LC/LC-MS Determination of the Inhibitory Potency of Herbal Extracts on the Activity of Cytochrome P450 Enzymes. Matthias Unger, Würzburg

Transkript

1 LC/LC-MS Deteration of the Inhibitory Potency of Herbal Extracts on the Activity of Cytochrome P45 Enzymes Matthias Unger, Würzburg

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3 Hypericum-Extrakte erniedrigen die Plasmaspiegel von Cyclosporin, Digoxin, Phenytoin, Theophyllin, Indinavir, Saquinavir, Warfarin... Induktion von CYP3A4 und P-Glykoprotein Grapefruitsaft erhöht die Plasmaspiegel von Cyclosporin, Erythromycin, Simvastatin, Lovastatin, Terfenadin, ifedipin, Carbamazepin, Midazolam... Inhibition von CYP3A4 im Dünndarm

4 Wie erhöht Grapefruitsaft die Bioverfügbarkeit synthetischer Arzneimittel?? AS Darmlumen MB CYP3A4 PgP 3A4 PgP MB Grapefruitsaft Enterozyten

5 Entwurf von BfArM und Kommission E zur Bewertung von Arzneimittelinteraktionen bei pflanzlichen Arzneimitteln (24)...sind zur Zulassung zudest in vitro Untersuchungen vorzulegen. Falls sich hieraus ein Verdacht ergibt, sind klinische Studien notwendig. Pharmakokinetische Interaktionen sind in-vitro für CYP- 45-Enzyme relativ gut vorhersagbar Klinische Studien, nur wenn In-vitro-Ergebnisse auf Interaktionen hindeuten (Kosten!!)

6 Arzneistoffe als Substrate und Inhibitoren von Cytochrom P45-Enzymen Arzneistoff CYP Metabolit Inhibitor Theophyllin CYP1A2 1-Methylxanthin Coffein Diclofenac CYP2C9 4 -H-Diclofenac Sulfaphenazol Diazepam CYP2C19 ordazepam Tranylcypro Amitryptilin CYP2D6 ortryptilin Chinidin Diazepam CYP3A4 Temazepam Ketoconazol

7 Inhibition von Cytochrom P45-Enzymen durch Pflanzenextrakte: In-Vitro Vitro-Tests Substrate werden durch CYP-Enzyme in fluoreszierende Produkte überführt schnell, gut geeignet für High-Throughput Screening viele Pflanzeninhaltsstoffe fluoreszieren Keine Fluoreszenz CYP3A4 Fluoreszenz CH 2 H Benzyloxyresorufin Resorufin

8 Inhibition von Cytochrom P45-Enzymen durch Pflanzenextrakte: In-Vitro Vitro-Tests LC/MS oder LC/MS-MS-basierte Methoden (schnell), Bestimmung mit Substrat/CYP-Cocktail komplizierte(re) Methodenentwicklung H H CYP3A4 Testosteron H 6ß-Hydroxytestosteron

9 Entwicklung einer LC/LC-MS-Methode für die simultane Bestimmung der Inhibition von CYP1A2/2C8/9/19/2D6 und CYP3A4 durch Pflanzenextrakte 5 mg gemahlene Droge/1 ml LM 3 Ultraschall Extraktion/Zentrifugation Verdünnung 1:5/1:25 Inkubation der Pflanzenextrakte (3 Konzentrationen) mit Substraten, rekombinanten CYP-Enzymen und ADPH LC/LC-MS-Quantifizierung der gebildeten Metabolite im SIM-Modus und Kalkulation der inhibitorischen Aktivität

10 Substrate für LC/LC-MS Screening H 2 H 2 H H 3 C H CYP1A2 CYP2D6 H 3 C H H 2 C CYP2C19 Cl CYP3A4 H F Cl H 2 C CH 2 CH 2 H 2 C CH 2 CH 2 F H 3 C S H H CYP2C9 C H C 4 H 9 H 2 C S C C 4 H 9 H H H H H 3 C H C H 3 H CYP2C8 H 6 H

11 Methodenentwicklung Quantifizierung aller Produkt-Ionen im SIM-Modus ESI (positiv/negativ oder Polarity Switching )? Selektive Bestimmung der Metabolite ohne Interferenzen aus der Pflanzenmatrix (komplexe Vielstoff-Gemische) Probenvorbereitung (Ausschütteln, SPE, usw.)?? Ausreichende chromatographische Trennung??? Injektion einer großen Probenmenge ohne Verlust an Auflösung Empfindlichkeit

12 LC/LC-MS Automated Solvent Extraction (Column Switching) Extraction Analysis Pump 1 Pump 1 Waste Waste Injector Injector Valve Extraction Column Valve Extraction Column Analytical Column Pump 2 Analytical Column Pump 2 MS MS

13 Automatische Proben-Extraktion (Column Switching) U Große Proben-Anzahl U Injektionsvolumen (< 1.5 ml) U Ideal für komplexe Matrices z.b. Pflanzenextrakte, Urin, Zellkultur-Medien, Plasma U Auswaschen von (polaren) Substanzen der Probenmatrix U Saubere Chromatogramme U Saubere ESI-Quelle Î Reproduzierbarkeit!!

14 H H 2 H LC/LC-MS-Methode: Chromatographie basisch H H 2 C Automatische Festphasenextraktion Adsorption der Metabolite an RP18 Lipophilie/Selektivität H 2 C CH 2 CH 2 H Cl F Substrate µg/ml Pflanzenextrakt µg/ml H neutral H H 3 C H C H 3 H H Metabolite ng/ml Analytische Säule Selektivität/Trennung Schnelligkeit (Zeitfenster < 8 ) Empfindliche Detektion (ESI) H H 2 C S H C H C 4 H 9 sauer SIM Positive Ionisierung

15 LC/LC-MS-Methode: Chromatographie Pump 1 Injector Waste FM Extraction Column (RP18) Ammoniumacetat 1 mm/tfa.1 % Methanol (9/1); isokratisch Valve Extraction Column Analytical Column MS Pump 2 FM Analytische Säule (RP14-Amid) Ammoniumacatat 1 mm/fa.1 % Acetonitril (Gradient)

16 MSD1 215, EIC=214.7:215.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var MSD1 215, EIC=214.7:215.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var H-Tacrin MSD1 258, EIC=257.7:258.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var H-Tacrin MSD1 258, EIC=257.7:258.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var Dextrorphan MSD1 267, EIC=266.7:267.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var Dextrorphan MSD1 267, EIC=266.7:267.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var Desipra 1. 5 Desipra MSD1 287, EIC=286.7:287.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var MSD1 287, EIC=286.7:287.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var H-Tolbutamid MSD1 342, EIC=341.7:342.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var H-Tolbutamid MSD1 342, EIC=341.7:342.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var H-Midazolam MSD1 87, EIC=869.7:87.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var H-Midazolam MSD1 87, EIC=869.7:87.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var α-H-Taxol α-H-Taxol MSD1 69, EIC=68.7:69.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var MSD1 69, EIC=68.7:69.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: Var Reserpin Reserpin M. Unger, A. Frank. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 18:

17 Selektivität Enzym-Substrat-Cocktail: Inhibitoren Inhibitor CYP IC 5 cocktail IC 5 individual IC 5 literature Furafylline 1A2 1.4 ±.1 µm 2.7 ±.1 µm.5-6. µm Quercetin 2C8 6.2 ±.2 µm 3.9 ±.3 µm 7. µm Sulfaphenazole 2C9.42 ±.8 µm.43 ±.2 µm µm Tranylcyproe 2C ± 1.2 µm 8.6 ±.4 µm 8./8.9 µm Quinidine 2D6 3.7 ± 7.4 nm 25.3 ± 1. nm 2-15 nm Clotrimazole 3A4 3.8 ±.2 nm 2.6 ±.2 nm 6.7 nm IC 5 -Werte in Übereinstimmung mit publizierten Daten Abweichung: 45-6% (CYP1A2/2C8/2C19/3A4), 2% (CYP2D6), 2% (CYP2C9) Eignung der Methode für Pflanzenextrakte??

18 Selektivität Enzym-Substrat-Cocktail: Devil s Claw % activity of control CYP1A IC 5 individual 997 µg/ml IC 5 cocktail 2 94 µg/ml CYP2C IC 5 individual 254 µg/ml IC 5 cocktail µg/ml CYP2C IC 5 individual 121 µg/ml IC 5 cocktail µg/ml % activity of control CYP2C IC 5 individual µg/ml 6 4 IC 5 cocktail 2 22 µg/ml log concentration [µg/ml] CYP2D IC 5 individual µg/ml 6 4 IC 5 cocktail µg/ml log concentration [µg/ml] CYP3A IC 5 individual µg/ml 6 4 IC 5 cocktail µg/ml log concentration [µg/ml] Abweichungen IC 5 -Werte Cocktail/Individueller Assay: 1% (2D6) - 3% (2C19) Moderate Inhibition: 2C8/2C9/2C19; Schwache Inhibition: 3A4/1A2/2D6

19 1-Hydroxytacrin Feverfew Extract Feverfew Extract area ratio.4.2 R 2 =.999 area ratio.4.2 R 2 = concentration [ng/ml] concentration [ng/ml] 4-Hydroxytolbutamid Feverfew Extract Feverfew Extract area ratio.6.3 R 2 =.995 area ratio.6.3 R 2 = concentration [ng/ml] concentration [ng/ml]

20 Dextrorphan Feverfew Extract Feverfew Extract area ratio.4.2 R 2 =.999 area ratio.4.2 R 2 = concentration [ng/ml] concentration [ng/ml] 1 -Hydroxymidazolam Feverfew Extract Feverfew Extract area ratio R 2 =.999 area ratio R 2 = concentration [ng/ml] concentration [ng/ml]

21 Kava Kava (ature's Way) Kava Kava (Caelo) % activity of control µg/ml 1 µg/ml 2 µg/ml % activity of control µg/ml 1 µg/ml 2 µg/ml 1A2 2D6 2C19 2C9 3A4 2C8 1A2 2D6 2C19 2C9 3A4 2C8 Pfeffer (schwarz) Grapefruitöl % activity of control µg/ml 1µg/ml 2µg/ml % activity of control µg/ml 1µg/ml 2µg/ml 1A2 2D6 2C19 2C9 3A4 2C8 1A2 2D6 2C19 2C9 3A4 2C8

22 Zusammenfassung LC/LC-MS-basierte In-vitro-Methode für die Identifizierung von Phytopharmaka und aturstoffen als Inhibitoren von Cytochrom P45-Enzymen Ausreichende Selektivität des Enzym/Substrat-Cocktails gegenüber individuellen Assays Kosten/Zeitersparnis Viele Pflanzenextrakte inhibieren: CYP1A2/2C8/2C9/2C19/2D6 und -3A4 (IC 5 < 5 µg/ml)

23 Ausblick Isolierung und Identifizierung der für die Inhibition verantwortlichen Inhaltsstoffe (Bioassay-Guided-Fractionation) In-vivo-Studien (in-vitro-in-vivo-korrelation) Auffinden von selektiven Inhibitoren und Leitstrukturen Experimentelle Forschung/Molecular Modeling Entwicklung neuer/selektiver Wirkstoffe

24 Acknowledgement Andreas Frank Deutsche Forschungsgemeinschaft