Was Pathologen über die klassischen Färbungen wissen müssen

Transkript

1 Was Pathologen über die klassischen Färbungen wissen müssen Ralf Lieberz Dr. Senckenbergisches Institut f. Pathologie Universitätsklinikum Frankfurt a.m.

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4 Färbeergebnisse werden beeinflusst durch: Fixation Entwässerung- und Paraffininfiltration Schnittqualität Reagenzienansatz/Reagenzienqualität Standardisierte Prozessabläufe bei der Färbung

5 Wichtig: standardisierte Fixation 4-5 % Formaldehydlösung gepuffert (phneutral)

6 Einteilung der klassischen Färbungen Histochemische Färbungen Physikalischen Färbemethoden Enzymhistochemische Färbemethoden Versilberungstechniken

7 Bespiele zu klassischen Färbungen Übersichtsfärbungen PAS Bindegewebsfärbungen Versilberungstechniken

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9 Übersichtsfärbung 1 (HE)

10 Färbetheorie HE Der Kernfarbstoff (Haematoxylin) wird durch Extraktionsprozesse aus dem Blauholz gewonnen (verwendet bei Hämalaun nach Mayer). Durch Oxidation (Natriumiodat) werden die negativen Ladungen des Extraktes (Hämatein) verstärkt.

11 Färbetheorie HE Durch Bindung an Alaune oder Metalle wird eine Umladung vorgenommen. Die nunmehr positiven Ladungen des Hämalauns lagern sich an die negativ geladenen Nukleinsäuren des Zellkerns an. Die Kernfärbung kommt am besten in saurem Milieu zu stande.

12 Färbetheorie HE Um tatsächlich eine blaue Farbe zu erzielen muss der ph-wert bei über 3 eingestellt werden. Dies geschieht mittels Leitungswasser (Bläuen!!) Durch das Bläuen wird die Farbe stabilisiert. Alternative zu Leitungswasser : 0,1% NaHCO3 Zytoplasmafärbung mittels Eosin (0,5-2%; Verstärkung durch Zugabe von Eisessig)

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14 Übersichtsfärbung 2: Giemsa

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17 Giemsa Farbstoffgemisch: Methylenbau, Methylenazur, Methylenviolett, Eosin, Glycerin Giemsa ist eine regressive Färbung Giemsa ist ph-sensibel Entscheidend: die Differenzierung

18 Giemsa Giemsa-Lsg. 10% bei RT (ph-wert: 6,8-7,2) A.dest Differenzierung mit Essigsäure und 96% Ethanol Dehydrieren

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24 Alternativ zu Giemsa bei HP- Nachweis:Warthin Starry

25 Versilberung nach Warthin Starry Entwickelt: 1920 von Aldred Scott Warthin und Allen Chronister Starry Versilberungstechnik: Vergleichbar mit Methoden der Fotografie

26 Entwicklerlösung Silbernitrat Fotokristall: Hydrocinone Gelantinelösung Wichtig: ph-wert 2,5

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28 Beispiel Histochemie: die PAS-Färbung

29 PAS-Reaktion Die PAS-Reaktion beruht auf der roten Darstellung von zwei dicht gelagerten Aldehydgruppen mit Hilfe der fuchsinschwefligen Säure. Die Spezifität der Reaktion ist in der gezielten Hydrolyse von Kohlenhydraten mit Hilfe der Perjodsäure = HJPO4 begründet.

30 Die PAS-Reaktion Durch die Perjodsäure werden 1,2- Glykolgruppen in Aldehydgruppen umgewandelt. Sind die Glykolgruppen blockiert fällt die Reaktion negativ aus. (z.b. saure Mucopolysaccharide) Der Vorteil der Perjodsäure liegt darin, dass die Reaktion mit der Bildung der Aldehyde endet.

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33 Die PAS-Reaktion Die gebildeten Aldehydgruppen ergeben mit dem Schiff schen Reagenz einen rot gefärbten Additionskomplex. Die genaue Aufschlüsselung des Kohlenhydrates wird erst durch spezifische Massnahmen, wie die Behandlung mit glykolytischen Enzymen möglich. (z.b. Diastasebehandlung zur Glykogenentfernung)

34 Die PAS-Reaktion Die Perjodsäure ist ein stark wirksames Oxidationsmittel, welches durch umfangreiches Spülen aus dem Schnitt entfernt werden sollte. (Background!) Wird mit Natriumthiosulfat gespült kann die Zahl der Aldehydgruppen, die mit dem Schiff schen Reagenz eine Farbkomplex eingehen eingeschränkt werden und die Intensität der Färbung wird beeinträchtigt.

35 Die PAS-Reaktion Das Schiffsche Reagenz entsteht durch Lösung von Parafuchsin in Schwefelsäure. Im Anschluss an die Reaktion sollte überschüssige fuchsinschweflige Säure aus dem Präparat durch Spülen in Leitungswasser, oder besser in SO2haltigen Wasser entfernt werden. Erfolgt dies nicht oxidiert überschüssiges Reagenz unter SO2- Verlust, d.h. es bildet sich wieder das rote Parafuchsin (Background!)

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37 Pit-Falls-PAS Perjodsäure verbraucht. Gealtertes Schiff sches-reagenz = keine Farbbindung, weil das Fuchsin die schweflige Säure verloren hat. Dies sieht man an einer Rotfärbung des Reagenzes. (freies Fuchsin) Das Schiff sche-reagenz im Kühlschrank aufbewahren!

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40 Beispiel physikalische Färbemethoden: klassische Bindegewebsfärbungen

41 Bindegewebsfärbungen Van Gieson Färbung (Säurefuchsin) Domagk (Thianzinrot) Masson Goldner Trichrom Azanfärbung nach Heidenhain Ladewig Färbung

42 Bindegewebsfärbungen Färbemechanismus: elektrostatische Farbstoffbindung und Dispersität und damit verbundene Fähigkeit des Farbstoffes zur Diffusion. Ferner ist die Gewebetextur für das Eindringen und Auswaschen der Farbstoffe während des Färbens und Differenzierens von erheblicher Bedeutung. Alle Farbstoffe sind negativ geladen.

43 Stichwort Dispersität Fein dispers Grob dispers

44 Bindegewebsfärbungen Wichtig: die Differenzierungsschritte! 1. Färbeschritt färbt Erythrozyten und Bindegewebe; während des folgenden Differenzierens wird der Farbstoff schneller aus dem Bindegewebe gewaschen, das so für die Besetzung mit weiteren anionischen Farbstoffen frei wird. Die Erythrozyten bleiben noch mit dem ersten Farbstoff angefärbt. Der wichtigste Differenzierungsschritt ist vor dem Anfärben der Bindegewebsfasern, also vor der letzten Farblösung der Serie.

45 Problem Kernfärbungen Kernfärbungen stehen immer am Anfang der Bindegewebsfärbung. Bei van Gieson und Masson Goldner werden die relevanten Farbstoffe im sauren ph angeboten. Hämalaune sind wegen ihrer Säurelöslichkeit daher ungeeignet. Deshalb verwendet man hier stabile Eisenhämatoxyline (Weigert).

46 Beispiel van Gieson Van Gieson-Gemisch: simultane Färbung mit Säurefuchsin und Pikrinsäure. Progressive Färbung: die feindisperse hochkonzentrierte Pikrinsäure dringt in alle Strukturen und färbt sie gelb. Das grobdisperse, schwach konzentrierte Säurefuchsin kann in der Zeit nur in die sehr weiten Strukturlücken des kollagenen Bindegewebes eindringen, wo es die Pikrinsäure überlagert. Pitfall: die Färbung wird jetzt nicht unterbrochen.

47 Färberelevante Schritte Eisenhämatoxylin nach Weigert Differenzieren in 0,5% HCL-Ethanol Bläuen in Leitungswasser Van-Gieson-Gemisch Kurz Abspülen in 96% Ethanol Dehydrieren

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49 Im Unterschied hierzu: Masson Goldner Hierbei werden die Farbstoffe nicht simultan eingesetzt. Ein Differenzierungsschritt wird gespart, weil die nächstfolgende Farbstofflösung das Differenzierungsmittel (Phosphorwolframsäure) zugesetzt enthält.

50 Färbeprotokoll Masson-Goldner Kernfärbung Ponceau-Säurefuchsin Abspülen Essigsäure Phosphorwolframsäure/Orange G Abspülen Essigsäure Lichtgrün/Methylenblau Abspülen Essigsäure

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52 Die Versilberungstechniken/ Silberimprägnation

53 Alle Methoden folgen einem Schema Vorbehandlung mit einem Oxidationsmittel Sensibilisierung des Gewebes mit Metallsalzen Imprägnation mit ammoniakalischer Silberlösung (Silberionen schlagen sich an den Metallsalzen nieder). Entwickeln des Niederschlags mit Reduktionsmitteln. Etvl. Tonen mit Goldchlorid (Stabilität; Fasern kommen noch kontrastreicher zur Darstellung) Fixierung mit Natriumthiosulfat (verhindert Nachschwärzung durch Licht). Gegenfärbung z.b. mit Kernechtrot.

54 Was ist zu beachten? Sauberkeit ist wichtig! Auch an Schmutzpartikel kann sich Silber anlagern. Keine Metallinstrumente verwenden. Titration der ammoniakalischen Silbernitratlösung. Stammlösung dunkel und im Kühlschrank aufbewahren.

55 Färbeprinzip Aus Metallsalzlösungen lagern sich Metallionen auf dem entsprechend vorbehandeltem Gewebe ab. Anschließend werden diese Ag+-Ionen zu metallischem Silber reduziert und schwärzen dadurch die nachzuweisenden Gewebestrukturen.

56 Färbung Prinzip der Versilberung Oxidationsmittel Grocott zweizeitig Chromsäure Gomori zweizeitig Kaliumpermang. Jones zweizeitig Perjodsäure Kossa Warthin-Starry einzeitige Versilberung!! zweizeitig Lichteinfall!!!

57 Silberimprägnation nach Gomori Modifikation der Originalmethode von Bielschowsky (1937).

58 Gomori-Versilberung Oxidation in Kaliumpermanganat 0,5% Spülen Leitungswasser Oxalsäure 2% Spülen Leitungswasser Eisenalaun 2% Leitungswasser danach a.dest Ammoniakalische Silbernitratlösung Spülen in a.dest Reduzieren in Formalin Spülen Leitungswasser Tonen in 0,1% Goldchlorid A.dest Fixieren in 1% Natriumthiosulfat

59 Ammoniakalische Silberlösung Silbernitrat + a.dest Natronlauge zusetzen Es bildet sich ein braunschwarzer Niederschlag von Silberoxid. Tropfenweise konzentriert Ammoniak zusetzten, bis sich der Niederschlag bis auf wenige Körnchen gelöst hat. Ein Überschuss an Ammoniak ist zu vermeiden.

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65 Grocott Methenamin Silber-Färbung Darstellung von Basalmembranen, Pilzen und Pneumocysten

66 MS nach Grocott Oxidation in Chromsäure Spülen in a.dest Methenaminsilberlösung bei 60 C (Borax+Silbernitrat+a.dest) Spülen in a.dest Natriumthiosulfat Spülen in a.dest Gegenfärbung Malachitgrün oder Kernechtrot Ethanol 96% Dehydrieren Xylol

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