Anti-TPO ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Schildrüsenperoxidase (TPO)
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1 ORGENTEC Diagnostika GmbH Carl-Zeiss-Straße Mainz Tel.: Fax: Anti-TPO ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Schildrüsenperoxidase (TPO) Gebrauchsanweisung
2 INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis... 2 Einleitung... 3 Methodik... 4 Lieferumfang des Tests... 5 Technische Daten... 5 Erforderliche Laborgeräte... 5 Vorbereitung der Reagenzien... 6 Probenentnahme und Probenvorbereitung... 6 Technische Hinweise... 6 Assaydurchführung... 7 Auswertung der Ergebnisse... 8 Normalwerte... 8 Spezifität... 8 Sensitivität... 8 Kalibrierung... 8 Linearität... 8 Reproduzierbarkeit... 9 Literatur... 9 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Kurzanleitung
3 EINLEITUNG Einige Schilddrüsenerkrankungen sind wahrscheinlich aufgrund genetischer Prädisposition für eine autoimmune Beteiligung mit dem Auftreten von differenzierten Autoantikörpern assoziiert. Diese Autoantikörper richten sich gegen membranständige oder extrazelluläre Antigene der Schilddrüsenzelle. Die wichtigsten Autoantigene sind neben dem TSH-Rezeptor das Thyreoglobulin und die Schilddrüsenperoxidase TPO: - Thyreoglobulin ist ein wasserlösliches Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa Dalton. Mit 75 % Anteil stellt es die Hauptproteinkomponente im Schilddrüsenkolloid. Die Tyrosinreste des Thyreoglobulin-Moleküles werden zur oxidativen Jodierung bereitgestellt und bilden somit die Voraussetzung für die Synthese der Schilddrüsenhormone T3 und T4. Innerhalb der Zelle wird Thyreoglobulin durch die Mikrosomen transportiert. - Das mikrosomale Antigen der Schilddrüse ist ein integrales Membranprotein der Mikrosomen und als das Enzym Schilddrüsen-Peroxidase (TPO) charakterisiert. Sein Molekulargewicht beträgt ca Dalton. Autoantikörper werden sowohl bei entzündlichen Erkrankungen als auch bei thyreoidalen Autoimmunprozessen beobachtet. Verschiedene Leitsymptome für Schilddrüsenerkrankungen, wie z. B. Struma, Schilddrüsenschmerz, Hyperthyreose sowie Hypothyreose, können von immunogenen Prozessen, also der Beteiligung von Autoantikörpern, begleitet sein. Dies unterstreicht die Relevanz der Autoantikörperbestimmung bei der Diagnostik von Schilddrüsenerkrankungen. Wichtigste Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse sind: - Hashimoto Thyreoiditis - Primäres Myxödem - Morbus Basedow Hyperthyreose (häufig begleitet von endokriner Ophtalmopathie) - und andere asymptomatische, beispielsweise postpartale, Thyreoiditen. Das oftmals gleichzeitige Auftreten von Autoantikörpern gegen Thyreoglobulin und TPO scheint auf dem funktionellen Zusammenhang beider Antigene zu beruhen. Bei der oxidativen Jodierung der Aminosäurereste des Tyrosins am Thyreoglobulin als Ausgangsstruktur zur Bildung der Schilddrüsenhormone T3 und T4 ist die Schilddrüsen-Peroxidase wahrscheinlich aktiv beteiligt. TSH reguliert durch Stimulation die Synthese und Freisetzung der Schilddrüsenhormone unter räumlichem Zusammenwirken aller dieser Proteine in oder auf der Zellmembran. Daher ist auch das oftmals gleichzeitige Auftreten aller beschriebenen Antikörper plausibel. Die fortdauernde Inhibierung der Peroxidase-Aktivität durch spezifische Autoantikörper (anti-tpo) führt zu einer verminderten Synthese der Schilddrüsenhormone und damit zur Hypothyreose. Besonders am Ende einer Schwangerschaft kann der Nachweis von Schilddrüsen-Autoantikörpern wertvolle Hinweise auf eine spätere postpartale Hypothyreose geben (Hashimoto's post partum depression). Bei der Hashimoto Thyreoiditis findet man häufig sehr stark erhöhte Autoantikörper- Konzentrationen, wobei die gegen Thyreoglobulin gerichteten Autoantikörper meist stärker erhöht sind als die anti-tpo Antikörper. Die Verteilung der dargestellten Autoantikörper bei Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen ist in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. A n t i - Krankheisbild (vereinfacht) TM(TPO) TG TSH- Rezeptor Hashimoto Thyreoiditis xxx xxx x Morbus Basedow (immunogen) xx x xxx Endokrine Orbitopathie xx x xx Dissiminierte Autonomie (nicht immunogen) x (x) - Regionale Autonomie (autonomes Adenom) x (x) - 3
4 Im Wesentlichen ergeben sich für die Bestimmung der Autoantikörper gegen Antigene der Schilddrüse folgende Indikationen: - Morbus Basedow (immunogen) - Hashimoto Thyreoiditis - Endokrine Orbitopathie - Hyper- bzw. Hypothyreose ungeklärter Genese - Schilddrüsenautomien - Postpartale Thyreoiditen METHODIK er vorliegende Test ist ein indirekter Enzymimmunoassays zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen die Schilddrüsenperoxidase TPO. Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit humaner Schilddrüsenperoxidase (TPO) beschichtet. Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmungen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei Bedarf können die Streifen in einzelne Kavitäten zerteilt werden. Die drei Reaktionsschritte stellen sich wie folgt dar: 1. Reaktionsschritt Die Antikörper in den Standards, Kontrollen und in den Patientenproben werden an das immobilisierte Antigen in den Kavitäten gebunden. 2. Reaktionsschritt Das zugegebene Enzymkonjugat (anti-human-igg Meerrettich-Peroxidase) erkennt spezifisch die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe. 3. Reaktionsschritt Die gebundene Peroxidase setzt ein zugegebenes Substrat (TMB) in ein gefärbtes Produkt um. Auswertung Die optische Dichte der Proben wird in einem ELISA-Photometer bei 450 nm gemessen. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration. 4
5 LIEFERUMFANG DES TESTS Mikrotiterplatte mit 96 abbrechbaren Kavitäten, die beschichtet sind... 1 mit hochgereinigter humaner Schilddrüsenperoxidase TPO Probenpuffer, Konzentrat, (gelb)... 1 Fläschchen, 20 ml Waschpuffer, Konzentrat... 1 Fläschchen, 20 ml Konjugat... 1 Fläschchen, 15 ml anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, gebrauchsfertig (rosa), TMB Substratlösung, 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig... 1 Fläschchen, 15 ml Stopplösung, 1M HCl, gebrauchsfertig... 1 Fläschchen, 15 ml Kontrollen, gebrauchsfertig... je 1 Fläschchen, 1,5 ml - Kontrolle 1 Positivkontrolle - Kontrolle 2 Negativkontrolle Standards A bis F, gebrauchsfertig mit den Konzentrationen:...je 1 Fläschchen, 1,5 ml Anti-TPO: IU/ml Arbeitsanleitung/Qualitätskontroll-Zertifikat TECHNISCHE DATEN Untersuchungsmaterial Serum oder Plasma Erforderliche Probenmenge 10 µl Probe für eine 1 : 101 Probenvorverdünnung 100 µl verdünnte Probe pro Einzelbestimmung Gesamt-Inkubationszeit 60 Min. bei Raumtemperatur (20-28 C) Meßbereich: IU/ml Meßwellenlänge 450 nm Empfindlichkeit: 5 IU/ml Lagerung bei 2-8 C im Kühlschrank ERFORDERLICHE LABORGERÄTE Geräte/Reagenzienvorbereitung - Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm (ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm) - Wirbelmischer (Vortex) - Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl und 1000 µl, evtl. Multipette - destilliertes Wasser - Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml - Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung 5
6 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Alle Komponenten dieses Testbesteckes liegen bis auf den Probenpuffer und den Waschpuffer gebrauchsfertig vor. Die Lösungen sind nach dem Öffnen der Fläschchen und bei Lagerung im Kühlschrank bei 2-8 C bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Waschlösung Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Probenpuffer Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Mikrotiterplatte Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen oder Einzelkavitäten in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperatur angenommen hat, ehe die Folienverpackung geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen bzw. Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren Beutel bei 2-8 C aufbewahrt. Achtung: Werden bei einem Assayansatz nicht alle Streifen bzw. Kavitäten benötigt, muß der Rahmen der Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten Kavitäten verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden. PROBENENTNAHME UND PROBENVORBEREITUNG Die Bestimmung der TPO-Antikörper wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw. Plasmaproben werden vor der Messung 1 : 101 mit Probenpuffer verdünnt. 10 µl Probe plus 1000 µl Probenpuffer Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2-8 C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 C tiefgefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Seren und Plasmen mit erhöhten Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht. TECHNISCHE HINWEISE Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu überprüfen. 6
7 ASSAYDURCHFÜHRUNG Vor Testbeginn müssen alle Reagenzien sowie die Patientenseren Raumtemperatur angenommen haben. 1. Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mikrotiterplatten-Module zum Ansatz von Standards, Kontrollen und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden empfohlen. 2. Jeweils 100 µl Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren. Vorschlag für ein Pipettierschema: A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 C SB SF P2 P.. SA - SF: Standards A bis F D SB SF P2 P.. P1, P2... Pantientenprobe 1, 2... E SC K1 P3 K1: Positivkontrolle F SC K1 P3 K2: Negativkontrolle G SD K2 P4 H SD K2 P4 1. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 3. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 5. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 Mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 6. Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren. 3. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen. 8. Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten bei einer Wellenlänge von 450 nm. Bitte beachten Sie: Alle angegebenen Inkubationszeiten müssen eingehalten werden. Alle Pipettierschritte sind bei allen Inkubationen in einheitlicher Reihenfolge und einheitlichem Zeittakt durchzuführen. 7
8 AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die vorgegebene Standardkonzentration. NORMALWERTE Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichsstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit dem Anti-TPO ELISA die folgenden Werte ermittelt: normal < 50 IU/ml grenzwertig IU/ml erhöht > 75 IU/ml SENSITIVITÄT Die untere Nachweisgrenze beträgt 5 IU/ml. SPEZIFITÄT Die Mikrotiterplatte ist mit hochgereinigter Schilddrüsenperoxidase (thyreoidale Peroxidase, TPO), isoliert aus humanem Schilddrüsengewebe, beschichtet. Der Anti-TPO Kit erfaßt spezifisch die gegen das humane TPO-Molekül gerichteten Autoantikörper der IgG Klasse. KALIBRIERUNG Das quantitative Meßsystem Anti-TPO ist gegen die Referenzpräparation MRC 66/387 für Schilddrüsenperoxidase Antikörper kalibriert. Der MRC-Standard wird mit 1000 IU/ml gemessen. LINEARITÄT Für die Verdünnungsexperimente wurden Seren/Plasmen mit hohen Antikörperkonzentrationen in steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Die Ergebnisse sind über den gesamten Meßbereich linear. 8
9 REPRODUZIERBARKEIT In der untenstehenden Tabelle sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die Inter-Assay-Varianzen des Anti-TPO Kits ermittelt wurden, aufgeführt. Zur Ermittlung der Intra- Assay-Varianzen wurden drei Seren mit unterschiedlichen Konzentrationen jeweils 24-fach auf einer Platte gemessen. Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianzen wurden drei Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen auf fünf Platten jeweils sechsfach gemessen. Probe Nr. Intra-Assay Mittelwert (IU/ml) Variationskoeffizient (%) Probe Nr. Inter-Assay Mittelwert (IU/ml) Variationskoeffizient (%) , , , , , ,5 LITERATUR 1. Becker, W., Reiners, C., Börner, W. Immunologische Kriterien zur Differentialdiagnose von Schilddrüsenerkrankungen. Therapiewoche 1985; 35: Czarnocka, B., Ruf, J., Ferrand, M. et al. Purification of the human thyroid peroxidase and its identification as the microsomal antigen involved in autoimmune thyroid diseases. FEBS Lett. 1985; 190: Czarnocka, B., Ruf, J., Ferrand, M. et al. Interaction of highly purified thyroid peroxidase with anti-microsomal antibodies in autoimmune thyroid diseases. J. Endocrinol. Invest. 1986; 9: Ruf, J., Czarnocka, B., Ferrand, M. et al. Thyroid peroxidase is the organ-specific 'microsomal' antigen involved in thyroid autoimmunity. Acta Endocrinol (Copenh) 1987; Suppl. 281: Ruf, J., Czarnocka, B., Ferrand, M. et al. Relationship between immunological structure and biochemical properties of human thyroid peroxidase. Endocrinology 1988; Vol. 125 (3): Horster, F. A. Die Bedeutung von MAK, TAK, TRAK und Thyreoglobulin bei der Diagnose von Schilddrüsenkrankheiten. Internist 1988; 29: Schatz, H., Löbig, H. Diagnostische und prognostische Bedeutung von Antikörpern gegen Schilddrüsenmikrosomen und Thyreoglobulin. Akt. Endokr. Stoffw. 1989; 10: Hashimoto, H. Zur Kenntnis der lymphomatösen Veränderung der Schilddrüse (Struma lymphomatosa). Arch. Klin. Chir. 1912; 97:
10 9. Libert, F., Ruel, J., Ludgate, M. et al. Thyroperoxidase, an auto-antigen with a mosaic structure made of nuclear and mitochodrial gene modules. EMBO J. 1987; 6: McKenzie, J. M., Zakarija, M., Sato, A. Humoral immunity in Graves' disease. Clin. Endocrinol. Metab. 1978; 7: Scherbaum, W. A., Berg, P. A. Bedeutung von Autoantikörpern in der Diagnostik endokrinologischer Erkrankungen. Dtsch. Med. Wschr. 1981; 106: Scherbaum, W. A., Berg, P. A. Autoimmune Schilddrüsenerkrankungen - Neuere Aspekte zur Pathogenese und Diagnostik. Dtsch. Med. Wschr. 1984; 109: HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-diagnostik verwendet werden. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des Tests ist unbedingt erforderlich. Die Richtlinien zur Durchführung der Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien sind zu beachten (Mitführen von Kontrollen, Poolseren). Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen Verfallsdaten sind zu beachten. Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1, HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter wurden für negativ befunden. Für den Umgang mit Kitreagenzien, Kontroll- und Serumproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung für den Gesundheitsdienst beim Umgang mit potentiell infektiösem Material einzuhalten. Das Untersuchungsmaterial ist stets als potentiell infektiös einzustufen. Unter den gleichen Sicherheitsvorkehrungen sind ebenso Kitreagenzien und Kontrollproben zu handhaben. Die Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum Konservierungsmittel; daher ist die Berührung mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden. Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen. Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich und kräftig mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich reinigen. 10
11 KURZANLEITUNG 11
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