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1 Arbeitsanleitung Histamine ELISA Enzymimmunoassay für die quantitative in-vitro-bestimmung von Histamin in humanem Plasma, Urin und EDTA Vollblut. Der Test kann außerdem für Forschungszwecke in Zellkulturüberständen eingesetzt werden. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. ZWECKBESTIMMUNG Enzymimmunoassay für die quantitative in-vitro-bestimmung von Histamin in humanem Plasma, Urin und EDTA Vollblut. Der Test kann außerdem für Forschungszwecke in Zellkulturüberständen eingesetzt werden. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Histamin (ß-Imidazolethylamin) ist beim Menschen der wichtigste Mediatorstoff und tritt vor allem in der Initialphase der anaphylaktischen Reaktion (Allergie des Soforttyps) in Erscheinung. Histamin entsteht durch die enzymatische Decarboxylierung des Histidins. Im Organismus ist Histamin in fast allen Geweben vorhanden. Hauptsächlich ist es in den metachromatischen Granula der Mastzellen und den basophilen Leukozyten gespeichert. Es liegt in einer inaktiven, gebundenen Form vor und wird erst bei Bedarf freigesetzt. Wie verschiedene andere Mediatoren vermittelt auch Histamin nicht nur verschiedene klinische Symptome der Anaphylaxie, sondern es löst auch eine Reihe von Effekten aus, die auf eine Beendigung der anaphylaktischen Reaktion hinauslaufen. Die biologischen Wirkungen des Histamins im Gewebe werden durch drei verschiedene Oberflächenrezeptoren, die H1-, H2- und H3-Rezeptoren, gewährleistet. Das klinische Interesse an der Histamin-Bestimmung liegt einmal in der Quantifizierung der Histaminfreisetzung aus basophilen Leukozyten bei Allergien des Soforttyps sowie der Histaminmenge, die in den verschiedenen Körperflüssigkeiten vorhanden ist (Plasma, Urin, Zellkulturüberstände), nachdem eine Allergenzufuhr stattgefunden hat. Zu dem vorliegenden Histamin-ELISA bietet IBL zusätzlich benötigte Reagenzien zur Durchführung eines Histamin-Releasetests in heparinisiertem Vollblut an (REF RE95000). 3. TESTPRINZIP Kompetitiver Enzymimmunoassay (ELISA). Die unbekannte Menge an Antigen in der Probe und eine bekannte Menge an enzymmarkiertem Antigen (E-Ag) konkurrieren um die Bindungsstellen des an die Wells der Mikrotiterstreifen gebundenen Antikörpers. Nach der Inkubation wird nicht gebundenes E-Ag durch Waschen entfernt. Die Intensität der gebildeten Farbe nach der Substratreaktion ist umgekehrt proportional zur Antigen-Konzentration in den Proben. Die Ergebnisse der Proben können direkt anhand der Standardkurve bestimmt werden. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum In-vitro-Gebrauch. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Chargen-Nummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal- Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 6. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 7. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 8. Das Reinigungspersonal ist durch das Fachpersonal bezüglich möglicher Gefahren und Umgang anzuleiten. 9. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. Version / 9

3 10. Einige Reagenzien enthalten Natriumazid (NaN 3 ) als Konservierungsmittel. Bei Kontakt mit den Augen oder der Haut gründlich mit Wasser abspülen. NaN 3 kann mit Blei und Kupfer explosive Azide bilden. Bei Entsorgung über das Abwasser gut spülen, um Azidanreicherung zu vermeiden. 11. Alle Reagenzien dieses Kits, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf anti-hcv, HBsAg bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 2-8 C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. Die Mikrotiterplatte ist auch nach dem Öffnen der Verpackung bis zum Verfallsdatum des Kits haltbar, wenn der Beutel sorgfältig wieder verschlossen und bei 2-8 C gelagert wird. 6. PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG Plasma (EDTA, Heparin) Die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Blutabnahme sind einzuhalten. Die chemische Integrität der Blutproben muss vom Zeitpunkt der Blutabnahme bis zur Testdurchführung erhalten bleiben. Keine hämolytischen, ikterischen oder lipämischen Proben verwenden. Getrübte Proben sollten vor der Testdurchführung zentrifugiert werden, um Partikel zu entfernen. Lagerung: 2-8 C -20 C (aliquotiert) -70 C (aliquotiert) Haltbarkeit: 5 h 3 Monate 2 Jahre Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. Zum Versand müssen die Proben eingefroren werden. Urin Spontanurin oder 24 h-sammelurin können verwendet werden. Das Gesamtvolumen über 24 h sollte in einer Flasche unter Vorlage von ml 6 N HCl als Konservierungsmittel gesammelt und gemischt werden. Gesamtvolumen bestimmen zur späteren Auswertung des Tests. Proben vor Gebrauch mischen und zentrifugieren. spontan angesäuert Lagerung: 2-8 C 2-8 C -20 C (aliquotiert) Haltbarkeit: 8 h 3 Tage 6 Monate Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. Zum Versand müssen die Proben eingefroren werden. Zellkulturüberstände Zellkulturüberstände können ohne spezielle Vorbehandlung benutzt werden. Achtung: Zellkultur-Medien können Histamin in höheren Konzentrationen enthalten. Vollblut Gesamt Histamin aus EDTA-Vollblut. Zusätzlich benötigte Reagenzien können bei IBL separat bestellt werden unter: Hypotonisches Medium REF: KSHI771, Freisetzungspuffer REF: KSHI751 Histaminfreisetzung (Histamin-Release) aus heparinisiertem Vollblut nur für Forschungszwecke. Weitere Informationen siehe Arbeitsanleitung für den Histamin Release (REF RE95000). Version / 9

4 7. KOMPONENTEN DES KITS Die Reagenzien dieses Kits reichen aus für bis zu 96 Einzelbestimmungen oder 48 Duplikate in Plasma und Urin. Anzahl / Menge Symbol Komponente 1 x 12x8 MTP Mikrotiterplatte Wells einzeln abbrechbar. Beschichtet mit anti-kaninchen Antiserum (Ziege). 1 x 7 ml ANTISERUM Histamin Antiserum Blau gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält: Antiserum (Kaninchen), Trispuffer, 0.01 % Thimerosal. 1 x 100 µl ENZCONJ CONC Enzymkonjugat Konzentrat (200x) Enthält: Histamin, konjugiert mit Peroxidase. 7 x 1.0 ml CAL P A-G Plasma Standards A-G 0.0, 0.35; 1.1; 4.0; 14; 50;150 ng/ml Gebrauchsfertig. Zur Kalibrierung der Plasmaproben. Standard A = Diluent für Plasmaproben. Enthält: Histamin, humanes Plasma. 2 x 1.0 ml CONTROL P 1+2 Plasma Kontrollen 1+2 Gebrauchsfertig. Enthält: Histamin, humanes Plasma. Konzentrationen / Akzeptanzbereiche siehe QC-Zertifikat. 1 x 2.0 ml CAL U/C A Urin/Zellkultur Standards A 0 ng/ml Gebrauchsfertig. Zur Kalibrierung der Urin- und Zellkulturproben. Standard Enthält: 0.1 M HCl. 5 x 0.25 ml CAL U/C B-F Urin/Zellkultur Standards B-F 2.7; 8.1; 24.3; 73; 219 ng/ml Gebrauchsfertig. Zur Kalibrierung der Urin- und Zellkulturproben. Standard Enthält: Histamin, 0.1 M HCl. 2 x 0.25 ml CONTROL U/C 1+2 Urin/Zellkultur Kontrollen 1+2 Gebrauchsfertig. Enthält: Histamin, Humanurin (angesäuert). Konzentrationen / Akzeptanzbereiche siehe QC-Zertifikat. 1 x 2.25 ml ACYLREAG Acylierungsreagenz Gebrauchsfertig. Enthält: DMF. 1 x 60 ml ASSAYBUF CONC Assaypuffer Konzentrat (5x) Enthält: Trispuffer, Tween, BSA, 0.05 % Thimerosal. 1 x 50 ml WASHBUF CONC Waschpuffer Konzentrat (20x) Enthält: Phosphatpuffer, Tween, 0.1 % Thimerosal. 1 x 11 ml INDICATORBUF Indikatorpuffer Rosa gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält: Trispuffer, Phenolrot (Farbumschlag bei ph < 7.5), 0.01 % Thimerosal. 1 x 15 ml TMB SUBS TMB Substratlösung Gebrauchsfertig. Enthält: TMB, Puffer, Stabilisatoren. 1 x 15 ml TMB STOP TMB Stopplösung Gebrauchsfertig. 1 M H 2SO 4. 3 x FOIL Haftklebefolie 8. ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. Pipetten (Multipette Eppendorf oder vergleichbare Produkte, < 3 % VK). Volumina: 10; 20; 50; 100; 1000 µl 2. Einmal-Polypropylenröhrchen, Einmal-Glasröhrchen, (12 x 75 mm) oder 96- deep well Acylierungsplatte (kann bei IBL separat bestellt werden unter: REF ACYLPLATE: KEHP711) 3. Reagenzglasgestell 4. Orbitalschüttler (500 rpm) 5. Vortex-Mischer 6. 8-Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 7. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 8. Messgerät für Mikrotiterplatten zur Messung der Absorption bei 450 nm (Referenzwellenlänge nm) 9. Bidest. oder deionisiertes Wasser 10. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr Version / 9

5 9. HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue Einmal- Pipettenspitzen für jede zu pipettierende Komponente und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. 4. Enthalten Komponenten 250 µl Flüssigkeit, sollte sich vor dem Öffnen der gesamte Inhalt auf dem Boden des entsprechenden Fläschchens befinden. 5. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen, um eventuelle Pipettierfehler zu erkennen. 6. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. 7. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-Kanal- Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 8. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 9. Feuchtigkeit beeinflusst die beschichteten Wells/Röhrchen. Verpackung nicht öffnen bevor Raumtemperatur erreicht ist. Nicht benötigte Wells/Röhrchen sofort in den wieder verschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben. 10. TESTVORBEREITUNGEN Der Inhalt des Kits für 96 Bestimmungen kann in 3 Läufe aufgeteilt werden. Die unten angegebenen Volumina sind für einen Lauf mit 4 Streifen (32 Bestimmungen) Vorbereitung lyophilisierter oder konzentrierter Komponenten Verd. / Komponente rekonst. Diluent Verhältnis Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit 20 ml ad bidest. ASSAYBUF 100 ml Wasser 1:5 2-8 C 2 Wochen 15 ml WASHBUF ad bidest. Kristalle bei 1: ml Wasser C lösen. 2-8 C 4 Wochen 10 µl(*) ENZCONJ mit verdünnter Frisch herstellen und 1:200 2 ml Assaypuffer nur einmal verwenden C 30 min (*) Vor dem Verdünnen sicherstellen, dass keine Flüssigkeit im Stopfen verbleibt Probenverdünnung Proben mit einer erwarteten Konzentration über dem höchsten Standard müssen vor der Acylierung mit dem entsprechenden Medien verdünnt werden: Urin: 0.1 M HCl. Plasma: zusätzlich erhältlicher Probendiluent (REF: KEHP771). Version / 9

6 10.3. Acylierung der Proben Zur Abarbeitung größerer Probenanzahlen empfiehlt sich, optional die Acylierung in der 96- deep well Acylierungsplatte durchzuführen. (kann bei IBL separat bestellt werden unter: REF ACYLPLATE KEHP711) Es ist nicht möglich, acylierte Urin- oder Zellkulturproben mit der Plasma-Standardkurve oder acylierte Plasmaproben mit der U/C-Standardkurve zu bestimmen. Hinweis: Die acylierten Proben können über Nacht bei 2-8 C oder besser bei 20 C für bis zu 2 d aufbewahrt werden Acylierung in Einmal-Röhrchen. Das folgende Verfahren muss je nach Probenart in zwei Varianten durchgeführt werden: Plasma 1. Je 100 µl der Plasma Standards, Plasma Kontrollen und Patienten-Plasmaproben in die entsprechenden Röhrchen pipettieren. 2. Je 100 µl Indikatorpuffer in jedes Röhrchen pipettieren. Vortexen. 3. Je 20 µl Acylierungsreagenz in jedes Röhrchen pipettieren. Jedes Röhrchen sofort nach dem Pipettieren vortexen. 4. Röhrchen abdecken. 30 min bei RT (18-25 C) inkubieren. 5. Je 750 µl verdünnten Assaypuffer in jedes Röhrchen pipettieren. Vortexen. Urin, Zellkulturüberstände 1. Je 50 µl der Urin/Zellkultur Standards, Urin/Zellkultur Kontrollen und Patienten-Urin- /Zellkulturproben in die entsprechenden Röhrchen pipettieren. 2. Je 50 µl Indikatorpuffer in jedes Röhrchen pipettieren. Vortexen. Wenn der Indikator farblos wird, ist der ph der Lösung zu niedrig und die Probe enthält zuviel Säure. In diesem Fall weitere 50 µl Indikatorpuffer zugeben bis die Lösung rötlich bleibt. 3. Je 10 µl Acylierungsreagenz in jedes Röhrchen pipettieren. Jedes Röhrchen sofort nach dem Pipettieren vortexen. 4. Röhrchen abdecken. 30 min bei RT (18-25 C) inkubieren. 5. Je 2000 µl verdünnten Assaypuffer in jedes Röhrchen pipettieren. Gründlich vortexen. Vollblut (Gesamt-Histamin) 1. Je 50 µl von jeder EDTA Vollblut-Probe in Glasröhrchen pipettieren. 2. Je 950 µl Hypotonisches Medium in jedes Röhrchen pipettieren min bei 37 C in einem Wasserbad inkubieren. Die Überstände der entsprechenden Proben können bei 2-8 C für einen Tag gelagert werden. Bei längerer Lagerung bis zu einer Woche bei 20 C einfrieren. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. 4. Vortexen. 100 µl für den Acylierungsschritt des Histamin ELISA entnehmen und in die entsprechenden Glasröhrchen pipettieren. 5. Je 50 µl der Plasma Standards mit 50 µl Freisetzungspuffer, in die entsprechenden Glasröhrchen pipettieren. 6. Je 50 µl der Plasma Kontrollen mit 50 µl Freisetzungspuffer, in die entsprechenden Glasröhrchen pipettieren 7. Je 100 µl Indikatorpuffer in jedes Röhrchen pipettieren. Vortexen. 8. Je 20 µl Acylierungsreagenz in jedes Röhrchen pipettieren. Jedes Röhrchen sofort nach dem Pipettieren vortexen. 9. Röhrchen abdecken. 30 min bei RT (18-25 C) inkubieren. 10. Je 750 µl verdünnten Assaypuffer in jedes Röhrchen pipettieren. Vortexen. Version / 9

7 Alternative Version mit Acylierung in 96-deep well Acylierungsplatte. Die 96-deep well Acylierungsplatte kann nur einmal verwendet werden! Das folgende Verfahren muss je nach Probenart in zwei Varianten durchgeführt werden: Plasma 1. Je 100 µl der Plasma Standards, Plasma Kontrollen und Patienten-Plasmaproben in die entsprechenden Wells der 96- deep well Acylierungsplatte pipettieren. 2. Je 100 µl Indikatorpuffer in jedes Well pipettieren. Platte kurz schütteln. 3. Je 20 µl Acylierungsreagenz in jedes Well pipettieren. Platte kurz schütteln. 4. Platte mit Haftklebefolie abdecken.. 30 min bei RT (18-25 C) inkubieren. 5. Je 750 µl verdünnten Assaypuffer in jedes Well pipettieren. 6. Acylierte Standards, Kontrollen und Proben mit einer 8-Kanal Mikropipette durchmischen und in die Mikrotiterplatte überführen (siehe TESTDURCHFÜHRUNG). Urin, Zellkulturüberstände 1. Je 50 µl der Urin/Zellkultur Standards, Urin/Zellkultur Kontrollen und Patienten-Urin- /Zellkulturproben in die entsprechenden Wells der 96- deep well Acylierungsplatte pipettieren.. 2. Je 50 µl Indikatorpuffer in jedes Well pipettieren. Platte kurz schütteln.. Wenn der Indikator farblos wird, ist der ph der Lösung zu niedrig und die Probe enthält zuviel Säure. In diesem Fall weitere 50 µl Indikatorpuffer zugeben bis die Lösung rötlich bleibt. 3. Je 10 µl Acylierungsreagenz in jedes Well pipettieren. Platte kurz schütteln. 4. Platte mit Haftklebefolie abdecken.. 30 min bei RT (18-25 C) inkubieren. 5. Je 2000 µl verdünnten Assaypuffer in jedes Well pipettieren. 6. Acylierte Standards, Kontrollen und Proben mit einer 8-Kanal Mikropipette durchmischen und in die Mikrotiterplatte überführen (siehe TESTDURCHFÜHRUNG). 11. TESTDURCHFÜHRUNG 1. Je 50 µl der acylierten Standards, acylierten Kontrollen und acylierten Patientenproben in die entsprechenden Wells der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Je 50 µl frisch hergestelltes Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren. 3. Je 50 µl Histamin Antiserum in jedes Well pipettieren. 4. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 3 h bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler (500 U/min) inkubieren. 5. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 4 x mit je 250 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 6. Substrat- und Stopplösung möglichst mit einer 8-Kanal-Pipette pipettieren und Substrat- und Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugeben. Mit positivem Vorhub pipettieren, um die Bildung von Luftbläschen zu vermeiden. 7. Je 100 µl TMB Substratlösung in jedes Well pipettieren. 8. Plasma: 40 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler (500 U/min) inkubieren. Urin/ Zellkulturüberstände: 20 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler (500 U/min) inkubieren. 9. Die Substratreaktion durch Zugabe von 100 µl TMB Stopplösung in jedes Well stoppen. Platte kurz schütteln. 10. Die optische Dichte mit einem Photometer bei 450 nm (Referenzwellenlänge: nm) innerhalb von 15 min nach dem Pipettieren der Stopplösung messen. Version / 9

8 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP-Regeln (Good Laboratory Practice) oder vergleichbare Normen/Gesetze beachten. Anwender und/oder Labor müssen zur Diagnosestellung ein gemäß GLP validiertes System verwenden. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten und dem QC-Zertifikat angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Es wird empfohlen, an den einschlägigen Ringversuchen teilzunehmen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Die erhaltenen OD der Standards (y-achse, linear) gegen deren Konzentration (x-achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode, 4-Parameter-Analyse (linlog) oder Logit-Log-Berechnung empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden (bei Doppelwerten kann ein offensichtlicher Ausreißerwert eliminiert und stattdessen der plausiblere Einzelwert verwendet werden). Die Konzentrationen der Proben können direkt von der Standardkurve abgelesen werden. Die Werte von verdünnten Proben müssen mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, müssen wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben verdünnt und erneut analysiert werden. Für jede Urinprobe die 24 h-exkretion berechnen: µg/24 h = µg/l x L/24 h Umrechnung: Histamin (ng/ml) x = nmol/l Typische Standardkurve Plasma (Beispiel. Nicht zur Testauswertung verwenden!) Standard Histamin (ng/ml) OD Mittelwert OD/OD max (%) A B C D E F G Typische Standardkurve Urin (Beispiel. Nicht zur Testauswertung verwenden!) Standard Histamin (ng/ml) OD Mittelwert OD/OD max (%) A B C D E F (OD) (OD) Histamine ELISA (plasma) (ng/ml) Histamine ELISA (urine) (ng/l) Version / 9

9 14. NORMWERTE Therapeutische Konsequenzen sollten nicht allein aufgrund der mit diesem Test ermittelten Werte getroffen werden, sondern nur unter Berücksichtigung aller klinischen Beobachtungen und weiterer diagnostischer Mittel. Augenscheinlich gesunde Spender zeigten die folgenden Normwerte: (95 % Perzentile) Plasma ng/ml Jedes Labor sollte unter 5 56 µg/d (24 h) Berücksichtigung regionaler Urin 8 53 µg/g Kreatinin (spontan) Gegebenheiten eigene Vollblut < 60 ng/ml Normalwertbereiche erstellen. 15. GRENZEN DES VERFAHRENS Die korrekte Durchführung der Probengewinnung und Aufbewahrung ist entscheidend für die Testergebnisse. Näheres siehe PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG. Angaben zu Kreuzreaktivitäten sind im Kapitel TESTCHARAKTERISTIKA zu finden. Die folgenden Blutbestandteile haben bis zu der angegebenen Konzentration keinen signifikanten Einfluss auf die Testergebnisse (+/- 20%): Hämoglobin 5 mg/ml Bilirubin 1 mg/ml Triglyceride 30 mg/ml 16. TESTCHARAKTERISTIKA Substanz Kreuzreaktivität (%) Analytische Spezifität Kreuzreaktivität aller anderen N-Acetyl-Histamin 0.34 (Kreuzreaktivität) getesteten Substanzen < % 3-Methyl-Histamin 0.09 Analytische Sensitivität Plasma 0.02 ng/ml (Nachweisgrenze) Urin 1.3 ng/ml Mittleres Signal (Nullstandard) - 2SD Präzision Bereich (ng/ml) VK (%) Plasma Intra-Assay Urin Plasma Inter-Assay Urin Bereich (ng/ml) Höchste Verdünnungsstufe Bereich (%) Linearität Plasma : Urin : Mittelwert (%) Bereich (%) Wiederfindung Plasma % Wiederfindung nach Spiken Urin Methodenvergleich Plasma Vergleichstest A IBL-Assay = 0.95 x A r = 0.99; n = 24 Methodenvergleich Urin Vergleichstest A IBL-Assay = 0.77 x A r = 0.88; n = 26 Methodenvergleich Plasma Vergleichstest B IBL-Assay = 0.56 x B r = 0.99; n = 20 Methodenvergleich Urin Vergleichstest B IBL-Assay = 0.68 x B r = 0.99; n = 24 Version / 9

10 17. LITERATUR ÜBER DAS PRODUKT 1. Miyazaki, D. Nakamura, T. Toda, M. Ono S. et al. Macrophage inflammatory protein-1α as a costimulatory signal for mast cell-mediated immediate hypersensitivity reactions. J. Clinical Investigation Vol. 115, No 2 Feb. (2005), Address: University College London, UK. 2. Brown, Simon G A, Wiese Michael, Blackmann Konrad: Ant venom Immunotherapy: a double-blind, placebo-controlled, crossover trial. The Lancet, Vol 361, March (2003) Address: Royal Hobart Hospital, Tasmania, Australia 3. Matsumoto, Jun and Matsuda Hajime: Mast-cell dependent histamine release after praziquantel treatment of Schistosoma Japonicum infection: implications for chemotherapy-related adverse effects. Parasitol Res 88; (2002) Address: Dokkyo University of Medicine, Mibu, Japan 4. Matsumoto, Jun: Adverse effects of praziquantel treatment of Schistosoma japonicum infection: involvement of host anaphylactic reactions induced by parasite antigen release. International Journal for Parasitology 32, , (2002) Address: Dokkyo University of Medicine, Mibu, Japan 5. Ching-Hsiang Hsu, Kaw-Yan Chua, Mi-Hua Tao, Yih-Loong Lai, Heuy-Dong Wu, Shau-Ku Huang & Kue- Hsiung Hsieh (1996). Immunophrophylaxis of allergen- induced immunoglobulin E synthesis and airway hyperresponsiveness in vivo by genetic immunization. Nature Medicine, Volume 2, Number 5, May (1996): Address: Kue-Hsiung Hsieh, Chang Gung Children s Hospital, Taiwan, Republic of China 6. Demoly P., Lebel B., et al Predictive capacity of histamine release for the diagnosis of drug allergy. Allergy 54 (1999) Version / 9

11 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /