RESOLUTION OENO 26/2004

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1 MANNOPROTEINE AUS HEFEN DIE GENERALVERSAMMLUNG, unter Bezugnahme auf Artikel 2, Paragraf 2 IV des Gründungsübereinkommens vom 3. April 2001 der Internationalen Organisation für Rebe und Wein auf Vorschlag der Unterkommission für Analyse- und Bewertungsmethoden für Wein BESCHLIEEST, folgende Methode in das Sammelwerk der internationalen Analysemethoden für Wein und Most aufzunehmen: MANNOPROTEINE AUS HEFEN 1. GEGENSTAND, HERKUNFT UND GELTUNGSBEREICH Mannoproteine werden durch physikalisch-chemische oder enzymatische Verfahren aus den Zellwänden von Saccharomyces cerevisiae Hefen gewonnen. Mannoproteine weisen je nach Molekulargewicht, Glycosylierungsart und grad sowie entsprechend ihrer Ladung eine unterschiedliche Struktur auf. Je nach Extraktionsweise besitzen sie eine unterschiedliche Aktivität zur Stabilisierung von Weinsäure und Eiweiß im Wein. 2. ETIKETTIERUNG Auf dem Etikett müssen Anwendungsbereich (Stabilisierung von Weinsäure und/oder Eiweiß des Weins), Sicherheits- und Lagerungsvorschriften sowie das Haltbarkeitsdatum aufgeführt sein. Bei einer Anwendung in gelöster Form müssen auch die Konzentration an Mannoproteinen sowie der Schwefeldioxidgehalt angegeben werden. 3. KENNZEICHNUNG 3.1 Mannoproteine liegen entweder als weißes oder beiges, geruchloses Mikrogranulat in Pulverform vor oder als gelbliche, durchsichtige Kolloidlösung. 3.2 Mannoproteine sind in Wasser löslich, jedoch nicht in Äthanol. In einer Lösung setzen sie sich ab, wenn man 1 Volumen Äthanol hinzufügt Optische Drehung Die optische Drehung wird bei 589 nm (Natrium-D-Linie) gemessen und bezieht sich auf eine Mannoproteinlösung mit 10 g/l bei einer Länge von 1 dm. 1

2 Bestimmte Mannoproteine mit einem Drehvermögen [α] D 20 C zwischen 80 und 150 unterscheiden sich von Gummi Arabicum, dessen Drehvermögen unter 50 liegt. Andere Zubereitungen lassen sich nur durch den prozentualen Anteil der Zuckerarten unterscheiden (siehe Punkt 4.12). 4. TESTS 4.1 Schwund beim Trocknen Mannoproteine in Pulverform 5 g Mannoproteine in eine Siliziumkapsel mit 70 mm Durchmesser geben und während 5 Stunden bei C in den Heizschrank legen. Der Gewichtsverlust darf nicht über 15 % liegen Mannoproteine in gelöster Form 10 g Mannoproteinlösung in eine Siliziumkapsel mit 70 mm Durchmesser geben und während 4 Stunden in einem Wasserbad auf 100 C erhitzen und anschließend während 3 Stunden bei C in den Heizschrank legen. Die Menge des Trockenrückstands muss mindestens 10 % betragen. Die nachstehend festgelegten Grenzwerte beziehen sich auf das Trockenprodukt. 4.2 Asche Trockenrückstand bei C veraschen. Der Gehalt an Asche darf nicht über 8 % liegen. 4.3 Vorbereiten der Testlösung In Wasser eine Mannoproteinlösung mit 10 g/l vorbereiten. Bei einer Mannoproteinlösung ein Volumen abmessen, das 5 g Trockenrückstand entspricht, anschließend fast zur Trockne verdampfen und wieder auf 10 g/l in Wasser auflösen. 4.4 Schwermetalle In der für den Test (4.3) vorbereiteten Lösung gemäß der in Kapitel II des internationalen Weinkodex beschriebenen Methode den Eisengehalt bestimmen. Der in Blei ausgedrückte Gehalt muss unter 30 mg/kg liegen. 4.5 Blei In der für den Test (4.3) vorbereiteten Lösung gemäß der in Kapitel II des internationalen Weinkodex beschriebenen Methode den Bleigehalt bestimmen. Der Bleigehalt muss unter 5 mg/kg liegen. 2

3 4.6 Quecksilber In der für den Test (4.3) vorbereiteten Lösung, jedoch ohne die Lösung zu verdampfen, gemäß der in Kapitel II des internationalen Weinkodex beschriebenen Methode den Quecksilbergehalt bestimmen. Der Quecksilbergehalt muss unter 0,15 mg/kg liegen. 4.7 Arsen In der für den Test (4.3) vorbereiteten Lösung gemäß der in Kapitel II des internationalen Weinkodex beschriebenen Methode den Arsengehalt bestimmen. Der Arsengehalt muss unter 1 mg/kg liegen. 4.8 Cadmium In der für den Test (4.3) vorbereiteten Lösung gemäß der in Kapitel II des internationalen Weinkodex beschriebenen Methode den Cadmiumgehalt bestimmen. Der Cadmiumgehalt muss unter 0,5 mg/kg liegen. 4.9 Gesamtstickstoff 5 g Mannoproteine mit 15 ml konzentrierter Schwefelsäure (R) und 2 g Aufschlusskatalysator (R) in einen 300 ml Aufschlusskolben geben. Die Bestimmung wie in Kapitel II des internationalen Weinkodex angegeben fortsetzen. Bei einer Mannoproteinlösung eine Menge abwiegen, die 5 g Trockenrückstand entspricht, fast zur Trockne verdampfen und wie vorausgehend fortfahren. Der Stickstoffgehalt muss zwischen 5 und 75 g/kg liegen Mikrobiologische Analyse Gesamte aerobe mesophile Flora Es müssen unter mesophile aerobe Keime in 1 g vorhanden sein Coliforme Keime Es müssen weniger als 10 KBE/g Zubereitung vorhanden sein Staphylococcus aureus Garantierte Abwesenheit von Staphylococcus aureus an einer Probe von 1 g Salmonellen Garantierte Abwesenheit von Salmonellen an einer Probe von 25 g. 3

4 Escherichia coli Garantierte Abwesenheit von Escherichia coli an einer Probe von 25 g Milchsäurebakterien Es müssen weniger als 10 4 KBE/g Zubereitung vorhanden sein Schimmel Es müssen weniger als 50 KBE/g Zubereitung vorhanden sein Hefen Es müssen weniger als 10 2 KBE/g Zubereitung vorhanden sein Polysaccharide Prinzip: Messung der Farbintensität mit heißer Phenollösung in schwefelsaurem Milieu Substanzen: Mannoproteinlösung (15 mg/l) 150 mg Mannoproteine in 100 ml destilliertem Wasser auflösen und diese Lösung 1/100 mit destilliertem Wasser verdünnen Phenollösung (50 g/l) 5 g reines Phenol in 100 ml destilliertem Wasser auflösen Protokoll: Zu 200 µl zu dosierender Lösung ( ) fügt man 200 µl Phenol ( ) und anschließend 1 ml reine Schwefelsäure (R) hinzu. Nach sofortigem Schütteln werden die Röhrchen während 5 Minuten im Wasserbad auf 100 C erhitzt und anschließend auf 0 C abgekühlt. Nach Wiedererreichen der Raumtemperatur wird die Absorption bei 490 nm gemessen. Bei der Referenzlösung handelt es sich um eine Mannoselösung mit 100 mg/l. (Gehalt an Polysacchariden ausgedrückt in Mannose-Äquivalenten größer als 600 g/kg) 4

5 4.12 Prozentuale Zusammensetzung an monomeren Zuckern Prinzip: Enzymatische Bestimmung von Glukose und Mannose nach saurer Hydrolyse. Die Mannosedosierung wird unter Zugabe von Phosphomannoseisomerase (PMI) nach der Bestimmung von Fructose durchgeführt Substanzen: Mannoproteinlösung (5 g/l) 500 mg Mannoproteine in 100 ml destilliertem Wasser auflösen M Schwefelsäurelösung 28 ml reine Schwefelsäure in 100 ml destilliertes Wasser geben M Kaliumhydroxidlösung 46 g Kaliumhydroxid in 100 ml destilliertem Wasser auflösen Phosphomannoseisomerase 616 E/ml Durchführung: 100 µl zu dosierende Lösung ( ) in hermetisch schließende Röhrchen geben und 1 ml Schwefelsäure ( ) hinzufügen. Nach Schütteln werden die Röhrchen während 30 Minuten in einem Wasserbad auf 100 C erhitzt und dann auf 0 C abgekühlt. Bei Wiedererreichen der Raumtemperatur wird 1 ml Kaliumhydroxid hinzugefügt, um das Medium zu neutralisieren. Die Bestimmung von Glukose und Mannose kann nun gemäß der im Sammelwerk beschriebenen Methode vorgenommen werden. Die Mannoproteine müssen mindestens 70% Mannose in Bezug auf die in 4.11 gemessenen Gesamtpolysaccharide enthalten Wirksamkeitstest der Mannoproteine hinsichtlich der Weinsteinbildung Prinzip: Ermitteln der Menge an Mannoproteinen, um das Kristallisieren von Kaliumhydrogentartrat in einer hydroalkoholischen Lösung zu verzögern Substanzen: Kristallisierte Weinsäure: MG = 150,05 Äthanol (95% Volumen) Kaliumchlorid: MG= 74,5 Kaliumhydrogentartrat: MG = 188 5

6 Protokoll: Mannoproteinlösung (10 g/l) 1 g Mannoproteine in 100 ml destilliertem Wasser auflösen Hydroalkoholische Matrix In einem halb mit destilliertem Wasser gefüllten 1 Liter-Messkolben folgende Substanzen auflösen: - Weinsäure: 2,1 g - Kaliumchlorid: 1,1 g - Äthanol (95 % Volumen): 110 ml Mit destilliertem Wasser homogenisieren und ergänzen Test : In fünf 100 ml Messkolben zunehmende Mengen ( ml) Mannoproteinlösung ( ) geben und mit der hydroalkoholischen Matrix auf 100 ml ergänzen ( ). Diese Mengen entsprechen den Endmengen mg/l an Mannoproteinen. In jeden Messkolben 100 mg Kaliumhydrogentartrat hinzugeben. Bis zum vollständigen Auflösen von Kaliumhydrogentartrat während 1 Stunde in ein Wasserbad mit 40 C stellen. Die Messkolben in einen Kühlschrank (4 C) stellen. Beobachtung nach 48 Stunden: Im Kontrollkolben mit 0 ml Mannoproteinlösung ( ) hat sich Weinstein gebildet. Durch das Fehlen von Weinsteinkristallen in den Kolben mit Mannoproteinen kann ihre Wirksamkeit beurteilt werden. In der Lösung mit 400 mg/l Mannoproteinen dürfen in keinem Fall Weinsteinkristalle vorhanden sein Wirksamkeitstest der Mannoproteine hinsichtlich der Stabilisierung von Eiweiß im Wein Prinzip Ermitteln der Menge an Mannoproteinen, um die Stabilisierung von Eiweiß im Wein zu verbessern Substanz: Bovines Serumalbumin (V-Fraktion) (BSA) Protokoll: Bovine Serumalbuminlösung (10 g/l) 2 g bovines Serumalbumin in 200 ml destilliertem Wasser auflösen Mannoproteinlösung (20 g/l) 2 g Mannoproteine in 100 ml destilliertem Wasser auflösen. 6

7 Test Jeweils 1 ml BSA-Lösung ( ) in zwei 100 ml Messkolben geben und jeden Messkolben mit trockenem Weißwein, der bei Erhitzen keine Trübung aufweist (oder der falls erforderlich durch eine Bentonitbehandlung mit entsprechender Menge stabilisiert wurde), auf 100 ml auffüllen und homogenisieren. 0 und 1ml Mannoproteinlösung ( ) hinzufügen und homogenisieren. Diese Mengen entsprechen den Endmengen 0 und 200 mg/l an Mannoproteinen. Kontrolllösung und behandelte Lösung auf einer Membran mit Porendurchmesser 0,45 µm filtern. Die gefilterten Lösungen in zwei 50 ml Kolben füllen. Die beiden 50 ml Kolben während 30 Minuten in ein 80 C heißes Wasserbad stellen. Während 45 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen lassen und anschließend die Trübung von Kontrolllösung und behandelter Lösung messen. Die Trübungsminderung der behandelten Probe im Vergleich zur Kontrolle muss mindestens 50% betragen Qualitative Bestimmung im Wein Prinzip Die Bestimmung der Mannoproteine im Wein kann nach Fällung mit Äthanol (5 Volumen), saurer Hydrolyse des Niederschlags und Dosieren von freigesetzter Mannose gemäß der im Anhang aufgeführten Methode erfolgen. 5. LAGERUNG Mannoproteine in fester Form können über 2 Jahre gelagert werden, wenn sie gut verpackt in einem trockenen Raum mit mäßigen Temperaturen aufbewahrt werden. Als gebrauchsfertige Kolloidlösung angebotene Mannoproteine müssen in einem hermetisch geschlossenen Behälter aufbewahrt werden. 7

8 Anhang Prinzip Enzymatisches Dosieren von Mannose Mannose wird wie Glucose und Fructose phosphoryliert: Mannose + ATP M6P + ADP Nach dem Dosieren von Glucose und Fructose wird Mannose 6-Phosphat unter Einwirkung von Phosphomannoseisomerase (PMI) in Fructose-6-Phosphat umgewandelt. PMI M-6-P F-6-P Das neu gebildete Fructose-6-Phosphat wird wie vorausgehend in Glucose-6-Phosphat umgewandelt und dosiert. Durchführung In ein Zentrifugenröhrchen 5 ml Wein geben und 25 ml 95 %iges Äthanol hinzufügen. Nach Schütteln werden die Röhrchen während 12 Stunden in den Kühlschrank (4 C) gestellt. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen; zweimal mit 10 ml 95 %iges Äthanol waschen. Die Hydrolyse des Niederschlags und die Bestimmung der Mannose werden entsprechend durchgeführt. Bei dieser Bestimmung können die hinzugefügten Mannoproteine nicht von den natürlichen Mannoproteinen unterschieden werden. Zusätzliches Reagens in Bezug auf die Methode des Sammelwerks der internationalen Analysemethoden für Wein und Most Lösung 6: Phosphomannoseisomerase (616 E/ml). Die Suspension wird unverdünnt verwendet. Bestimmung Nach Messen von A 3 gemäß der Methode des Sammelwerks der internationalen Analysemethoden für Wein und Most Zugabe von: Kontrolle Probe Lösung 6 0,02 ml 0,02 ml Mischen; nach 30 Min. Messung durchführen; Reaktionsende nach 2 Min. überprüfen (A 4 ). 8

9 Ermitteln der Absorptionsdifferenzen: A 4 A 3 entspricht Mannose. Bei Kontrolle und Bestimmung: Absorbanzdifferenz der Kontrolle ( A T ) von der der Bestimmung ( A D ) abziehen. Bei Mannose: A M = A D - A T Ergebnisse Man erhält für Mannose: Cg/l = 0,423x A M Hinweis: Wenn die Messungen mit einer Wellenlänge von 334 oder 365 nm erfolgten, erhält man: Messung mit 334 nm: Mannose: Cg/l = 0,430x A M Messung mit 365 nm: Mannose: Cg/l = 0,783x A M 9