Userguide. Nr 039 I Detektion. Bedeutung der Hexokinase-Reaktion im Stoffwechsel. Einleitung. Martin Armbrecht, Eppendorf AG, Hamburg.

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1 Userguide Nr 039 I Detektion Enzymkinetik-Messungen mit dem Eppendorf BioSpectrometer kinetic am Beispiel einer Hexokinase und Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase aus Saccharomyces cerevisiae Martin Armbrecht, Eppendorf AG, Hamburg Abstract Im vorliegenden Userguide wird gezeigt, wie Enzymaktivitätsmessungen am Eppendorf BioSpectrometer durchgeführt werden. Um den Messablauf zu optimieren, wurden zunächst Vorabmessungen mittels der Methode single continuous durchgeführt. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden die eigentlichen Aktivitätsmessungen durchgeführt. Die Enzymaktivitäten wurden über lineare Regression bestimmt. Für die Messung wurde eine gekoppelte Reaktion aus einer Hexokinase und einer Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae verwendet. Da das Eppendorf BioSpectrometer kinetic über einen temperierbaren Küvettenschacht verfügt, konnte auch die Temperaturabhängigkeit der Reaktion demonstriert werden. Dabei wurde die höchste Aktivität bei 37 C ermittelt. Einleitung Bedeutung der Hexokinase-Reaktion im Stoffwechsel Glykolyse Ein zentraler Bereich im Stoffwechsel von fast allen Lebewesen ist der enzymatische Abbau von Glucose im Cytosol bzw. Cytoplasma in ihren Zellen. Dieser Vorgang wird Glykolyse genannt. Dabei wird Glucose schrittweise zu 2 Molekülen Pyruvat umgesetzt. Aus einem Molekül Glucose werden dabei 2 ATP und 2 Reduktionsäquivalente in Form von NADPH 2 gewonnen. Pyruvat wird in einen weiteren elementaren Stoffwechselweg, den Citrat-Zyklus, eingeschleust, wobei weitere Reduktionsäquivalente für die Atmungskette gewonnen werden, die letztendlich auf Sauerstoff übertragen werden. Als finale Abbauprodukte entstehen dadurch H 2 0 und CO 2. Aktivierung der Glucose über die Hexokinase-Reaktion Der Abbau von Glucose hält somit die Atmung von allen Lebewesen aufrecht. Bevor Glucose abgebaut wird, muss diese zunächst für den Abbau zugänglich gemacht bzw. aktiviert werden. Dieser Vorgang geschieht über eine Phosphorylierung mittels einer Hexokinase, wobei unter Verbrauch von ATP Glucose-6-Phosphat entsteht. Letzteres ist somit der eigentliche Ausgangspunkt der Glykolyse (Abb.2). Glucose-6-Phosphat ist darüber hinaus auch noch Ausgangspunkt eines weiteren wichtigen Stoffwechselweges, den sogenannten Pentose-Phosphat-Wegs, welcher dazu dient, zum einen wichtige Reduktionsäquivalente wie NADPH 2 und zum anderen verschiedene Kohlenhydratkörper für weitere Abbauwege und Biosynthesen zu Verfügung zu stellen.

2 Userguide Nr 039 Seite 2 Nachweis des enzymatischen Abbaus von Stoffwechselenzymen Durch die elementare Bedeutung dieser Stoffwechselwege und der daran beteiligten Enzyme besteht an ihnen ein großes Interesse im Bereich der biochemischen Forschung und Lehre. Ein wichtiger Aspekt ist die Bestimmung von Enzymaktivitäten, da diese ein spezifisches Merkmal von Enzymen darstellen. Die Messung der jeweiligen Enzymaktivitäten erfolgt hauptsächlich photometrisch in einem Spektrophotometer. Da an fast allen enzymatischen Umsetzungen im zentralen Stoffwechsel NADP (NAD) bzw. NADPH 2 (NADH 2 ) beteiligt sind, wird die Aktivität der Enzyme hauptsächlich über die Zu bzw. Abnahme von NADPH 2 bestimmt. Sowohl NADP als auch NADPH 2 zeigen bei 260 nm ein Absorptionsmaximum. NADPH 2 weist aber einen zusätzlichen Peak bei 340 nm auf (Abb.1), wodurch NADPH 2 von NADP photometrisch unterschieden werden kann. Extinktion NAD(P)/NAD(P)H 2 Spektrum Wellenlänge [nm] NAD(P) NAD(P)H 2 Abbildung 1: Absorptionsspektrum von NADP/ NADPH 2. Beide Komponenten können durch die Absorption von NADPH 2 bei 340 nm leicht unterschieden werden. Die Aktivitäten von NADP/ NADPH 2 -abhängigen Enzymen werden demnach über eine Absorptionsänderung bei 340 nm bestimmt. Aktivitätsmessungen eignen sich aber nicht nur für Untersuchungen von Enzymeigenschaften, sondern können auch zum Nachweis bestimmter Substrate bzw. Substratkonzentrationen dienen. Mittels der oben erwähnten Hexokinase-Reaktion kann eine Glucose- oder ATP-Konzentration nachgewiesen werden. Der Nachweis erfolgt dabei indirekt über die Bildung von NADPH 2 in einer gekoppelten Reaktion mit einer Glucose- 6-Phosphat-Dehydrogenase. Die Menge an gebildeten NADPH 2 entspricht der Menge an Glucose oder ATP (Abb.2). Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + NADP Hexokinase / Mg 2+ Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase Glucose-6-Phosphat + ADP 6-Phosphategluconate + NADPH 2 Abbildung 2: Indirekter enzymatischer Nachweis von Glucose oder ATP. Beide Substanzen können über eine gekoppelte Reaktion von Hexokinase und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase bestimmt werden (gekoppeltes Testsystem [1]). Die jeweilige Menge errechnet sich aus der Menge an gebildetem NADPH 2. Die in Abbildung 2 dargestellte Nachweisreaktion wurde in dem vorliegenden Userguide als Beispielreaktion verwendet. Dabei sollten zwei Anwendungen von enzymkinetischen Messungen am Eppendorf BioSpectrometer kinetic gezeigt werden: 1) Enzymatische Konzentrationsbestimmung von ATP Die Bestimmung der Substratkonzentration soll anhand einer Zweipunktbestimmung mittels definierten ATP-Mengen bei 37 C erfolgen. Dabei werden zwei Messungen innerhalb des linearen Bereiches der Substratumsetzung durchgeführt. Der lineare Bereich der Umsetzung muss durch Vorabmessungen festgestellt werden. 2) Bestimmung von Enzymaktivitäten Hier soll die Temperaturabhängigkeit der in Abbildung 2 gezeigten Hexokinase-Reaktion überprüft werden. Beim Eppendorf BioSpectrometer kinetic besteht die Möglichkeit, die Temperatur über einen beheizbaren Küvettenschacht zu regulieren. Dabei können Temperaturen zwischen 20 C und 42 C eingestellt werden. Da die Enzymaktivität auch von der Inkubationstemperatur abhängt, ist eine Regulierung der Messtemperatur wichtig, um die Aktivität möglichst genau bestimmen zu können. Aus dem Grund wurden die Enzymaktivitäten der Hexokinase bei 22, 30 und 37 C gemessen. Die genaue Bestimmung erfolgte über lineare Regression der Messkurve. Material BioSpectrometer kinetic, IsoPack mit IsoRack (Eppendorf) Ultramikroküvette QS (Hellma, ) ATP (Roche Applied Science, ) Hexokinase aus Saccharomyces cerevisiae (Roche Applied Science, ) Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Saccharomyces cerevisiae (Roche Applied Science, ) NADP (Sigma-Aldrich, MG) -D-Glucose (Sigma-Aldrich, G) MgCl 2 (Sigma-Aldrich, ML), Tris-Puffer ph 7,0 (AppliChem, A5247, 0500), Wasser für die Molekularbiologie (AppliChem, A7398,1000)

3 Userguide Nr 039 Seite 3 Methoden 1) Hexokinase-Aktivitätsmessung Alle Messungen wurden am Eppendorf BioSpectrometer kinetic durchgeführt. Für den Enzymtest wurden folgende Lösungen erstellt: 10 ml 0,1 M Tris-Puffer ph 7,0 1 ml 0,1 M MgCl2 1 ml 5 mm Glucose 0,5 ml 10 mm NADP+ 1 ml 1 mm ATP 1 ml Hexokinase 2 ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Die Lösungen wurden in Wasser für die Molekularbiologie erstellt und im Eppendorf IsoPack kühlgehalten bei 4 C. Tris-Puffer wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Enzyme wurden bei Nichtgebrauch sofort zurück in den Kühlschrank gebracht. Von den oben angegebenen Komponenten wurden folgende Mengen für einen Messansatz verwendet: 5 µl MgCl 2 5 µl NADP 5 µl Glucose 12,5 µl ATP 121,5 µl Tris-Puffer 0,5 µl Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase = 149,5 µl Die Lösungen wurden direkt in eine Ultramikroküvette pipettiert, welche anschließend in den Küvettenschacht des BioSpectrometer kinetic platziert wurde. Zur Adaption an die Reaktionstemperatur wurden die Messparameter so gewählt, dass eine Vorinkubation der Messlösung von mindestens 6 min durchgeführt wurde. Anschließend wurde die Messung gestartet und die Absorptionsänderung bei 340 nm verfolgt. Wenn keine Änderungen in der Absorption mehr festzustellen war, wurde die enzymatische Reaktion mittels Zugabe von 0,5 µl Hexokinase-Lösung initiiert (nach ca. 1 min). Sowohl nach Zugabe der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase als auch der Hexokinase wurde der Versuchsansatz gründlich durchmischt. Es wurden Messungen jeweils bei 22, 30 und 37 C durchgeführt. Substratbestimmung über Hexokinase-Test Für die Substratbestimmung wurden dieselben Komponenten wie beim Hexokinase-Aktivitätstest verwendet. Zur Bestimmung der unbekannten ATP-Konzentration in einer Probe wurden 1 mm und 0,1 mm ATP-Lösungen als Standards gemessen. Einstellungen am BioSpectrometer kinetic. Für Aktivitätsmessungen stehen im BioSpectrometer kinetic 3 Methoden zur Auswahl (Abb.3): a) Single -continuous (Single -cont) : Reines Messen der Absorptionsänderung bei einer definierten Wellenlänge in bestimmten Zeitabständen über einen definierten Zeitraum. Absorptionsänderung stattfindet. Temperierung optional möglich. Ist insbesondere für Vorversuche geeignet, um den Reaktionsverlauf zu überprüfen (Geschwindigkeit, Linearitätsbereich). 3A 3C 3B Abbildung 3: Möglichkeiten der Aktivitätsmessung: 3A Single - cont 3B Simple kinetics 3C Advanced kinetics

4 Userguide Nr 039 Seite 4 b) Simple kinetics Wie a), zusätzlich können Einheiten und Umrechnungsfaktoren für die direkte Umrechnung der Absorption definiert werden. Für die Aktivitätsmessung stehen Endpunkt-, Zweipunktmessung oder lineare Regression zur Verfügung. Über Delay kann ein verzögerter Messablauf programmiert werden, um bspw. eine ausreichende Anpassung des Messansatzes an die Messtemperatur zu gewährleisten. c) Advanced kinetics Wie b), nur kann zusätzlich ein Reagent Blank und eine Messung mit Standard programmiert werden. Beim Reagent Blank kann überprüft werden, ob nicht bereits vor dem Reaktionsstart eine scheinbare Absorptionsänderung stattfindet. 4 Um den Reaktionsverlauf der Hexokinase zu testen, wurde zunächst ein Testverlauf über die Methode Single cont durchgeführt. Hierfür sind die Messparameter so gewählt worden, dass die Absorptionsänderungen im Reaktionsansatz über einen möglichst langen Zeitraum gemessen wurden (10 min). Da sich bei den enzymatischen Messungen die Reaktionsgeschwindigkeit recht schnell ändern kann, wurde alle 10 sec ein Messwert aufgenommen (Abb. 4). Aufgrund der Messergebnisse aus den Vorversuchen wurden die Parameter für die Aktivitätsmessungen (Abb.5a) und die Substratbestimmung (Abb.5b und 5c) festgelegt. Wie in Abbildung 5 zu sehen, wurden unterschiedliche Methoden für die Aktivitäts- bzw. Substratkonzentrationsbestimmungen verwendet. Die Aktivität der Hexokinase wurde über lineare Regression bestimmt, wobei alle 5 sec eine Messung durchgeführt wurde. Die gesamte Messdauer betrug 6 min, wobei nach 6 min Vorlauf (Parameter Delay ) die Reaktion durch Zugabe der Hexokinase gestartet wurde. Die Versuchsparameter wurden aufgrund der Vorversuche mit Single cont (s.o.) gewählt. Für die Berechnung der Enzymaktivität bzw. Substratkonzentration wurde folgendermaßen vorgegangen: Abbildung 4: Messparameter für die Vorversuche zur Hexokinase-Messung in der Methode Single cont Direkte Berechnung der Enzymaktivität: Der in Abbildung 5A gezeigte Faktor errechnet sich aus dem molaren Absorptionskoeffizienten für NADPH 2 6,32 * 10 3 L / (mol * cm). 5A Nach dem Lambert-Beer schen Gesetz gilt: A = * c * l oder c = A / * l Dabei ist c= Konzentration, A= Absorption, = molarer Absorptionskoeffizient, l=optischer Messweg (Schichtdicke der Küvette). 5C 5B Abbildung 5: Messparameter für die Aktivitäts- und Substratkonzentrationsbestimmung: 5A Parameter zur Aktivitätsbestimmung der Hexokinase mittels linearer Regression in der Simple Kinetics Methode. 5B + 5C Parameter zur Substratkonzentrationsbestimmung in der Methode Advanced Kinetics über Zweipunktbestimmung.

5 Userguide Nr 039 Seite 5 Bei einer Küvette mit 1 cm optischem Messweg gilt: c= A/ oder c= A * 1/ bzw. c=a*f. Der Faktor F ist somit der reziproke Wert des molaren Extinktionskoeffizienten und hat die Einheit mol/l bzw. µmol/µl (für NADPH 2 1,61 * 10-4 ). Um die Enzymaktivität U/L bzw. µmol/min*l (relative Enzymaktivität bezogen auf 1 L) direkt aus der Messung der Absorption zu berechnen, muss der Faktor noch für die Einheit µmol/l von mol/l angepasst werden, d.h. mit 1*10 6 multipliziert werden. Der Faktor wäre demnach 161. In Abbildung 5A wird der Umrechnungsfaktor für die Enzymaktivität in 1 ml angegeben (U/mL) und hat somit den Wert 0,161. Aus der berechneten Steigung wird dann direkt die Enzymaktivität berechnet und nach der Messung angezeigt. Bestimmung der Substratkonzentration Bei dem Versuch zur Substratkonzentrationsbestimmung wurde nach 7 Minuten Vorlauf eine Messung durchgeführt und Hexokinase hinzugegeben. Dann wurde der Reaktionsansatz für 2 Minuten inkubiert, wobei nach der Zweipunkt- Methode jeweils am Anfang und am Ende der Inkubation eine Messung durchgeführt wird. Für die Berechnung der Probenkonzentration werden vorweg zwei Standardmessungen mit definierten Substratkonzentrationen durchgeführt. Die unbekannte Konzentration der Probe errechnet sich anhand der Standards. Durchführung einer linearen Regression am BioSpectrometer kinetic bei Aktivitätsmessungen Enzymaktivitäten werden nur im linearen Bereich von Messkurven ausgewertet, da nur hier gesichert ist, dass keine hemmenden Faktoren wie abnehmende Substratkonzentration oder Hemmung durch das Endprodukt vorliegen. Beim Eppendorf BioSpectrometer kinetic besteht die Möglichkeit, bei Aktivitätsmessungen, die mit linearer Regression evaluiert werden, nachträglich die entsprechende Ausgleichsgerade dem linearen Kurvenverlauf anzupassen. Hierfür aktiviert man nach der Messung im Bereich process results die Funktion linear regression. Der Anfangs und Endpunkt der Ausgleichsgeraden kann somit neu gesetzt werden (Abbildung 6). 6A 6B 6C 6D Abbildung 6: Durchführung der linearen Regression nach Abschluss der Messung. 6A Messergebnis einer Kinetikmessung mit linearer Regression. Die Ausgleichsgerade (rot) deckt sich nicht mit dem Kurvenverlauf. Dadurch ist das Bestimmtheitsmaß zu gering (< 0,95). Das Ergebnis wird dementsprechend rot angezeigt. Über den Softkey Next> gelangt man in den Bereich process results. Mittels der Funktion linear regression kann die Ausgleichsgerade bearbeitet werden (Softkey: lin.regr. ). 6B Anfangs- und Endpunkt der Ausgleichsgerade können mit den Softkeys First pt und Last pt neu gesetzt werden. Die Punkte werden dabei mit den Cursor-Tasten verschoben. Ist eine genügende Übereinstimmung der Ausgleichsgerade mit dem linearen Bereich der Kurve erreicht, kann das Ergebnis gespeichert werden. 6C Neues Messergebnis durch angepasste Ausgleichsgerade. Das Ergebnis ist jetzt schwarz dargestellt, d.h. die Ausgleichsgerade stimmt jetzt mit dem linearen Kurvenverlauf überein, d.h. das Bestimmtheitsmaß ist >0,95. 6D Alle wichtigen Informationen zur Ausgleichsgeraden: Bestimmtheitsmaß, Anfangs- und Endpunkt des Messergebnisses, Formel der Ausgleichsgeraden.

6 Userguide Nr 039 Seite 6 Ergebnisse Vorversuche zu den Aktivitätsmessungen - Single -cont Häufig kann man bei Enzymaktivitätsbestimmungen an einem Spektrometer nicht wissen, wie die Reaktion verlaufen wird. Insbesondere dann nicht, wenn man die Messung vorher selbst nicht durchgeführt hat oder einen Aktivitätstest für ein Enzym neu entwickelt. In letzterem Fall kennt man weder die notwendige Substrat-, Enzym- noch, falls erforderlich, die Co-Faktor- bzw. Additiv-Konzentration. Abhängig von den verwendeten Komponenten ist auch nicht bekannt, wie schnell oder langsam die enzymatische Reaktion abläuft und in welchem Bereich der Messung die Substratumsetzung linear stattfindet. Wie bereits in der Durchführung erwähnt, hat man im Eppendorf BioSpectrometer kinetic die Möglichkeit mit der Methode Single -cont in einer Vormessung den Reaktionsablauf zu testen. Minimal kann dabei alle 5 Sekunden eine Messung über einen Zeitraum von maximal 1 h durchgeführt werden. Für die Vorabmessung zur Hexokinase-Aktivität wurde über einen Zeitraum von 10 min gemessen, wobei alle 10 sec ein Messwert aufgenommen wird. Vor der Messung wurde die Probe mindestens 6 min vorinkubiert, um die Probe an die Reaktionstemperatur zu adaptieren. Die Reaktion wurde nach 1 min durch Zugabe der Hexokinase gestartet. Es sollte zum einen überprüft werden, in welchem Bereich die Messkurve linear verläuft, und zum anderen, ab welchem Zeitpunkt keine nennenswerte Substratumsetzung mehr erfolgt. Letzteres ist für den Versuch zur Substratbestimmung wichtig, da in diesem Fall nach der Endpunkt-Methode gemessen wurde. Die Vorabmessungen wurden bei 37 C durchgeführt. Das Ergebnis ist in Abbildung 7 zu sehen. Aufgrund des in Abbildung 7 dargestellten Messergebnisses wurden die Parameter für die Folgeexperimente festgelegt. Da nach ca. 6 Minuten alles Substrat umgesetzt zu sein scheint, wurden die Messungen auf diese Zeit beschränkt. Dabei wurde nach 1 min Vorlauf die Reaktion gestartet. Dies galt für die Aktivitäts- und die Substratbestimmungen. Bestimmung einer unbekannten ATP-Konzentration advanced kinetics Wie beschrieben sollte eine unbekannte ATP-Konzentration mittels Zweipunktbestimmung mit der Methode advanced kinetics durchgeführt werden. Um die Konzentration zu bestimmen, wurden zunächst zwei Standards gemessen. Hier wurden eine 1 mm und eine 0,1 mm ATP-Lösung eingesetzt. Die verwendeten Messparameter sind in Abbildung 5B und 5C gezeigt. Die Messung wurde wie bei den Vorversuchen bei 37 C durchgeführt. In Abbildung 8A ist das Ergebnis der Standardmessung dargestellt. Daraus konnte eine ATP-Konzentration von ca. 0,79 mm in der unbekannten Probe ermittelt werden, wie in Abbildung 8B gezeigt. 8A 7 8B Abbildung 7: Vorabmessung der Hexokinase mit der Methode Single -cont. Die Zunahme der Extinktion erfolgt unmittelbar nach Enzymzugabe. Über ca. 2 Minuten ist der Kurvenverlauf linear, anschließend flacht die Kurve ab. Nach 6 Minuten ist keine signifikante Absorptionszunahme mehr festzustellen. Abbildung 8: Bestimmung der ATP-Konzentration mittels Advanced kinetics -Methoden. 8A: Ergebnis der Standardmessungen. 8B: Ermittelte ATP-Konzentration in einer unbekannten Probe anhand der gemessenen ATP-Standards.

7 Userguide Nr 039 Seite 7 Bestimmung der Hexokinase-Aktivität bei verschiedenen Temperaturen simple kinetics Das Eppendorf BioSpectrometer kinetic verfügt über einen heizbaren Küvettenschacht, d.h. Kinetikmessungen können zusätzlich hinsichtlich ihrer Messtemperatur optimiert werden. Der Einfluss der Messtemperatur sollte in den vorliegenden Experimenten gezeigt werden, indem die Hexokinase-Aktivität bei 22, 30 und 37 C gemessen wurde. Die Messungen wurden entsprechend den Vorversuchen durchgeführt, d.h. es wurde für 6 Minuten vorinkubiert ( delay ) und dann alle 5 Sekunden die Absorption bei 340 nm gemessen (s. a. Abb. 5A). Die Reaktion wurde nach 1 Minute Vorlauf durch Zugabe der Hexokinase gestartet und die Absorptionsänderung für weitere 5 Minuten verfolgt. Über lineare Regression wurde, wie in Abbildung 6 gezeigt, anschließend die Ausgleichsgerade mit dem linearen Bereich der Messkurve synchronisiert. Das Ergebnis der Messungen mit unterschiedlichen Inkubationstemperaturen ist in Abbildung 9A-9C gezeigt. Wie aus Abbildung 9 ersichtlich, ergab sich bei 37 C die höchste Substratumsetzung. Hier zeigte sich eine mehr als doppelte so hohe Aktivität wie bei 22 C. Das deckt sich mit den Erwartungen, da die für diese Messungen verwendeten Enzyme zwischen 35 C und 40 C die größte Aktivität zeigen sollten (1). 9A 9B 9C 9D Abbildung 9: Messung der Hexokinase-Aktivität bei verschiedenen Temperaturen. Die Messergebnisse wurden nachträglich über Ausgleichsgeraden (rote Linie) an den linearen Bereich der Messkurve angepasst. Weitere Informationen über den gewählten Messbereich, wie z.b. dem Bestimmtheitsmaß der Ausgleichsgeraden, sind im Bereich Data hinterlegt. 9A Aktivität bei 22 C 9B Aktivität bei 30 C 9C Aktivität bei 37 C 9D Daten zum ausgewählten Messbereich am Beispiel der Messung bei 37 C. Anfangs- und Endzeitpunkt der Messung und die dazugehörigen Absorptionswerte sowie das ermittelte Bestimmtheitsmaß R 2.

8 Userguide Nr 039 Fazit Das Eppendorf BioSpectrometer kinetic eignet sich optimal sowohl für die Bestimmung von Enzym-Aktivitäten als auch zur Konzentrationsbestimmung von Substraten. Es können wichtige Messparameter wie optimale Enzym- oder Substratkonzentration, Messdauer, linearer Bereich der Messkurve oder Messtemperatur durch Vorversuche mit der Methode Single -cont überprüft werden. Solche Vorabmessungen durchzuführen ist besonders dann wichtig, wenn der Reaktionsablauf der Kinetikmessung unbekannt und/oder noch nicht optimiert ist. So lässt sich beispielsweise bei der Konzentrationsbestimmung von Molekülen über Aktivitätsmessungen schnell abschätzen, ab welchem Zeitpunkt eine komplette Substratumsetzung erfolgt ist. Darüber hinaus bietet sich die Möglichkeit zur Einstellung der Messtemperatur mit hoher Genauigkeit über den heizbaren Küvettenschacht. Eine genaue Temperierung ist Basis für eine exakte enzymatische Bestimmung. Eine weitere Besonderheit des Eppendorf BioSpectrometer kinetic ist, dass bei Enzymaktivitätsmessungen die Messkurve nachträglich durch Verschiebung des Zeitfensters für die lineare Regression bearbeitet werden kann. Durch die Kontrolle über das Bestimmtheitsmaß R2 können so Messkurven reproduzierbar ausgewertet und Enzymaktivitäten zuverlässig bestimmt werden. Durch die Auswahl zwischen 3 Messverfahren und die optionale Auswertung mit Standard oder Reagenzleerwert sind Enzym- sowie Substratbestimmungen möglich. Literatur [1] F. Lottspeich, H. Zsorbas, A. Simeon, Bioanalytik, 2. Auflage (2008) [2] Abrahão-Neto, J., Infanti, P., Vitolo, M., Hexokinase production from S. cerevisiae. Culture conditions. Appl Biochem Biotechnol Spring; 57-58: Bestellinformationen Produkt Beschreibung Bestell-Nr. Eppendorf BioSpectrometer kinetic 230 V / Hz Netzstecker Europa, weitere Netzanschlussvarianten erhältlich Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH Peter-Henlein Str Wesseling-Berzdorf Deutschland Tel: Fax: vertrieb@eppendorf.de Eppendorf Austria Ignaz Köck Straße 10/2. OG 1210 Wien Österreich Tel: Fax: +43 (0) office@eppendorf.at Vaudaux-Eppendorf AG Im Kirschgarten Schönenbuch Schweiz Tel: Fax: vaudaux@vaudaux.ch Thermodrucker DPU 414 Inkl. Netzteil und Druckerkabel 230 V Thermopapier 5 Rollen Küvettenständer Für 16 Küvetten IsoRack + IsoPack 0 C für IsoTherm-System 1 Rack und 1 Kühlakku 1,5 ml/1,7 ml/2,0 ml für 0 C eppendorf und Eppendorf BioSpectrometer sind eingetragene Marken der Eppendorf AG. Alle Rechte vorbehalten, einschliesslich der Graphiken und Abbildungen Copyright 2011 by Eppendorf AG Order-No. AU0 39PW 010/DE1/0511/5H/CR/STEF Application Support Tel: (Preis je nach Tarif im Ausland; 9 ct/min aus dem dt. Festnetz; Mobilfunkhöchstpreis 42 ct/min) support@eppendorf.com