Biochemisches Praktikum Nukleinsäuren Teil 2

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1 Biochemisches Praktikum Nukleinsäuren Teil 2 Dr. Gernot Posselt Isolierung von RNA Agarose-Gelelektrophorese

2 RNA: Der instabile Bruder der DNA Unterschiedliche Typen der RNA: mrna (messenger RNA, Proteincodierende RNA) nur ca. 3% der Gesamt RNA non-coding RNAs trna (transfer RNA, < 100 nt) rrna (ribosomale RNA; 5S, 5.8S, 18S, 28S in Eukarioten) mirna (micro RNA) snrna (small nuclear RNA). 2

3 Die Unterschiede zwischen DNA und RNA I Die Struktur: RNA DNA RNA ist einzelsträngig, bildet aber z.t. komplexe Sekundärstrukturen: mirna trna rrna 3

4 Die Unterschiede zwischen DNA und RNA II Die Basen: DNA RNA Der Zucker: DNA Desoxyribonukleotid: Desoxy-thymidinmonophosphat RNA Ribonukleotid: Uridinmonophosphat 4

5 RNA Stabilität I Alkalische Hydrolyse Cyclic 2,3 phosphodiester intermediate Source: CliffsNotes.com. RNA Information. 28 Oct

6 RNA Stabilität II RNA Degradation durch RNasen RNasen sind überall in Zellen und Gewebe in vielen Standardreagenzien im Labor auf unserer Haut, in Schweiß RNasen sind sehr stabil und benötigen keine Co-Faktoren funktionieren unabhängig von Mg ++ - EDTA ist wirkungslos extrem hitzestabil - werden durch Autoklavieren nicht inaktiviert 6

7 RNA Stabilität III Vorsichtsmaßnahmen für Arbeiten mit RNA RNasen müssen inaktiviert werden Denaturierung mit chaotropen Agens / Phenolextraktion Wasser für RNA Arbeiten mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) aufbereiten kommerziell erhältliche RNase Inhibitoren (RNasin, RNase Inhibitor) niedrige Temperatur (Arbeiten auf Eis, rasches Arbeiten) Möglichst RNase-freie Arbeitsumgebung schaffen Einweghandschuhe, Filter-tips, RNase-freie Chemikalien und Puffer Reinigung der Arbeitsfläche (EtOH, RNase away NaOH) sofern möglich: eigener RNA Arbeitsplatz, RNA Pipetten 7

8 Methoden zur Isolierung von RNA aus Zellen und Gewebe: Saure Phenolextraktion nach Chomczynski and Sacchi: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Chemistry 1987 Nonidet P40 Lyse / GITC Phenolextraktion Säulchen basierte RNA Isolation (z.b. RNeasy-Kit Qiagen) 8

9 RNA Isolierung mit Trizol I Trizol ist ein kommerzielles Reagens (Invitrogen) und basiert auf dem ursprünglichen Protokoll von Chomczynki: Enthält: chaotropes Agens GITC und Phenol. Direkte Lyse von Zellen und Gewebe (Ultra-Turrrax) Durch Chloroform wird die Phasentrennung induziert Da in Trizol saures Phenol Verwendung findet, geht DNA in die organische Phase. Die wäßrige Phase enthält ausschließlich RNA. Wäßrige Phase: RNA Organische Phase: DNA Proteine 9

10 RNA Isolierung mit Trizol II Die RNA kann einfach aus dem wäßrigen Überstand gefällt werden Aus der organischen Phase können nach Bedarf auch Protein und DNA aus der selben Probe isoliert werden. TRIzol user manual (Invitrogen) 10

11 Säulchen basierte RNA Isolation (am Beispiel vom RNeasy-Kit Qiagen) Der Rneasy Kit folgt dem Grundprinzip aller Silica-Säulchen basierten Nukleinsäure Reinigungskits. Lyse der Zellen in GITC Puffer Binden der RNA mittels EtOH Waschen mit Hochsalz-Puffern Entsalzen mit EtOH Puffern Eluieren der RNA von der Säule (H 2 O, TE) Zusätzlich kann sehr einfach ein DNase Verdau auf dem Säulchen inkludiert werden. Vorsicht! Säulchen binden keine RNA < 200 nt Qiagen RNeasy Handbook 11

12 Sicherheitshinweise: Arbeiten mit Phenol Phenol wirkt stark toxisch, sowohl lokal als auch systemisch. Schädigt bei Kontakt die Haut, Augenkontakt führt zur Eintrübung der Hornhaut. Systemische Aufnahme schädigt die Nieren, die Leber und kann das Erbgut verändern. (Wird auch über die Haut resorbiert) Inhalation führt zu Übelkeit, Kopfschmerz und Schwindelgefühl, Bei häufiger Exposition zu Schädigungen an Nieren, Leber und ZNS Sicherheitsmaßnahmen für die Arbeit mit Phenol: Schutzkleidung: Labormantel, Handschuhe, Schutzbrillen Nur im Abzug pipettieren!!! Ausschließlich SCHRAUBEPPIS verwenden!!! Abfälle (flüssig wie fest) müssen gesammelt und gesondert entsorgt werden (Eppis, Pipettenspitzen, Phenolreste) 12

13 Elektrophorese: Die Auftrennung von Molekülen im elektrischen Feld Kriterien für die Trennung sind: - Ladung - Größe - Konformation - (Matrixinteraktionen) Nukleinsäuren haben bei neutralem ph eine homogen negative Ladung. Das verbleibende Kriterium für lineare DNA ist die Fragmentlänge. Da RNA Sekundärstrukturen ausbildet, kann unter nicht-denaturierenden Bedingungen keine direkte Größenkorrelation hergestellt werden. RNA kann mit Formamid oder Formaldehyd denaturiert werden. 13

14 Agarose Gelelektrophorese I Agarose ist ein Polysaccharid und wird aus der Zellwand von Rotalgen gewonnen. Die durchschnittliche Molekülmasse der linearen Ketten beträgt ca ( n= +/- 400 ) source: Durch Erhitzen und Abkühlen bilden die linearen Agaroseketten Helices aus, die sich wiederum zu Suprafasern polymerisieren. Das resultierende 3-dimensionale Netzwerk hat eine durchschnittliche Porengröße von ca nm. 14

15 Elektroendosmose: (EEO) Elektroendosmose (oder: Elektroosmotischer Fluß EOF) ist ein Problem bei qualitativ minderwertigen Agarosen. Durch Sulfat- und Carboxylgruppen in der Agarosematrix sind (bei neutralem ph) Anionen in der Matrix immobilisiert. Die Gegenionen sind jedoch weiter mobil und führen zu einem Fluß des Puffers in Richtung der Kathode. Dieser Effekt tritt vorwiegend in Kapillaren und engmaschigen Siebmatrizes auf. Kathode Anode Der EOF wirkt in entgegengesetzter Richtung zur Wanderungsrichtung der DNA und verschlechtert die Trennleistung und Trennschärfe des Gels. 15

16 Agarose Gelelektrophorese II Die Elektrophoresekammer: source: Die Probe wird mit sample loading buffer * vermischt und in die Geltaschen pipettiert. ( * enthält Glycerin und Farbstoffe) Als Puffer kommt ein Tris-Acetat-EDTA Puffer zum Einsatz. Alternative Puffer System: TBE source: biotrek.rdrake.org 16

17 Agarose Gelelektrophorese III Visualisierung der DNA-Banden mit interkalierenden Farbstoffen im UV-Licht. sources: chemgapedia.de / wikipedia.org 17

18 Agarose Gelelektrophorese III Bestimmung der Größe und der Menge von DNA im Agarosegel 2006, Mühlhardt, Molekularbiologie Datasheet, Fermentas 18

19 Elektrophorese Die Agarosekonzentration bestimmt die Trennleistung in unterschiedlichen Größenbereichen Agarosekonzentration: Optimale Trenneffizienz Agarosekonzentration (in % w/v) Bromphenolblau Xylencyanolblau 1 kb 30 kb 0.6 % 1000 bp 10 kb 800 bp 12 kb 0.7 % 700 bp 6 kb 500 bp 7 kb 1.0 % 300 bp 3 kb 400 bp 6 kb 1.2 % 200 bp 1.5 kb 200 bp 3 kb 1.5 % 120 bp 1 kb 100 bp 2 kb 2.0 % < 100 bp 800 bp 1000bp 1000bp source: 19

20 Bsp. I Aufreiningung der DNA aus dem Nukleosomenleiter-Beispiel (15) Die Aliquots werden in einem zweiteiligen Arbeitsgang extrahiert: (aus Sicherheitsgründen ist die PCI / CI Extratkton ausschließlich in Schraubeppis durchzuführen!!!) (a) Zugabe von 200μl PCI (Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-25:24:1) Vortexen und kurzes Zentrifugieren ( 1min bei ca rpm ) Überstand abpipettieren, ohne ihn mit der unteren organischen Phase zu kontaminieren. Üst in vorher beschriftetes (!) 1.5ml Schraubverschluß-Eppendorf Reaktionsgefäß transferieren. (b) Zugabe von 200μl CI ( Chloroform:Isoamylalkohol- 24:1 ) Vortexen und Trennen der Phasen durch Zentrifugation wie bei Schritt (a). Transferieren des Überstandes in ein neues Eppendorf - Reaktionsgefäß. Für die nachfolgende Ethanolfällung ist es erforderlich das jeweilige Volumen der Überstände zu ermitteln. 16) (a) Zugabe von 3 M NaAcetat, uzw. 1/10 Volumenanteil des jeweiligen ermittelten Üst- Volumens. (b) Zugabe von 1µl (5mg/ml) linearem Polyacrylamid (LPA) 20

21 Bsp. I Aufreiningung der DNA aus dem Nukleosomenleiter-Beispiel (17) EtOH-Fällung: Zugabe von doppeltem Volumen eisgekühlten Ethanols, bezogen auf das Gesamtvolumen (CI-Überstand + Acetat-Lösung). Kurzes Vortexen. Dicht verschraubtes Reaktionsgefäß etwa ½ Stunde in Eiswasser lagern. Reaktionsgefäße 10 min bei maximaler Umdrehzahl zentrifugieren. (18) Überstand möglichst vollständig abheben und verwerfen. EtOH-Pellet ca. 20 min Lufttrocknen dann in 50μl Wasser lösen. (20) 10μl des gelösten Pellets werden entsprechend mit 6x Probenpuffer versetzt und mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Gelkonzentration 1.8% (w/v) (21) Die Sichtbarmachung der DNA-Banden erfolgt mittels Ethidiumbromid-Fluoreszenz, die Auswertung der Gele mit Hilfe eines Videokamera-Systems. 21

22 Bsp. II Isolierung von RNA aus Milzzellen. Vor Beginn: Vorbereiten des Arbeitsplatzes (1) Klären der Trizolproben, Zentrifugation für 10 Minuten bei max. RPM Über führen des Überstands in Schraubeppis! (2) Zugabe von 100µl Chloroform CHCl 3 ) pro 500µl Trizol (3) Mischen der Proben am Vortex für ca. 10 sec. Danach 15 Minuten bei max. RPM Zentrifugieren (4) Abheben der wäßrigen Phase (ca. 200µl) (5) Fällen der RNA durch Zugabe von 250µ Isopropanol für 10 Minuten bei Raumtemperatur 10 Minuten bei max. RPM zentrifugieren. 22

23 Bsp. II Isolierung von RNA aus Milzzellen. (6) Abheben des Überstands. Waschen der Pellets in 180µl Ethanol (70%) 5 Minuten bei max. RPM zentrifugieren. (7) Abheben des Überstands (quantitativ) und Trocknen des RNA Pellets (8) Lösen des RNA Pellets in 100µl RNase-freiem Wasser (9) 10μl des gelösten Pellets werden entsprechend mit 6x Probenpuffer versetzt und mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Gelkonzentration 1% (w/v) (10) Die Sichtbarmachung der RNA-Banden erfolgt mittels Ethidiumbromid-Fluoreszenz, die Auswertung der Gele mit Hilfe eines Videokamera-Systems. 23