Wechselwirkungen zwischen Bt-Mais und der Umwelt: Ergebnisse der Biosicherheitsforschung des BMBF

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1 Wechselwirkungen zwischen Bt-Mais und der Umwelt: Ergebnisse der Biosicherheitsforschung des BMBF Verbundprojekt: Freisetzungsbegleitende Sicherheitsforschung an Mais mit multiplen Bt-Genen zur Maiszünslerund Maiswurzelbohrerresistenz Dr. Stefan Rauschen RWTH Aachen Institut für Biologie III (Pflanzenphysiologie)

2 Bt-Mais mit Event MON89034 x MON88017 konventionelle Kreuzung aus zwei verschiedenen Bt-Maissorten ( Genuity VT Triple Pro ) Resistenz gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer und den Maiszünsler Bt-Protein Cry3Bb1 gegen Diabrotica v. virgifera Bt-Proteine Cry1A.105, Cry2Ab2 gegen Ostrinia nubilalis

3 Feldversuch über 3 Jahre auf Flächen des Friedrich- Loeffler-Instituts/von Thünen-Instituts in Braunschweig Vergleich zwischen MON89034 x MON88017 Nah-isogene Ausgangslinie DKC5143 Benicia DKC4250 DKC5143 behandelt mit Tefluthrin (Force 1.5 G) Wechselwirkungen mit dem Agrar-Ökosystem

4 Partner im Forschungsverbund AG Dr. habil. Jehle, Neustadt/Darmstadt AG Prof. Steffan-Dewenter, Würzburg AG Dr. Rauschen, Aachen AG Prof. Tebbe, Braunschweig AG Dr. Ulrich, Müncheberg AG Dr. Benker, Freising AG PD Dr. Gessler, Göttingen AG Dr. Höss, Regensburg

5 Herstellung und Reinigung der Cry-Proteine MON89034 x MON88017 Klonierung, Herstellung und Reinigung von Cry1A.105, Cry2Ab2 und Cry3Bb1

6 Proteinkonzentration in verschiedenen Pflanzenteilen Die Konzentrationen von Cry1A.105, Cry2Ab2 und Cry3Bb1 wurden mit DAS-ELISA und Cry-Toxin Standard in verschiedenen Pflanzengeweben ermittelt. Die Konzentration ist in den Blättern am höchsten und im Fruchtfaden, Pollen und Korn am niedrigsten

7 Bt-Proteine: Gehalte IN und AN Maiswurzeln (Boden) Cry1A.105 Cry2Ab2 Cry3Bb1 Mehr Cry1A.105 in den Fein- als in den Grobwurzeln Im wurzelnahen Boden von Bt-Pflanzen Cry1A.105 und Cry3Bb1 immer unter einem Nanogramm pro Gramm Boden Cry2Ab2 kaum detektierbar Im Rhizosphäre-Boden ca bis mal weniger Cry-Proteine als in den Wurzeln (bezogen auf Gramm)

8 Mikroorganismen-Gemeinschaften IN und AN Maiswurzeln DNA-Extrakte Benicia DKC4250 T-RFLP PCR von rrna Genen Nahisogen Bt Mais Tefluthrin Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften (Pilze, Bakterien, Archaeen) IN bzw. AN Fein- und Grobwurzeln unterschiedlich (Basis rrna Gene) Diversität der Mikroorganismen-Gemeinschaften bei jeder Sorte signifikant unterschiedlich Unterschiede zu Bt-Mais nicht größer als zwischen anderen Sorten ermittelt mit 454 Sequenzierung (Basis: ca partielle rrna Sequenzen!!!) Mehr Mikroorganismen an Fein- als an Grobwurzeln (bezogen auf Gramm) An Bt-Maiswurzeln leben genauso viele Boden-Mikroorganismen wie an denen der nahisogenen Ausgangslinie keine negativen Effekte erkennbar

9 Bt-Pollen Verdauung und Protein-Nachweis Pollen-Verdauungsraten Ammenbienen Bt-Protein Nachweis im Bienendarm Enddarm Mitteldarm N 34 Kolonien 132 Bienen Pollen Keine Bt-Effekte auf die Verdauung von Ammenbienen

10 Bt-Proteine und Bakteriengemeinschaften im Bienendarm T-RFLP Wenig Bt-Proteine im Darm im Vergleich zur Pollenmenge Hinweis auf Abbau Mehr Bt-Proteine im Enddarm als im Mitteldarm korreliert mit Darmvolumen Bt-Proteine auch in Bienen ohne Bt-Mais Kontakt durch Vorkommen von natürlichen Bakterien aus der Gruppe Bacillus thuringiensis Kein Einfluss von Bt-Pollen auf die Häufigkeit der Darmbakterien Bakterienvielfalt für jede Maissorte charakteristisch

11 Herstellung spezifischer mono- und polyklonaler Antikörper 1,0 0,8 Monoklonale Antikörper - Spezifität Cry1A.105 Cry2Ab2 Cry3Bb1 Cry1Ab BSA 0,8 0,6 Polyklonale Antikörper Titerentwicklung in Ziege Cry1A.105 Cry2Ab2 Cry3Bb1 Extinktion [450 nm] 0,6 0,4 Extinktion [450 nm] 0,4 0,2 0,2 0,0 0,0 Klon 1 Klon 2 Klon 3 Klon 4 Klon 5 Klon Immunisierung Tage nach der Immunisierung Monoklonale und polyklonale Antikörper wurden erfolgreich generiert. Diese Antikörper wurden den Verbundpartnern zur Verfügung gestellt.

12 Bindungsmechanismen zwischen Bt-Protein und Boden Bindung von Cry3Bb1 in den Böden der Freisetzungsfläche A A Bindungsmechanismus Hydrophobe Wechselwirkung zwischen Bt-Protein und Partikeloberflächen B B Bt-Protein Parzellenreihe C C D D E E Tonmineral Bindung der Bt-Proteine hydrophobe Wechselwirkung k = 1506 Bodenkundliche Analyse Homogener Standort (Körnung, ph, Corg, etc.) Heterogenes Bindungsverhalten gegenüber Bt-Proteinen k k = 265 k = 82 Cry1A.105 Cry2Ab2 Cry3Bb1

13 Wirkung von Cry Proteinen auf Caenorhabditis elegans (Nematoda) Nematoden-Biotest nach ISO C. elegans Cry-Proteinlösung (Cry1.105, Cry2Ab2, Cry3Bb1, Cry5B) 96 h subletale Toxizitätsendpunkte Generationszyklus N2 /bre-5 Wachstum, Reproduktion Insektizide Cry Proteine (Cry1.105, Cry2Ab2, Cry3Bb1) zeigen dosisabhängige Wirkung im gleichen Konzentrationsbereich wie gegen Nematoden wirkende Cry Proteine (Cry5B). Versuche mit Bt resistenten, mutanten Nematoden weisen auf Bindung der insektiziden Cry Proteine an Bt spezifische Rezeptoren im Darm hin.

14 Nematodenlebensgemeinschaften Versuchsfeld Multivariate Auswertung: Principle-Response-Curves Canonocal Coefficients Referenz: Nah-Isogener Mais Referenzlinie (Iso) Juni Aug Okt Mai Aug Okt Nematodenlebensgemeinschaft zeigen jahreszeitliche Schwankungen und im Sommer sortenbedingte Unterschiede. Bt Mais Anbau hat auf Grund der geringen Cry Protein Konzentrationen keinen spezifischen Einfluss. Variation in den Lebensgemeinschaften können z.t. durch die Bodentextur erklärt werden

15 Wirkung von Bt-Mais auf Struktur und Funktion der Stroh abbauenden Mikroflora qpcr Sorteneffekt beim Maisstrohabbau, kein Einfluss der gentechnischen Veränderung Real-time PCR-Nachweis mikrobieller Gruppen Nur saisonal auftretende Unterschiede in den Häufigkeiten der unterschiedlichen Gruppen der aktiven Stroh abbauenden Mikroflora

16 Wirkung von Bt-Mais auf Struktur und Funktion der Stroh abbauenden Mikroflora Fingerprintanalyse (T-RFLP) bakterieller Gemeinschaften Signifikante Korrelation zwischen der Struktur der mikrobiellen Gemeinschaften und den Bodeneigenschaften Keine Auswirkungen der Pflanzensorte auf die Struktur der am Strohabbau beteiligten pilzlichen und bakteriellen Gemeinschaften

17 Auswirkungen auf einen Nichtziel-Organismen der Krautschicht Modellorganismus Reisblattwanze (Dr. K.U. Priesnitz) Für die Reisblattwanze Trigonotylus caelestialium konnten im Feldexperiment und Laborversuchen Sorteneffekte gezeigt werden Der Bt-Mais unterschied sich nicht von der nah-isogenen Ausgangslinie

18 Auswirkungen auf Nichtziel-Schmetterlinge in der Agrarlandschaft Kleiner Fuchs (Raimund Knauf) Tagpfauenauge (Raimund Knauf)

19 lokale und regionale Exposition von Nichtziel- Schmetterlingen gegenüber Bt-Pollen Pollendeckung auf Brennnesselblättern ist nur im unmittelbaren Nahbereich um das Maisfeld herum relevant Mit zunehmender Entfernung zum Maisfeld nimmt die Pollendeckung stark ab In zwei Modellregionen wurde der überwiegende Teil der Nester in mehr als 10 Meter Entfernung vom nächsten Maisfeld aufgefunden Zeitliche Überlappung zwischen der Maisblüte und dem Auftreten von Schmetterlingslarven ist nicht in jedem Jahr gegeben und ein wichtiger Faktor

20 Auswirkungen auf Laufkäfer im Feldversuch Relative Dichte (Fangzahlen) Bt-Mais nah-isogene Sorte Tefluthrin Benicia DKC4250 Insgesamt über Laufkäfer und Spinnen, keine Sorteneffekte Pflanzenschutz Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft Institut für Pflanzenschutz

21 Toxizitätstests mit einzelnen und kombinierten Bt-Proteinen an dem Laufkäfer Poecilus cupreus Verpuppungs- und Schlupfraten [%] Cry3Bb1 Verpuppt Geschlüpft Kontrolle Weitere Testparameter: Gewicht und Fruchtbarkeit (Full-Life- Cycle Test) Auch bei kombinierten Proteinen keine Effekte Pflanzenschutz Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft Institut für Pflanzenschutz

22 Sammeldistanzen für Maispollen in der Agrarlandschaft Bestimmung der Pollenart Aufnahme der Bienentänze Berechnung der Koordinaten Berechnung der Sammeldistanzen 12 Landschaften mit unterschiedlicher Maisdeckung N = 4 Beobachtungsstöcke

23 Akute und chronische Toxizität von Bt-Pollen Keine akuten oder chronischen Effekte auf adulte Bienen

24 Fütterungsversuche: in vitro Larventest Bt-Pollen Keine letalen Effekte auf Larvalentwicklung Bt-Pollen Keine sub-letalen Effekte auf Larvalentwicklung

25 Ergebnisse der Verbundforschung Die unterschiedlichen Eigenschaften der Bt-Proteine erfordern fall-spezifische Untersuchungen Einzelne Nichtziel-Organismen werden unter Laborbedingungen beeinflusst, dies ist aber nicht direkt auf das Freiland übertragbar Nur Freilandversuche erlauben eine Bewertung ökologischer Wechselwirkungen unter realistischen Anbaubedingungen Einflüsse des Bt-Maises gehen nicht über die Effekte konventioneller Sorten hinaus Keine synergistischen Effekte der Bt-Proteine auf Nichtziel- Organismen nachgewiesen

26 zukünftiger Forschungsbedarf Einordnung in die natürliche Variabilität (kann nur über Freilandversuche bearbeitet werden; wichtige Basisdaten fehlen; Systemvergleich) Weiterentwicklung und Vereinheitlichung des Forschungsdesigns (Testorganismen; Laborversuche und Protokolle; Proteinnachweis; Design von Feldexperimenten; Vergleichssorten) Hier gibt es aus der BMBF-geförderten Forschung wichtige und international beachtete Ergebnisse, an die angeknüpft werden sollte.

27 Danksagung Bundesministerium für Bildung und Forschung Projektträger Jülich Leitung und Mitarbeiter des von Thünen- Instituts in Braunschweig Leitung und Mitarbeiter der Versuchsstation des Friedrich-Loeffler-Instituts Ihnen für Ihre Aufmerksamkeit!