HYDRAGEL A1AT. Alpha 1 Antitrypsin Mangel

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1 HYDRAGEL A1AT Alpha 1 Antitrypsin Mangel

2 Pathologie Erbliche Stoffwechselkrankheit die zu einer Hepatitis oder einer Zirrhose führen kann Die häufigste genetische Ursache für Lebererkrankungen bei Kindern Erwachsene können ebenso betroffen sein und können Probleme mit Lungenemphysemen oder Lebererkrankungen haben

3 Alpha 1 Antitrypsin Eine der wichtigsten Proteinaseinhibitoren im Plasma Hauptaufgabe: Inaktivierung von zahlreichen proteolytischen Enzymen, Schutz des Lungengewebes Glykoprotein (51 KD) mit vielen molekularen Varianten Mehr als 75 Varianten sind bekannt und im Pi System (Protease Inhibitor) klassifiziert Alphabetische Klassifizierung aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität schnell: A-K langsam: N-Z

4 Migration der häufigsten Varianten Anodic variants Cathodic variants

5 A1AT Varianten Hauptinteresse der Detektion: Aufdeckung von defizienten A1AT Allelen Die Vererbung der Allele erfolgt codominant autosomal Z.B. : MS 50% M Protein und 50% S Protein Der normale Phänotyp ist MM und weist 100 % der normalen Enzymaktivität auf Die häufigsten defizienten Phänotypen: MS, MZ, SS, SZ und ZZ Z Variante: Relativ instabil und polymerisiert im endoplasmatischen Reticulum (ER) Nur bei Phänotypen die diese Polymerisation durchführen kommt es zu Leberschäden.

6 A1AT Varianten Ungefähr 95% aller A1AT Phänotypen die zu klinischen Ausprägungen führen sind ZZ homozygot S Allel, führt homozygot oder mit dem M-Allel nicht zu Leberschäden In Kombination mit dem Z Allel: mögliche Beteiligung In Nordeuropa findet man das Z-Allel häufiger 1-2% homozygote Träger Das S-Allele ist häufiger in südeuropäischen Populationen 2-4% homozygote Träger Beide Allele sind in der schwarzen oder asiatischen Populationen sehr selten

7 Frequenz von S Allelen Häufigkeit der S und Z Allele Frequenz von Z Allelen Häufigkeit von A1AT Mangel in der Bevölkerung: 1/1600 bis 1/2000 bei der Geburt

8 Häufige Phänotypen in der europäischen Bevölkerung MM : 81% der Bevölkerung mit 100% Aktivität FM : 5% der Bevölkerung mit 100% Aktivität MS : 7% der Bevölkerung mit 80% Aktivität MZ : 3% der Bevölkerung mit 56% Aktivität

9 Varianten mit ausgeprägtem Krankheitssyndrom ZZ : 0.03% der Bevölkerung mit 12% Aktivität SZ : 0.17% der Bevölkerung mit 12% Aktivität MZ : der Bevölkerung mit 56% Aktivität M (Malton oder andere), Null/Null, Z oder S/ Null: sehr selten und mittels Phänotypisierung schwer zu identifizieren Patienten mit o.g. Phänotypen tragen eine Prädisposition zu erhöhtem Abbau von Lungengewebe mit Emphysemen im Alter von Jahren. Rauchen führt zu einem Jahre schnelleren Ausbildung dieser Schäden.

10 Die verschiedenen Diagnosemethoden Nephelometrische Methoden: Die Bestimmung des A1AT Gehalts mittels Immunpräzipitation ist insuffizient um einen A1AT Mangel nachzuweisen. Der A1AT Gehalt kann aufgrund einer Akut-Phase Reaktion überbestimmt werden. aus diesem Grund sollte zusätzlich zur quantitativen Bestimmung auch eine Phänotypisierung mittels isoelektrischer Fokussierung erfolgen.

11 Die verschiedenen Diagnosemethoden Isoelektrische Fokussierung: Bei der isoelektrischen Fokussierung wird das M-Allel in 8 Banden getrennt, welche geringe unterschiede ihres isoelektrischen Punktes aufweisen. Die Hauptbanden an Position 4 und 6 werden zur Identifikation des Phänotyps verwendet. Andere Allele zeigen ein verschobenes Bandenmuster aufgrund der abweichenden der isoelektrischen Punkte und können so von dem M-Allel unterschieden werden. Es gibt Untervarianten von der M-Form M: M1, M2, M3. M1: Wild type, unmutiert M2: 2 Mutationen (Position 376 und 101) M3: 1 Mutation (Position 376) Kombinationen: M = M1M1 M1M2, M1M3, M2M3... klinisch nicht von Interesse

12 Die verschiedenen Diagnosemethoden: IEF Glykan mit zwei Antennen mit NaNa Resten Peptid 8 NaNa 7 NaNa 6 NaNa 7 NaNa 6 NaNa A1AT isoglycoforms Isoform Struktur NaNa: N-Acetylneuraminsäure

13 Die verschiedenen Diagnosemethoden: IEF Patienten mit dem schwersten Mangel haben eine Allel-Variante die zu einem höheren isoelektrischen Punkt wandert, identifiziert als Pi ZZ Phänotyp.

14 SEBIA Technik Isoelektrische Fokussierung auf Agarosegel, mit anschließender Immunfixation mit einem Peroxidase gelabelten Anti-α-1-Antitrypsinantikörper Serum Verdünnung: 1/10 Applikationzeit: 30 Sek auf Position 1 Migration in zwei Schritten: 1- bei 400 V bis 360 Vh 2- bei 1500 V bis 150 Vh (Migrationszeit ca. 1 Stunde)

15 SEBIA Technik Immunfixation: Inkubation mit 300 µl verdünntem Antiserum Die weiteren Abarbeitungsschritte (Waschen, Rehydrieren und Färben des Gels) sind identisch mit der CSF Isofocusing Prozedur * Gesamt Bearbeitungszeit: 1:50

16 SEBIA Technik

17 M1M2 MM MM SS MZ SZ M1M3 MX(?) MZ MS M1M2 MS MM ZZ MM Mi MM SZ

18 MM MS EM (?) MS MX(?) MZ MN MZ MN MM MZ SZ MZ MM MS MS MZ MZ

19 MM MS MX (?) SS MM M1M2 MM MM M3(?) SS MZ old MW MS MM MM M1M2 MM

20 MP MW(?) ZZ MV M2P SS M+(?) MX(?) MS? MX(?) SS MF MX(?) Mi M+(?) MZ MN

21 MM M1M2 MM SZ MZ MM MS M1M2 MZ MM MM MS MS MX(?) MZ MN MM SZ

22 Referenz Methode Die meisten Labore haben eine In-house-Methode: Gel Vorbereitung: Agarosegel und Färbung Coomassie Blau Acrylamidgel und Silberfärbung Nachteile: Lange Bearbeitungszeit Schlechte Reproduzierbarkeit Interferenz durch Haptoglobin im kathodischen Bereich

23 Agarosegel mit Coomassie Färbung

24 Hydragel 18 A1AT kit (Ref. 4357) Ready to use Gel Schnelle Bearbeitung Spezifischer Nachweis mit Peroxidase-gelabelten Anti A1AT Antikörper Kontrollen (Ref. 4771) 3 Kontrollen, Phänotyp: MM, MZ und MS

25 Fazit Um die Interpretation zu erleichtern wird dringend empfohlen: Kontrollen zu verwenden Das Ergebnis anderer Assays mit der A1AT Phänotypisierung zu bestätigen Eine einfache Serumeiweißelektrophorese reicht aus, um Hinweise auf eine Störung (entzündlichen Prozess, Leberoder Nierenschädigung) zu erhalten

26 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit sebia GmbH Münsterfeldallee 6 D Fulda ( 0049(0) FAX 0049(0) : sebia@sebia.de