMate 3000 Standard-Systeme für die Standard-Analytik bis 620 bar LPG-3400SD Quaternäre Niederdruck-Gradientenpumpe; Flussbereich bis 10 ml/min; max. 620 bar. SRD Kanal Vakuumentgasung. WPS-3000SL Probengeber für Standardvials mit split-loop Prinzip. TCC-3000SD Säulenthermostat; Temperaturbereich 5 80 C. Für Umkehrphase: MWD-3000 Mehrwellenlängen-Detektor (bis zu 8 Wellenlängen gleichzeitig); nm; Messfrequenz 100 Hz Für Normalphase: DAD-3000 Photodiodenarray-Detektor; nm; Messfrequenz 100 Hz. AFC-3000 Fraktionensammler. Das analytische UltiMate 3000 System (Umkehrphase) findet einerseits Anwendung in der Methodenentwicklung für präparative Trennungen, andererseits zur Reinheitskontrolle präparativ getrennter Peptide. Dabei kommen eine Vielzahl unterschiedlicher Methoden und Gradienten zur Anwendung. Das analytische UltiMate 3000 System (Normalphase) dient der Bestimmung der optischen Reinheit von Reaktionsprodukten mittels chiraler stationärer Phase. Dabei finden unterschiedlichste chirale stationäre Phasen und Methoden Anwendung, wobei ein besonderer Fokus auf der Methodenentwicklung für neue Produkte liegt. 5

6 3.3 UltiMate 3000 Semipräparativ (nur als Hochdruckgradienten-System erhältlich) HPG-3200BX Binäre Hochdruck-Gradientenpumpe; Flussbereich ml/min; max. 165 bar (bis 30 ml/min). WPS-3000SL Semiprep.Probengeber für Standardvials mit split-loop Prinzip; optimiert für Einspritzvolumen von µl. Jet II Plus HPLC Säulenthermostat; Temperaturbereich 5 85 C. MWD-3000 Mehrwellenlängen-Detektor (bis zu 8 Wellenlängen gleichzeitig); nm; Messfrequenz 100 Hz. AFC-3000 Fraktionensammler. Das Semipräparative UltiMate 3000 System dient zur präparativen Aufreinigung von Peptiden (2 500 mg Substanz pro Injektion). Dabei werden auf dem oben genannten analytischen System optimierte Methoden auf Säulen mit identischer Packung für typische Flussraten von 1, 6 und 30 ml/min übertragen. Der Wunsch für ein präparatives UltiMate 3000 Niederdruck-Gradientensystem konnte Dionex uns nicht erfüllen. 4. Kurzbeschreibung/Schemas der modularen UltiMate 3000-Gerätekomponenten - Schema einer UltiMate 3000 Quaternary Analytical Pump mit eingebautem 4-Kanal-Solvent- Degasser 6

7 - Schema eines UltiMate 3000 Autosamplers - Chromatographie-Darstellungen eines UltiMate 3000 Photodiode Array Detektors, Wellenlängenbereich nm, bis 100 Hz Data Collection Rate für die Standard- Analytik, bis 200 Hz für die Hochleistungs-Analytik, Aufzeichnung bis zu 8 Single- Wellenlängen inkl. 3D-Spektrum 5. Beschreibung der Chromeleon-Software Funktionsweise Die Chromeleon-Software verknüpft und steuert alle Gerätemodule, die zu einer HPLC-Anlage gehören. Dabei können weitgehend auch Gerätemodule von Drittherstellern in das System integriert werden, was von der Software unterstützt wird. Abgesehen davon wird die Chromeleon-Software auch in Gerätesystemen anderer Hersteller als Dionex erfolgreich eingesetzt. Die hier beschriebene Software, Chromeleon Version 6.8, wurde je nach Gerätekonfiguration auf dem Betriebssystem Windows XP oder Windows 7 installiert. Gestartet wird die Software durch Doppelklick auf das entsprechende Icon. Der im Hintergrund wirkende Chromeleon-Server wird je nach Einstellung im Autostart beim Aufstarten von Windows automatisch in Betrieb gesetzt. 5.2 Inbetriebnahme Nach dem Aufstarten der Software zeigt sich der Aufbau des Programms mit den Grundelementen Panels (Hardwarekontrolle), Programs (Trennbedingungen, Hardware-Einstellungen), Sequences (Probesequenzen), Methods (Auswertemethoden) und Reports (Protokollierung). Beim Aktivieren des Panel-Files erscheint die Übersicht über die Gerätemodule (eine Art virtueller Kontrollraum), welche die UltiMate 3000 HPLC-Anlage bilden. Die Panel-Files sind im Chromeleon als Vorlage enthalten und können gegebenenfalls kundenspezifisch angepasst werden. 7

8 5.3 Smart Startup Die Smart Startup Funktion ermöglicht das erstmalige Equilibrieren des HPLC-Systems auf der Grundlage jener Trennmethode, die später für die Probensequenzen eingesetzt wird. Mit der Funktion werden die Purge-Prozesse bei der Pumpe und beim Autosampler in Betrieb gesetzt, die Temperatur des Säulenofens und die Detektorbedingungen eingestellt und das Trennsystem equilibriert. Mit der Funktion überprüft das System auch seine eigene Stabilität. Die Freigabe für den Open Access Betrieb erfolgt erst nach der erfolgreichen Equilibrierung. 5.4 Erstellung und Verwaltung der Programme und Probensequenzen Für die Erstellung der Programme (Trennbedingungen, Hardware-Einstellungen) und Probensequenzen steht ein Wizard (Assistent für Dateneingabe) zur Verfügung, der den Benutzer anleitet. Die Resultate der chromatographierten Probensequenzen können in individuellen Benutzer-Ordnern abgelegt werden. Die Rohdaten der Chromatogramme sind mit den Programm-, Auswerte- und Protokollierungsfiles verknüpft und werden so automatisiert verarbeitet und ausgewertet. Für die Erstellung der Auswerte- und Protokollierungsfiles steht noch kein Wizard zur Verfügung. 5.5 Smart Shutdown Analog zur Smart Startup Funktion erfolgt mit dem Smart Shutdown die automatisierte Abschaltung des Systems. Die Pumpe und der Autosampler werden gespült, die Lampe des Detektors wird sofort ausgeschaltet. Nach der Spülung werden die Gerätemodule im Standby-Betrieb gehalten oder je nach Programmierung ganz ausgeschaltet. 6. Beurteilung der UltiMate 3000 Gerätesysteme durch die Forschungsgruppe Prof. Helma Wennemers Der folgende Testbericht bezieht sich auf die zur Verfügung gestellte UltiMate 3000 HPLC-Anlage, wobei der Vollständigkeit halber auch Erfahrungen mit den anderen Systemen in die Beurteilung einfliessen. 6.1 Pumpe Die sichtbaren Komponenten der RSLC-Pumpe sowie sämtliche Anschlüsse sind übersichtlich gestaltet, was nicht nur den Unterhalt erleichtert, sondern auch die einzelnen Arbeitsschritte des Gerätes (Degasser, Mischkammer, Hinterkopfspülung) auch für einen ungeübten Betrachter nachvollziehbar macht. So können kleinere Wartungsarbeiten wie das Auswechseln der Pumpenkopfdichtungen, der regelmäßigen Reinigung der CheckValves vom Benutzer selbst ausgeführt werden. Die Pumpen arbeiten stabil und zuverlässig über einen grossen Druck- und Flussratenbereich, wie er in der Forschungsgruppe benötigt wird. Dabei fällt auch der leise Betrieb der Pumpe auf. Das Purgen der Pumpenköpfe (wenn Eluenten gewechselt werden), der Degasser- Betrieb, die Hinterkopfspülung lassen sich einfach durch die Software steuern. Eine separate Mini-Schlauchquetschpumpe spült mit Waschlösung aus einem Vorratsgefäss die hinteren Pumpenköpfe; siehe nachfolgendes Schema: 8

9 Abb.: Mini-Schlauchquetschpumpe für die Hinterkopfspülung Wird diese Hinterkopfspülung nicht korrekt ausgeführt, führt dies im Pumpenkopf zu Schäden, vor allem wenn Eluenten mit Puffer- oder Säurezusätzen eingesetzt werden. Die Folge können minimale Auskristallisationen sein, welche die Pumpenkopfdichtungen und sogar die Saphirkolben zerkratzen können. Die Zusammensetzung der geeigneten Waschlösung für die Hinterkopfspülung bei der Verwendung von Umkehrphase ist 10% Methanol in Wasser, bei der Verwendung von Normalphase ist es Isopropanol mit 0.1% Schwefelsäure (zur Erhöhung der Leitfähigkeit). Als bei der Verwendung von Umkehrphase für die Hinterkopfspülung Isopropanol in Wasser eingesetzt wurde, mussten überraschenderweise beim RSLC-Gerät für die Hochleistungs-Analytik deswegen die Saphirkolben der Pumpenköpfe bereits nach 8 Monaten wegen erheblichen Verschleißerscheinungen und Kratzspuren ersetzt werden. Der Schlauch für die Mini-Schlauchquetschpumpe muss bei allen RSLC- Geräten mindestens 1x jährlich ersetzt werden. 6.2 Probengeber Der Probengeber ist groß, übersichtlich, bietet Platz für unterschiedliche Probenracks (3 Positionen) und sogar für Microtiterplatten. Dabei helfen gut verständliche Farb-, Buchstaben- und Zahlencodes der einfachen Identifikation der Probenposition. Der Aufbau ist wiederum auch für ungeübte Betrachter verständlich gestaltet, was kleinere Anpassungen wie zum Beispiel den Wechsel des Injektionsloops durch den Benutzer ermöglicht. Die Injektionsnadel ist Bestandteil des Loops, was eine Verlustfreie Injekton der Probe ermöglicht. Auf der anderen Seite muss penibel genau darauf geachtet werden, dass beim Äquilibrieren der Säule der Loop in der inject-position ist. Nach dem Purging der Pumpe kann der Loop, je nach Eingabe der Parameter, automatisch in die load-position schalten, was manuell rückgängig gemacht werden müsste. Wird dies nicht beachtet, kann es die Reproduzierbarkeit der Chromatogramme beeinträchtigen. Das Purging der Pumpe kann durch einen Wash-Port direkt über die Probennadel erfolgen, was ein regelmäßiges Waschen der Probennadel unnötig macht. Der Probengeber erkennt ein Fehlen des Sample-Vials automatisch. Außerdem wird auch ein unüblicher Widerstand des Sample-Vials erkannt, was die Lebensdauer der Injektionsnadel verlängert. Generell wurden mit dem Probengeber gute Erfahrungen gemacht vor allem auch mit kleinen Einspritzvolumina. Dabei ist darauf zu achten, dass sich in der Spritze keine Luftblasen befinden, welche, vor allem bei der großen Spritze des präparativen Systems, häufig manuell entfernt werden müssen. 6.3 Säulenofen Der Säulenofen fällt vor allem durch relativ schnelle Aufheiz- sowie auch Abkühlgeschwindigkeiten auf. Besonders angenehm sind auch die Halterungen, womit mehrere Säulen gleichzeitig im Säulenofen angeschlossen sein können. Mehrwegventile, die über die Software auch vollautomatisch angesprochen werden können, ermöglichen die Verwendung unterschiedlicher Säulen auch innerhalb einer einzelnen Sequenz. Dies ermöglicht es, die Methodenentwicklung in einem gewissen Ausmass zu automatisieren. 9

10 6.4 Detektor Der Detektor arbeitet schnell und zuverlässig. Besonders eindrücklich ist die hohe maximale Aufnahmefrequenz. Dabei muss aber genau darauf geachtet werden, dass die Aufnahmefrequenz dem jeweiligen Trennproblem angepasst wird, da bei zu hoher Aufnahmefrequenz unnötigerweise grosse Datenmengen generiert werden. Die beiden Lampen sind gut zugänglich und können bei Bedarf vom Benutzer selbst ausgewechselt werden, wobei Ersatzlampen ein nicht zu unterschätzender Kostenfaktor sind. Der Detektor erkennt eine Störung oder das Fehlen einer Lampe automatisch und generiert präzise und eindeutige Fehlermeldungen. In seltenen Fällen wurden Kommunikationsprobleme zwischen Detektor und Software beobachtet, die durch Ausschalten der Lampen sowie des Detektors (mittels Kippschalter) einfach gelöst werden konnten. 6.5 Allgemeine Bemerkungen zum Betrieb der UltiMate3000 Anlage Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die UltiMate 3000 Geräte in der Forschungsgruppe in unterschiedlichsten Anwendungen stabile und solide Arbeit leisten. Auch die Kopplung einer UltiMate3000 Anlage mit einem MS-System (Bruker-AmaZon Speed) funktioniert problemlos, wobei diese Kopplung softwareseitig noch Verbesserungspotential besitzt (HyStar). Außerdem werden auch nach monatelangem Betrieb weiterhin Weichmacher aus dem HPLC-System eluiert, welche zwar kein UV-Signal ergeben, wohl aber mittels MS detektierbar sind. Von wo her die Kontamination der Weichmacher stammt, ist noch in Untersuchung. Es kann aber mittlerweile ausgeschlossen werden, dass die Kontamination innerhalb des HPLC-Systems verursacht wird. Von der HPLC-Seite her ist die Softwarelösung (Chromeleon 6.80) ausgesprochen gelungen. Die Geräte lassen sich über meist selbsterklärende Softwarepanels ansteuern. Ausführliche log-files erlauben dem Benutzer eine präzise Diagnose bei Schwierigkeiten. Die Software ermöglicht ungeübteren Benutzern Programme mithilfe eines verständlichen Wizards zu generieren. Trotzdem ist es auch möglich die einzelnen Parameter direkt in einem Programmtext zu ändern, was Benutzern mit etwas mehr Erfahrung ein schnelles Arbeiten ermöglicht. Dabei muss auch die hervorragende Einführung durch die Herstellerfirma erwähnt werden, die den Benutzern den Einstieg in die neue Software erleichterte und ein sofortiges erfolgreiches Arbeiten mit den Systemen ermöglichte. Im Grossen und Ganzen ermöglicht die UltiMate 3000 HPLC-Lösung ein erfolgreiches Arbeiten unter Benutzung einer Vielzahl unterschiedlicher Methoden, Gradienten und Säulen und bietet so die Flexibilität und Individualität, wie sie in einer Forschungsgruppe wo unterschiedliche Forschungsprojekte mit verschiedenen Ansprüchen an die HPLC parallel bearbeitet werden, unabdingbar ist. Für quantitative Auswertungen mit internen Standards kann die Chromeleon-Software noch nicht beurteilt werden. 10

11 Anhang: Chromatogramm eines Forschungsproduktes mit DAD- und MS-Detektion mit der RSLC-Anlage gemäss 3.1 Molekül: Der Hauptpeak im ESI bei entspricht [M+2H]2+, der benachbarte Peak entspricht [M+H+H2O]2+. 11