Unsere Lungen sind nicht steril - Das Mikrobiom der Lunge

Transkript

1 Unsere Lungen sind nicht steril - Das Mikrobiom der Lunge Markus Hilty Institute for Infectious Diseases, University of Bern, Switzerland Department of Infectious Diseases, University Hospital, Switzerland Department of Pediatrics, University Hospital, Switzerland 1

2 Inhaltsverzeichnis Teil 1: Lunge steril oder nicht? Wie alles begann - Molekulare Methoden - Bakterien in der Lunge von Patienten mit Asthma, COPD und Kontrollen Teil 2: Obere Atemwege von Kleinkindern mit und ohne Cystischer Fibrose - Einleitung - Methoden - Erste Resultate und Vergleich zu Kindern mit Mittelohrenentzündung 2

3 Teil 1: Wie alles begann Bakterien in der Lunge von Asthmatikern und Kontrollen Asthma: Am häufigsten in Kindern Nord-Süd Gradient Vererbbar Aufwachsen auf dem Bauernhof hat einen protektiven Effekt Exazerbationen werden oft durch Infektionen ausgelöst Analyse von Bakterien mit molekularen Methoden eine gute Idee? 3

4 Aufarbeitung von Abstrichen swab einfrieren -80 C Mikrobiota? - 16S multiplex PCR Rasen Einfrieren -80 C Isolierte Stämme von S. pneumoniae Einfrieren -80 C Brugger et al., PLoS One 2010; Hilty et al. JID,

5 16S rrna Sekundärstruktur V4 V6 V7 V5 V3 V8 primers V1 V9 V2 Sequenzen vergleichen mit GenBank 5

6 PCR Produkte 6

7 Mikrobiota in der Lunge - Patientenauswahl Klinische Proben von Erwachsenen (11 Asthmatiker, 5 mit COPD und 8 gesunde) Geburtsdatum (COPD 58±12.5y, Asthma 38.6±18.3y und Kontrollen 53.9±10.9y) Geschlecht (COPD 3m/2f, Asthma 8m/3f und gesunde 3m/5f), Gewicht und Grösse, Raucherstatus, Antibiotika FVC, FEV 1, DLCO und Bronchoskopie Sterile Abstriche und bedeckte Lungenbürsten 7

8 Mikrobiota in der Lunge - Probengewinnung A D B C E A: Nasenabstrich B: Rachenabstrich C: Linker oberer Lappen prox. D: Linker oberer Lappen distal E: Rechter unterer Lappen

9 log10 (cells per 40 ng) Quantifizierung von totaler bakterieller DNA COPD Asthma Controls LUL1 LUL Smokers

10 Nose OP LUL bronchus LUL bronchus Nose OP LUL bronchus LUL bronchus Nose OP LUL bronchus LUL bronchus RLL bronchus Nose OP LUL bronchus LUL bronchus RLL bronchus Reference Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) zur Untersuchung von Kontamination 1 2, , 9 10,11 12,13 14,15 16

11 Taxonomie der Bakterien 11

12 % Häufigkeit von bakteriellen phyla in der Lunge P< P< P< P< Proteobacteria Firmicutes Bacteriodites Actinobacteria Fusobacteria others COPD ASTHMA CONTROLS Disease status Hilty et al., PLoS One 2010

13 Teil 2 - Bakterielle Infektion und Krankheitsverlauf von Cystischer Fibrose Staphylococcus aureus (früh), Haemophilus influenzae (früh) und Pseudomonas aeruginosa (spät) haben erhöhte Prävalenz P. aeruginosa kann sich während der Infektion anpassen z.b. Ausprägung des mukoiden Phänotyps oder durch seine Fähigkeit Biofilme zu bilden. Krankheitsverlauf komplex; anstatt einzelnen Bakterien sollte man die ganze Zusammensetzung auf einmal untersuchen => Methoden, die nicht auf bakterieller Kultur basieren sind nötig um den Krankheitsverlauf zu verstehen. 13

14 Faktoren, die die nasopharnygeale Flora beeinflussen können 14

15 Microbiota in Cystischer Fibrose Cox et al, 2010 PLoS One; Vanja Klepac-Ceraj, 2010 Env. Microbiology Harris JK et al, 2008 PNAS 15

16 Forschungsziele Charakterisierung der bakteriellen Besiedleung des Nasopharynx im ersten Lebensjahr von gesunden Babies. Charakterisierung der bakteriellen Besiedleung des Nasopharynx im ersten Lebensjahr von Babies mit CF. Vergleich zwischen den beiden Gruppen: => Identifikation von guten Bakterien => Identifikation von Krankheit (Exacerbation) assozierten Bakterien => Bakterielle Diversität als diagnostischer Marker? 16

17 Abstrich gelagert bei -20 C Virus - RNA extraction and RT PCR (Pädiatrische Pneumologie) Microbielle flora - 16S multiplex PCR Lagerung von Stämmen 17

18 Terminologie OTU (Operational Taxonomic Unit): Normalerweise 97% Sequenzidentität Richness Anzahl OTUs in einer Probe Shannon diversity index (SDI): Zusätzlich zur Anzahl auch die relative Häufigkeit von verschiedenen OTUs/Bakterien Beispiel: gleiche Anzahl verschiedene SDI 18

19 Resultate: Shannon Diversity Index (Proben von 10 gesunden Kindern) 19

20 Concentration in ng/ull Kolonisationsdichte Quantifizierung der Bakterien n=5 n=6 n=8 n=10 n=10 n=10 n=10 n=9 n=9 n=9 n=9 n=9 n=9 n=9 n=9 n=9 n=9 n=9 n=7 n=6 n=6 n=5 n=4 n= Aug 10 October 10 December 10 February 11 Apr 11 June 11 20

21 % relative abundance % relative abundance Relative Häufigkeit von bakteriellen Familien LRTI Husten Streptococcus Moraxella Staphylococcus Corynebacterium Haemophilus influenzae Chryseobacterium Pseudomonas aeruginosa Brevundimonas Methylobacterium Streptococcus Moraxella 20 Staphylococcus 0 Corynebacterium Haemophilus influenzae 21

22 Prävalenz von Bakterienfamilien 22

23 NMDS Principal component Analyse (PCA): AOM versus gesunden Babys p<0.005 AOM Controls NMDS1 Hilty et al., JID,

24 Klinische Relevanz? Infektion auf Grund Abnormale flora eines Erregers Ziel der Behandlung - Auslöschung des - Wiederherstellung infektiösen Erreger der normalen flora Frage an die Diagnostik - Gibt es eine - Ist die flora Infektion? abnormal? - Quantität des - Veränderung in der Erregers?? Quantität aller Bakterien? Labormethoden - Spezifische Kultur oder - 16S Sequenzierung PCR - 16S Q-PCR - Quantifizierung durch Zählung von Bakterien => Was ist normal?

25 Zusammenfassung Teil 1: Definition eines Profils der bakteriellen Besiedelung in der Lunge ist möglich. Profil gemäss dem Phänotyp der Krankheit (z.b. Asthma) Teil 2: In 10 Kindern der BILD Kohorte, die bakterielle Diversität im ersten Lebensjahr nimmt ab Die Quantität der bakteriellen flora hängt von der Saison ab Rolle der Microbiota in CF? 25

26 Acknowledgments William O Cookson, Miriam F Moffatt und Gruppe Molecular Genetics Silvio Brugger, Philipp Agyeman, Suzanne Aebi und Gruppe ifik Kathrin Mühlemann Nicolas Regamey, Carmen Casaulta, Philipp Latzin und Gruppe pädiatrische Pneumologie 26