PRAKTIKUMSTEIL BIOCHEMIE (1. Studienjahr)

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1 60 PRAKTIKUMSTEIL BIOHEMIE (1. Studienjahr) PLATZ 4: AMINOSÄUREN UND PROTEINE Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Aminosäuren und Proteinen sind eng mit ihrer Fähigkeit verknüpft, Protonen abzugeben und aufzunehmen. Ein Ziel dieses Platzes ist, die ph-abhängigen Ladungsverhältnisse von Aminosäuren und Proteinen verständlich zu machen. Voraussetzung ist das generelle Verständnis des Verhaltens ionisierbarer Gruppen, sowie die damit verknüpfte Bedeutung und Verwendung als Puffersubstanzen (Exp. 4.1, vergleiche auch die Pufferfunktion von Hämoglobin, 2. Studienjahr). Zur Illustration der ph-abhängigkeit von Enzymreaktionen dient Exp und der Reaktionsmechanismus von hymotrypsin (Exp. 10.1, 2. Studienjahr). Im nativen Zustand nehmen Proteine eine definierte Raumstruktur ein, welche durch die physikalischchemischen Eigenschaften von Aminosäuren in ihrer Abfolge in der Aminosäurensequenz bestimmt ist. In globulären Proteinen befinden sich polare, hydrophile Aminosäurereste hauptsächlich an der Proteinoberfläche, wo sie mit Wasser interagieren. Ausgeprägt hydrophobe Aminosäurereste sind im nativen Zustand überwiegend im für Wasser nicht zugänglichen Proteininnern verborgen. Nach Denaturierung kommen apolare Aminosäurereste mit Wasser in Kontakt und erniedrigen die Löslichkeit des Proteins. Vorbereitung: Aminosäuren und Proteine (S. 10) ph-messung und Titration (S. 20) Photometrie (S. 31) Absorption von Proteinen im UV-Bereich (S. 12) Denaturierung von Proteinen (S. 15) Bezug zu anderen Plätzen (2. Studienjahr): Trennung von Aminosäuren und Proteinen aufgrund ihrer elektrischen Ladung (Platz 4) Titration von Hämoglobin (Platz 2) Proteinbestimmung nach der Biuret-Methode (2. Studienjahr, Platz 4)

2 61 EXPERIMENT 4.1: Titrationskurven von Aminosäuren Prinzip: Die in 0.1 M Hl gelöste protonierte Form einer Aminosäure (Histidin, Glutaminsäure, Glycin oder Lysin) wird mit 0.25 M NaOH bis ph 12 titriert. Die Titrationskurve der Aminosäure wird aus der Differenz des Basenverbrauchs der Lösung und des "Lösungsmittels" (0.1 M Hl in H 2 O) ermittelt. Aus der Titrationskurve werden pk a -Werte, IEP und Konzentration der Aminosäure bestimmt. Ausführung: Vor Versuchsbeginn Bedienungsanleitung des ph-meters lesen und ph-meter mit der aufgestellten ph-eichlösung eichen. Bürette sorgfältig mit 0.25 M NaOH (bis etwa 3 cm über das Skalenende) füllen (Schutzbrille). Meniskus bis zum oberen Ende der Skala absinken lassen (Lauge in Plastikbecher fliessen lassen) und genaue Position ablesen. a) Magnetrührstäbchen in mit Wasser gespültes 100 ml Becherglas legen und 40.0 ml der aufgestellten Aminosäurelösung zugeben. Magnetrührer abschalten. Mit Wasser abgespülte Elektrode vorsichtig eintauchen (darf Rührstäbchen nicht berühren) und ph-wert ablesen. Magnetrührer wieder einschalten. Titration durch Zugabe von kleinen Mengen ( ml) NaOH ausführen. Nach jeder Zugabe Volumen der verbrauchten Lauge und ph notieren. ph-werte als Funktion des Laugenverbrauchs aufzeichnen (bipweb Auswertehilfe; oder auf Millimeterpapier auftragen, Abszisse: ml NaOH (1 cm = 2 ml); Ordinate: ph (1 cm = 1 Einheit). b) Wiederholung der Titration von 40.0 ml "Lösungsmittels" (= 0.1 M Hl). Messwerte in die gleiche Auswertungstabelle im bipweb eintragen (bzw. auf das gleiche Millimeterpapier auftragen). Auf der ausgedruckten graphischen Darstellung die Titrationskurve der Aminosäure aus der Differenz des Basenverbrauchs von Titration (a) und (b) (= horizontaler Abstand der erhaltenen Kurven) in Intervallen von 0.5 ph-einheiten ermitteln und einzeichnen. Äquivalenzpunkte und pk a -Werte bestimmen und die molare Konzentration der Aminosäurelösung berechnen (Hilfe unter bipweb). Welche Aminosäure wurde titriert? Konsultieren Sie die Tabelle im Theorieteil S. 25. In welcher Konzentration lag die Aminosäure vor? Berechnen Sie den IEP der titrierten Aminosäure auf Grund der von Ihnen bestimmten pk a -Werte.

3 62 EXPERIMENT 4.2: Bestimmung des pk a -Wertes der seitenkette Prinzip: 1.2 ph ph 9.7 ph 13 Extinktion Wellenlämge, nm Absorptionsspektrum von bei verschiedene ph-werten hat bei neutralem ph ein Absorptionsmaximum bei 273 nm (Kurve ph 7, Seitenkette vollständig protoniert), im basischen Bereich nach Deprotonierung der Seitenkette (phenolische OH- Gruppe) jedoch bei 295 nm (Kurve ph 13, vollständig deprotoniert in 0.1 M NaOH). Im leicht alkalischen Bereich ist das Spektrum eine Überlagerung der Spektren bei ph 7 und ph 13 (Kurve ph 9.7). Bei 300 nm absorbiert nur die deprotonierte seitenkette, deren Konzentration daher direkt proportional zur Absorption bei 300 nm ist. Der pk a -Wert der seitenkette lässt sich somit nach der Beziehung pk a = ph - log [-O - ]/[-OH] bestimmen. Das Verhältnis [-O - ] zu [-OH] im leicht alkalische ph-bereich kann direkt durch Messung der Absorption bei 300 nm bestimmt werden. In einer leicht alkalischen Probe ist die Konzentration von [-O - ] proportional zur Absorption bei 300 nm. Die Konzentration von [-OH] ist proportional zur Differenz der gesamt konzentration gemessen aus der Absorption bei 300 nm bei ph 13 und der Absorption bei 300 nm in der leicht alkalischen Probe (in der Abbildung Differenz bei 300 nm zwischen den Kurven ph 13 und ph 9.7). Lösungen: - 3 mm

4 63 - Puffer: Na-Phosphat-Puffer 0.1 M, ph 7.0; Na-Hydrogencarbonat/arbonat 0.1 M, ph 9.7; Na-Hydrogencarbonat/arbonat 0.1 M, ph NaOH 0.1 M Ausführung: Vier Röhrchen beschriften und wie folgt ansetzen (Volumina in ml) und mischen: A B D 3 mm Na-Phosphat ph Na-Hydrogencarbonat/arbonat ph Na-Hydrogencarbonat/arbonat ph NaOH 0.1 M 1 E 300 nm 0 E (D-B bzw D-) pk a Die Extinktion bei 300 nm von A (Blindwert) auf Null abgleichen. Die Extinktion der Proben B, und D bestimmen und bei den Proben B und mit Hilfe der Auswertungstabelle im bipweb den pk a - Wertes berechnen. Auswertung: Wie gross ist der Mittelwert des pk a -Wertes der seitenkette? Wie gross ist er im Vergleich zum pk a -Wert der α-aminogruppe von? Zeichnen Sie, wie bei ph 9.5 und 11.5 vorliegt. Bezeichnen Sie jenen Teil des Moleküls, welcher für die Absorption bei 280 nm und 300 nm verantwortlich ist. ph 9.5 ph 11.5

5 - Zeichnen Sie die Strukturformel der Komponenten der im obigen Experiment verwendeten Pufferlösung von ph Wie gross ist der pk a -Wert dieses Puffersystems? (bipweb Lexikon!) 64 EXPERIMENT 4.3: Gleichgewichtsverteilung von, der seitenkette (p-kresol) und Tryptophan in Butanol und Wasser Prinzip: Zwei nicht mischbare Flüssigkeitsphasen, eine wässrige und eine hydrophobe organische Phase, dienen als vereinfachtes Modell globulärer Proteine. Dabei stellt die wässrige Phase die hydrophile Proteinoberfläche und die organische Phase das hydrophobe Proteininnere dar. Mit diesem Model kann das Verhalten freier Aminosäuren und von Aminosäurenseitenketten im Proteinverband untersucht werden. Im folgenden Experiment wird die Gleichgewichtskonzentration verschiedener Substanzen in der Wasserphase und der organischen Butanolphase bestimmt. Das Verhältnis der Konzentration einer Substanz in den beiden Flüssigkeitsphasen im Gleichgewicht wird als ihr Verteilungskoeffizient K org./wässrig bezeichnet. Aus dem Verteilungskoeffizienten lässt sich die freie Energie G o' des Transfers der Substanz von Wasser in Butanol berechnen ( G o' = - R*T ln K org./wässrig ). Für den Transfer einer Aminosäure von Wasser in die organische Phase bzw. von Wasser in den hydrophoben Proteinkern gilt in Näherung G o' (Aminosäure) G o' (Glycin) + G o' (Aminosäureseitenkette). Glycin O O O O H NH 3 + H NH 3 + H H 3 H 2 p-kresol OH OH Damit sich eine Aminosäure im Proteinverband ins Proteininnere verbirgt, muss im allgemeinen die treibende freie Energie des Transfers der Seitenkette negativ sein. Damit auch die stark polaren Amidund arbonylgruppen der Proteinhauptkette ins Innere gelangen, müssen diese durch die Ausbildung einer Sekundärstruktur Wasserstoffbindungen eingehen können und/oder mit andern Aminosäurenseitenketten eine Wasserstoffbindung ausbilden. Amid- und arbonylgruppen bilden mit dem Wasser auch Wasserstoffbindungen, welche beim Transfer gebrochen und im Proteininneren neu gebildet werden, wodurch die Nettoenergie der Wasserstoffbindungen beim Transfer von Wasser ins Proteininnere ausgeglichen bleibt.

6 Bei 275 nm ist der millimolare Extinktionskoeffizient in der wässrigen und organischen Phase gleich gross. Der Verteilungskoeffizient der untersuchten Substanzen zwischen der organischen Butanol- Phase und der wässrigen Phase K org./wässrig kann deshalb direkt aus dem aus dem gemessenen Extinktionsverhältnis E org /E wässrig berechnet werden. 65 Lösungen: - 3 mm in Wasser - Tryptophan 1 mm in Wasser - p-kresol 2 mm in Wasser - Pufferlösung: Tris-Hl-Puffer 0.1 M, ph Butanol (Isobutanol) Ausführung: Nach Beendigung der folgenden Experimente, alle Butanol enthaltenden Lösungen im dafür vorgesehenen Behälter sammeln. Vier Glasröhrchen beschriften und nachstehende Lösungen zugeben (Volumina ml): Blindwert p-kresol Tryptophan BL A B Pufferlösung ph Wasser p-kresol 0.1 Tryptophan Butanol E 275 nm organische Phase E 275 nm wässrige Phase E org. /E wässrig 1. Röhrchen der Reihe nach je 10 Sekunden auf dem Vortexschüttler kräftig mischen, die Phasentrennung abwarten und anschliessend Röhrchen nochmals 10 Sekunden mischen und stehen lassen, bis sich die organische Phase (oben) vollständig von der wässrigen Phase (unten) getrennt

7 66 haben. 2. In vier kleine beschriftete Plastikröhrchen org.-bl, org.-a, org.-b und org. - je 0.2 ml 2-Butanol vorlegen und genau 1.0 ml der oberen organischen Phase der Proben BL, A, B und in die entsprechenden Röhrchen pipettieren und gut mischen (Vortex-Schüttler). Ebenso in vier w-bl, w-a, w-b und w- beschriftete Plastikröhrchen 0.2 ml Wasser vorlegen. Mit der Plastikspitze der automatischen Pipetten vorsichtig durch die organische Phase durchstechen und 1.0 ml der unteren wässrigen Phase der Proben BL, A, B und in die entsprechenden Röhrchen pipettieren und gut mischen (Vortex-Schüttler). 3. Inhalt von Röhrchen org.-bl in Quarzküvette giessen und Photmeter bei 275 nm auf Null abgleichen. Küvetteninhalt wieder in Röhrchen zurück giessen; Küvette nicht ausspülen, sondern umkehren und Flüssigkeitsrest mit Papiertüchlein abtupfen. Nun die Extinktion der Proben org.-a, org.-b und org.- bei 275 nm messen und in der Tabelle festhalten. Proben in die Röhrchen zurück giessen. 4. Erst wenn alle organischen Proben gemessen sind, Küvette gut mit Wasser spülen, ausschütteln und Flüssigkeitsrest mit Papiertüchlein abtupfen. In der gleichen Weise mit dem Blindwert der wässrigen Phase w-bl das Photometer erneut auf Null einstellen und anschliessend die Probe ins Röhrchen zurück giessen. Extinktion der Proben w-a, w-b und w- bestimmen und in der Tabelle festhalten. Zwischen den Messungen Küvette nicht ausspülen, sondern erst nach Beendung der Messungen! Auswertung: Bei 275 nm ist der millimolare Extinktionskoeffizient der untersuchten Substanzen in der wässrigen und organischen Phase gleich gross. Somit lässt sich der Verteilungskoeffizient K org./wässrig, welcher das Verhältnis der Konzentration in der organische Phase zur Konzentration in der wässrigen Phase ist, direkt als E org. /E wässrig bestimmen. Die Werte der Verteilungskoeffizienten tabellarisch in die nachstehende Zusammenstellung eintragen. Formeln von bei ph 1 und 8 sowie von methylester aufzeichnen. Formeln: Glycin p-kresol ph 8 (B) ph 8 (A) ph 1 methylester ph 8 Tryptophan ph 8 () ystein K org./wässrig Ordnen Sie die K org./wässrig obiger Substanzen in aufsteigender Reihenfolge.

8 67 - Weshalb ist von den obigen Substanzen der Wert K org./wässrig von Glycin am kleinsten? Erklären Sie die Reihenfolge K org./wässrig von ph 8 < ph 1 < -methylester ph 8 < p-kresol ph 8? - Aminosäuren können in hydrophile und hydrophobe Aminosäuren eingeteilt werden. Wenn auf einer relativen Skala der Hydrophobizität Glycin der Wert 0 zugeordnet wird, wie sind dann bei neutralem ph-wert, ystein, Tryptophan sowie Valin, Leucin, Asparaginsäure und Lysin einzustufen (Werte negativ, 0 oder positiv)? EXPERIMENT 4.4: Löslichkeit von Serumalbumin Es wird die Löslichkeit von nativem und hitzedenaturiertem Serumalbumin untersucht. Proteine mit vielen geladenen Seitenketten sind meist gut wasserlöslich. Die Löslichkeit eines Proteins ist am geringsten, wenn seine Nettoladung Null ist. Dies ist der Fall, wenn das Molekül gleich viele positive wie negative Ladungen trägt. Der ph-wert der wässrigen Lösung, bei dem dies zutrifft, entspricht dem isoelektrischen Punkt (IEP) des Proteins. Manche Proteine fallen am IEP aus (= werden unlöslich). Bei ph-werten über und unter dem IEP bewirken negative bzw. positive Überschussladungen gegenseitige Abstossung der Proteinmoleküle und damit bessere Löslichkeit. Denaturierung verringert in der Regel die Löslichkeit der Proteine. Proteinfällungsreagenzien wie Perchlorsäure, Trichloressigsäure fällen Proteine und Peptide quantitative aus (einfacher Proteinnachweis; Deproteinisierung von Proben in Röhrchen E und F, aber nicht in G!). Lösungen: - Serumalbuminlösung (5 mg/ml) M NaOH; 1 % Essigsäure; 100 % Essigsäure; 0.33 M Perchlorsäure; 0.2 M Trichloressigsäure; 0.3 M Hl Sieben Glasröhrchen beschriften und folgende Lösungen zugeben (ml bzw. Tropfen mit Pasteurpipette):

9 68 A B D E F G Serumalbuminlösung (ml) M NaOH - 3 Tr % Essigsäure Tr % Essigsäure (ml) M Perchlorsäure (ml) M Trichloressigsäure (ml) M Hl (ml) ph (mit ph-indikatorpapier abschätzen): Ausfällung RG A bis D während 5 min ins siedende Wasserbad stellen. Ausfällung Die Löslichkeit von Serumalbumin wird unter den verschiedenen Bedingungen beobachtet (bei verschiedenen ph-werten nativ und hitzedenaturiert). Ausmass der Ausfällung abschätzen (0 bis +++) und in der Tabelle notieren. Erklären Sie die beobachteten Resultate! - Wie lässt sich nachweisen, ob und wieviel Serumalbumin in Röhrchen A-D nach der Hitzedenaturierung noch in Lösung ist? - Wie wird die Löslichkeit eines Proteins bei gegebenen Bedingungen bestimmt und angeben?