MALDI-TOF zur Erregerdifferenzierung MALDI Biotyper

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1 MALDI-TOF zur Erregerdifferenzierung MALDI Biotyper

2 Intens. [a.u.] Die MALDI TOF Differenzierung ist robust, beruht auf Messung hochprävalenter (ribosomaler) Proteine ribosomal Protein m/z RL ,33 RS ,82 RL ,39 RL33meth. 6255,39 RL ,19 RL ,60 RL ,74 RL ,45 RL ,06 RS , m/z E. coli

3 Identifikation

4

5 Konventionelle Testung: Wachstum in Gegenwart von Antibiotika Vorteile: Breites AB Spektrum K Korrelation von in vitro Testung und klinischem Ansprechen z.t. sehr gut automatisiert Nachteil: Zeitverzögerung etwa 1 Arbeitstag

6 MALDI-TOF MS zum Nachweis von Resistenzen gegen Antiinfektiva: Möglichkeiten und Grenzen Prof. Dr. med. Sören Schubert Max von Pettenkofer-Institut LMU München

7 MALDI-TOF MS 1. Direktnachweis von Resistenzfaktoren

8 MALDI-TOF MRSA Nachweis?

9 MRSA

10 MALDI TOF Nachweis von MRSA

11 Wolters et al., 2011

12 MALDI-TOF Detektion von Antibiotika-Resistenzen b-laktamasen (ESBL) Carbapenemasen (NDM-1, KPC, )

13 Problem

14 > 700 b-laktamase - Subtypen SHV-1 SHV-2 SHV-3 SHV-178 OXA-1 OXA-2 OXA-3 OXA-161 TEM-1 TEM-2 TEM-3 TEM-213 CTX-M-1 CTX-M-2 CTX-M-3 CTX-M-75 CMY-1 CMY-2 CMY-3 CMY-23 IMP-1 IMP-2 IMP-3 IMP-23

15 Fazit: Direktnachweis von Resistenzfaktoren Nachweis klonaler Gruppen! Nachweis MRSA-assoziierter Peptide! Nicht verlässliche Resistenz-Identifikation b-laktamasen, PBP2a, Van A / Van B

16 MALDI-TOF MS 1. Direktnachweis von Resistenzfaktoren (z.b. PBP2a) 2. b-laktamase Aktivitätstest (MS-BL)

17 b-laktamase Aktivität +H 2 O + 18 Da - 44 Da A B C

18 Ampicillin + ESBL-E. coli Ampicillin + b-lact.-neg. E. coli C A B Sparbier et al., 2012

19 396.1 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Cefotaxim (CTX) 4 x A CTX + ESBL- neg. E. coli 0 x B CTX + ESBL-pos. E. coli 0.0 x m/z C CTX / CLAV + ESBL-pos. E. coli Zimmermann et al. J. Clin. Microbiol. 2011, 49(9):3321 Sparbier et al. J Clin Microbiol Mar;50(3):927-37

20 CAZ 0.5 mg/ml CAZ in 10 mm NH 4 -hydrogen carbonate 2 h incubation 15 µl sup plus 5 µl 0.5 ng/µl reserpine 1.5 µl spotted b-laktamase- Aktivität CAZ_ CAZ_ CAZ_ CAZ_DH5a CAZ_K logrq Keine Spaltung Spontanhydrolyse

21 Identifikation b-laktamase Aktivität

22 4 MIC>256 5 MIC 4 9 MIC 8 10 MIC > MIC > MIC > MIC > MIC 3 21 MIC 4 22 MIC 3 25 MIC 4 30 MIC 6 31 MIC 4 37 MIC 6 39 MIC 2 40 MIC > MIC 3 42 MIC > MIC > MIC 4 47 MIC> MIC> MIC 4 54 MIC > MIC > MIC > MIC > MIC > MIC > MIC 4 66 MIC > MIC > MIC 4 72 MIC > MIC > MIC > MIC > MIC > MIC 6 84 MIC > MIC 3 86 MIC > MIC 8 90 MIC 2 91 MIC > MIC >256/4 93 MIC 1,5 94 MIC >256 E. coli ATCC logrq E. coli direkt aus positiven Blutkulturen Ampicillin 1 Ampicillin MIC > Ampicillin MIC Jung et al., 2014

23 Fazit 2: MALDI-TOF b-laktamase Aktivitätstest Schneller Test 1,5 3 h Automatische Analyse Direkt aus positiven Blutkulturen Beschränkt auf bestimmte Antibiotika-Resistenzen b-laktamasen (z.b. ESBL, Carbapenemasen)

24 MALDI-TOF MS 1. Direktnachweis von Resistenzfaktoren (z.b. PBP2a) 2. MALDI-TOF b-laktamase Aktivitätstest (MS-BL) 3. Antibiotika Resistenzbestimmung - phänotypisch

25 Phänotypischer Resistenztest (MS-RESIST) 13 C 6 15 N 2 -L-Lysin 8Da 8Da Susceptible: No integration Für alle kultivierbaren Bakterien einsetzbar Resistant: Integration

26 Antibiotika-Resistenztest mit stabilen Isotopen normal Lys Control 1 heavy Lys + antibiotic Susceptible Resistant heavy Lys Control 2 October 21,

27 S. aureus Massenspektrum Gel-Ansicht MSSA OXA sensibler Stamm MRSA OXA - resistenter Stamm normal normal heavy + Oxa heavy + Oxa heavy heavy October 21,

28 MRSA P. aeruginosa

29 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] MBT MS-RESIST / P. aeruginosa (Tobramycin- susceptible) _N 0:B8 MS, BaselineSubtracted, Smoothed normal _H_60 0:A10 MS, BaselineSubtracted, Smoothed heavy + TOB _H 0:A7 MS, BaselineSubtracted, Smoothed heavy Jung et al., EJCMID 2013 October 21, 2014 m/z 29

30 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] MS-RESIST/ P. aeruginosa (Tobramycin-resistant) _N 0:G10 MS, BaselineSubtracted, Smoothed normal _H_60 0:G1 MS, BaselineSubtracted, Smoothed heavy + TOB 0 x _H 0:F11 MS, BaselineSubtracted, Smoothed heavy m/z Jung et al., EJCMID 2013 October 21,

31 Ciprofloxacin Pseudomonas aeruginosa Meropenem Tobramycin Jung et al., 2014

32 3. Antibiotika-Resistenbestimmung mit phänotypischen MALDI-TOF-Tests Phenotypischer Test ohne Isotope!

33 MS ASTRA MALDI-TOF MS zur Wachstumsmessung (quantitativ) BHI McF 0.5 Incubation 37 C Species dependent time Antibiotic Cell lysis Lysis reagent with internal standard Target preparation Acquisition of MS profile spectra

34 spectra view Klebsiella pneumoniae Standard [M+ H] 2+ Standard [M+ H] 2+ Standard [M+ H] + Standard [M+ H] + BHI + Meropenem 8 µg/ml sensibel Nur BHI resistent Lange et al. J Clin Microbiol. 2014

35 Zusammenfassung (1) Direktnachweis von Resistenzfaktoren Nachweis klonaler Gruppen Kann den Nachweis klonal verbreiteter Resistenzfaktoren ermöglichen Zweifelhaft! (bisher) kein Direktnachweis von b-laktamasen, PBP2a, Van A/B,

36 Zusammenfassung (2) b-laktamase Aktivitätstest (MS-BL) Schneller Test h Automatische Analyse Direkt von positiven Blutkulturen anwendbar Beschränkt auf bestimmte Resistenzen b-laktamasen Alle b-laktamasen nachweisbar? Einsatz?

37 Zusammenfassung (3) Phänotypischer Resistenztest (MS RESIST / MS ASTRA) Schneller Test 2 3 h Universell Automatische Analyse MS RESIST: Stabile Isotope: Komplexer Workflow Kits und Karten wären notwendig MS ASTRA: Einfache Handhabung Alle bug-drug Kombinationen analysierbar? Einsatz: Wann?

38 Bruker Daltonik Katrin Sparbier Markus Kostrzewa Christoph Lange Max von Pettenkofer-Institut Jette Jung Theresa Eberl Christina Popp Julia Walker Christina Hamacher Lukas Schmidt ForBIMed FöFoLe

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