Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus. Thermobifida fusca KW3

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1 Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus Thermobifida fusca KW3 Von der Fakultät für Maschinenbau der Technischen Universität Chemnitz Genehmigte Dissertation zu Erlangung des akademischen Grades Doktor-Ingenieur Dr.-Ing. vorgelegt von Dipl.-Ing. Susan Billig geboren am in Marienberg eingereicht am Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Zimmermann Prof. Dr.-Ing. habil. Bernd Platzer Dr. Vincent A. Nierstrasz Chemnitz, den

2 II Bibliographische Beschreibung Autor Billig, Susan Thema Abbau von Polyethylenterephthalat mit PET-Hydrolasen aus Thermobifida fusca KW3 Dissertation an der Fakultät für Maschinenbau der Technischen Universität Chemnitz, Institut für Technische Thermodynamik, Chemnitz, Seitenzahl: 200, Anzahl der Abbildungen: 91, Anzahl der Tabellen: 37, Anzahl der Literaturzitate: 203 Referat Der Actinomycet T. fusca KW3, isoliert aus Kompost, bildete während der Kultivierung im Mineralsalz-Spurenelement-Vitamin-Minimalmedium nach Zusatz von PET-Fasern eine 52 kda Carboxylesterase (TfCa), welche effizient zyklische PET Trimere (CTR) hydrolysiert. Die TfCa besitzt einen pi von 4,8, eine Substratspezifität gegenüber kurzkettigen p-nitrophenyl-estern und wird durch Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK) in der Aktivität gehemmt. Die Carboxylesterase hydrolysiert kein Cutin oder Poly-ε-caprolacton (PCL). CTR hingegen wurden durch die TfCa mit einem K m von 0,5 mm und einer V max von 9,3 µmol/min/mg bei optimalen Bedingungen (60 C, ph 6) hydrolysiert. Das aktive Zentrum der Carboxylesterase besteht aus den Aminosäuren Ser185, Glu319 und His415, wobei das Serin in das katalytische Motiv G-E-S-A- G eingebettet ist. Während der Reaktion setzte die TfCa auch Hydrolyseprodukte aus PET-Fasern und -Filmen frei. Der Nachweis der Hydrolyse erfolgte durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie der Abbauprodukte und bei den PET-Filmen zusätzlich mittels Rasterelektronenmikroskopie. Dabei zeigte die Carboxylesterase verglichen mit anderen PET-Hydrolasen eine geringere Effizienz, was durch die Lage des aktiven Zentrums in einer Bindungstasche und der daraus folgenden schlechten Zugänglichkeit für polymere Substrate begründet werden kann. Bei der Hydrolyse der viel kleineren CTR war die TfCa deutlich effektiver, was auf eine höhere Spezifität gegenüber kurzkettigen PET Substraten hinweist. Schlagworte Polyethylenterephthalat, Thermobifida fusca, Carboxylesterase, PET-Hydrolase, Hydrolyse, Actinomycet, enzymatische PET-Modifikation, enzymatischer PET-Abbau

3 III Ich weiß, dass ich nichts weiß. Sokrates ( v. Chr.) Was wir wissen, ist ein Tropfen; was wir nicht wissen, ein zean. Wenn ich fähig war, weiter zu sehen als andere, dann deshalb, weil ich auf den Schultern von Riesen stand. Isaac Newton ( ) Eigentlich weiß man nur, wenn man wenig weiß; Mit dem Wissen wächst der Zweifel. Johann Wolfgang von Goethe ( ) glücklich, wer noch hoffen kann, aus diesem Meere des Irrtums aufzutauchen! Was man nicht weiß, das eben braucht man, und was man weiß, kann man nicht brauchen. Johann Wolfgang von Goethe ( ) Der Zweifel ist der Beginn der Wissenschaft. Wer nichts anzweifelt, prüft nichts. Wer nichts prüft, entdeckt nichts. Wer nichts entdeckt, ist blind und bleibt blind. Teilhard de Chardin ( )

4 IV Danksagung Hiermit möchte ich allen Personen für Ihre Unterstützung, sowohl körperlich als auch mental, danken, die damit zur Fertigstellung der vorliegenden Dissertation beigetragen haben. Als allererstes gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. W. Zimmermann, AG Mikrobiologie und Bioverfahrenstechnik der Universität Leipzig, für die Unterstützung bei der Themenerstellung und bei der Durchführung der Studien sowie seinem beständigen Interesse an der Entwicklung der Arbeit. Die Erstellung der Dissertation fand im Rahmen eines Promotionsstipendiums der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (AZ 20004/730) statt, der ich hiermit für diese Finanzierung danken möchte. Herrn Prof. Dr.-Ing. habil. B. Platzer, Professur Technische Thermodynamik an der Technischen Universität Chemnitz, danke ich für die Übernahme der Zweitbegutachtung. Frau Dr. Claudia Birkemeyer, AG Massenspekrometrie, danke ich sehr für die Unterstützung bei den MS-Messungen, für die vielen interessanten Diskussionen und Gespräche sowie für Ihre selbstverständliche Hilfsbereitschaft bei der Lösung verschiedenster Fragen oder Probleme. Weiterhin danke ich Frau R. ehme, AG Massenspekrometrie, Frau Dr. I. Neuendorf und Herrn Dr. J. Stichel, AG Biochemie und Bioorganische Chemie, für die Unterstützung bei den durchgeführten GC/MS, Sequenzierungs- und MALDI Tof/Tof Analysen. Ebenfalls bedanke ich mich bei Frau PD Dr. M. Grunow, AG Biochemie und Molekularbiologie, für die Unterstützung bei der biochemischen Datenauswertung. Für die Durchführung eines wissenschaftlichen Auslandsaufenthalts in den Niederlanden möchte ich mich bei der CST 868 Action für die finanzielle Unterstützung bedanken. Des Weiteren gilt mein Dank Herrn Dr. V.A. Nierstrasz, Herrn Dr. Pramod B. Agrawal und Herrn Prof. Dr. M.M.C.G. Warmoeskerken für die Hilfe bei der Realisierung meiner Studien. Ein besonderer Dank geht ebenfalls an die gesamte Arbeitsgruppe Engineering of Fibrous Smart Materials der Universität Twente, die dazu beigetragen haben, dass ich mich auch weit weg wie zu Hause gefühlt habe. Ein herzlicher Dank geht an meine Kolleginnen und Kollegen der AG Mikrobiologie und Bioverfahrenstechnik: Fr. Blesz, Christina, Karen, Mohd, Nicole, Ren, René, Sandra, Simone, Susanne und Thorsten, für das beflügelnde Arbeitsklima und die ständige Unterstützung. Besonders in Erinnerung bleiben werden die gemeinsamen Feiern, Ausflüge und geselligen Beisammen sein. Besonders herzlich bedanken möchte ich mich bei Nicole, meiner Mitdoktorandin, Tischnachbarin und meinem Fels im stürmischen Laboralltag. Sie hatte immer ein offenes hr für alle Probleme und Fragen und stets einen hilfreichen Tipp. Ich danke Ihr für die tolle Zusammenarbeit, die vielen Gespräche mit oder ohne Kaffee, die gemeinsamen Tagungsbesuche und die hoffentlich noch lange weiter bestehende Freundschaft. Abschließend danke ich meiner Familie und meinen Freunden für ihre Unterstützung und Geduld mit mir und meiner, für sie meist unverständlichen, Arbeit.

5 V Inhaltsverzeichnis 1 Einführung Actinomyceten Klassifizierung Thermobifida (Thermomonospora) fusca Biopolyester Cutin und Suberin Bestandteile des Cutins Bestandteile des Suberins Struktur der Biopolymere Hydrolasen Struktur und katalytischer Mechanismus Carboxylesterasen Lipasen Cutinasen Polyethylenterephthalat Konventionelle PET-Faserbehandlung Charakterisierung von PET Biofunktionalisierung von PET PET-Hydrolasen Zielsetzung 49 2 Material und Methoden Materialien Verwendete Mikroorganismen Verwendete Enzyme Größenstandards Low Molecular Weight Marker (GE Healthcare) Roti -Mark Standard (Fa. Carl Roth GmbH) Spectra TM Multicolor Broad range Protein Ladder (Fermentas) PageRuler TM plus prestained protein ladder (Fermentas) Kalibrierungskit für pi Bestimmung (ph 3-10, GE Healthcare) Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie (LMW, GE Healthcare) Chemikalien Geräte und Materialien 55

6 VI Software Nährmedien Suberin- und Cutin-Präparationen PET-Substrate für die Abbauuntersuchungen Puffer und Lösungen Mikrobiologische Methoden Stammhaltung und Kultivierung Mikroskopische Untersuchungen Trockengewichtsbestimmung Proteinchemische Methoden Proteinaufreinigung der Wildtyp TfCa Proteinaufreinigung der rekombinanten TfCa, TfCut1 und TfCut Analytische Methoden Esterase-Aktivitätsbestimmung Bestimmung mittels Spektrophotometer Bestimmung mittels Plattenleser Cutinase-Aktivitätsbestimmung PCL-Abbauuntersuchung Bestimmung mittels Hofbildung Bestimmung mittels Plattenleser Quantitative Protein-Bestimmung nach Bradford (1976) SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Esteraseaktivitäts-Färbung Coomassie-Färbung Silberfärbung der Proteine Bestimmung des pi Bestimmung der Molaren Masse Bestimmung der Temperatur und ph-wert Stabilität Bestimmung der Stabilität gegenüber Inhibitoren Bestimmung der kinetischen Konstanten für die Hydrolyse von p-np Ester Bestimmung der kinetische Konstanten für die Hydrolyse von CTR Bestimmung optimaler Temperatur und ph-wert für die Hydrolyse von CTR N-terminale Sequenzierung MALDI-TF Sequenzierung Abbaustudien 74

7 VII Analytik der PET Abbauprodukte Konzentrationabhängige CTR-Abbaustudien Homologie-Modelling der TfCa und weitere PET-Hydrolasen 76 3 Ergebnisse und Diskussion Screening nach PET-Hydrolasen aus T. fusca Wachstum von T. fusca KW3 im Czapek-Medium Wachstum von T. fusca KW3 im MSV-Medium Esterasebildung mit verschiedenen synthetischen und natürlichen Polyestern Esterasebildung mit einer Suberinpräparation Esterasebildung mit PET-Fasern Esterasebildung bei T. fusca KW3 DSM 6013, T. fusca DSM und DSM mit PET-Fasern und Diethylterephthalat Charakterisierung der PET-Hydrolasen aus T. fusca KW Aufreinigung Aufreinigung der TfCa Aufreinigung der rekombinanten PET-Hydrolasen pi der TfCa Molare Masse der TfCa Temperatur- und ph-stabilität der TfCa Wirkung von Inhibitoren auf die TfCa Kinetik der Hydrolyse von verschiedenen Esterasesubstraten durch die TfCa ptimale Temperatur und optimaler ph-wert der CTR-Hydrolyse durch die TfCa Cutinaseaktivität der TfCa PCL-Abbau durch die TfCa N-terminale Sequenz der TfCa MALDI-TF Sequenzierung der TfCa Homologie-Modeling der TfCa und Vergleich der Struktur mit anderen Hydrolasen Vergleich der TfCa mit bekannten PET-Hydrolasen Hydrolyse von PET Substraten durch prokaryotische und eukaryotische Hydrolasen Partielle Hydrolyse von APET-Filmen durch die PET-Hydrolasen Partielle Hydrolyse von PET-Fasern durch die PET-Hydrolasen Hydrolyse von PET-Trimeren durch die PET-Hydrolasen Zusammenfassung 165

8 VIII 5 Literaturverzeichnis Publikationen Poster und Vorträge Lebenslauf 183

9 IX Abbildungsverzeichnis Seite Abbildung 1: Phylogenetischer Stammbaum des Lebens auf Grundlage der 16S rdna Untersuchungen. Die Gruppe der Actinobakterien ist im linken oberen Bereich angeordnet ( 1 Abbildung 2: T. fusca KW3 mit 1000facher Vergrößerung (links, Färbung mit Safranin) und Makroskopisches Aussehen nach Wachstum auf Czapek-Medium (rechts). 3 Abbildung 3: Schematische Darstellung der Einlagerung von Cutin in einem Blatt. Die Stärke, Struktur und Zusammensetzung der einzelnen Schichten der Cuticula können stark variieren abhängig von Spezies, rganen und Entwicklungsphase. Die epicuticulären Wachse (EW) bedecken die Cuticula (C) komplett, die aus Cutin und darin eingelagerten intracuticulären Wachsen besteht. Die cuticulären Schichten (CL) bestehen höchstwahrscheinlich aus Cutin und Polysacchariden der Zellwand, könnten aber vielleicht auch intracuticuläre Wachse enthalten. (PW: primäre Zellwand, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008). 5 Abbildung 4: Schematische Darstellung der Einlagerung von Suberin in der Endodermis einer Wurzel. Abgebildet sind zwei angrenzende Zellen mit Mittellamelle (ML) und Pektinschicht zwischen ihren primären Zellwänden (PW). Die Suberinlamellen befinden (SL) sich auf der Innenseite der primären Zellwand. (SW: sekundäre Zellwand, PM: Plasmamembran, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008). 6 Abbildung 5: Modell der möglichen Bindungsstrukturen im Biopolyester Cutin (Kolattukudy 2002). 7 Abbildung 6: Modell der hypotetischen Struktur der Suberinschicht der Kartoffel. P: phenolisches Monomer, C: Kohlenhydrat, S: Suberin (aromatisch oder aliphatisch) (Bernards 2002). 9 Abbildung 7: Darstellung der möglichen Verbindungen der Monomere der Biopolyester Cutin und Suberin. a) Hauptsächlich treten dabei primäre Esterbindungen auf (roter Pfeil), wodurch lange Ketten gebildet werden. Die sekundären Esterbindungen (blauer Pfeil) stellen zusätzliche Verzweigungspunkte dar. b) Anordnung der Fettsäure- und ω- Hydroxyfettsäure-Monomere unter Bildung eines Dendrimers. c) Anordnung der α,ω-dicarbonsäure- (DCS) und Glycerin-Monomere unter Bildung einer Dendrimer Struktur, angeordnet um freie H Gruppen um eine Bindung an einige Glycerin Monomere zu ermöglichen. d) Anordnung der DCS- und Glycerin-Monomere unter Bildung einer quervernetzten Domäne. (Pollard et al. 2008). 11 Abbildung 8: α/β Hydrolase-Faltungsmotiv der Hydrolasen ist eine doubly wound α/β superfold bestehend aus 8 zentral parallel angeordneten β-faltblättern (rot) und 6 umgebenden stabilisierenden α-helices (blau). Im Speziellen kann die Anzahl der Elemente variieren, das allgemeine Gerüst ist aber hochkonserviert. Das aktive Zentrum bilden 3 Aminosäuren (grün), das Nucleophil befindet sich im hoch konservierten Bereich zwischen der αc-helix und dem β5- Faltblatt, dem nucleophilic elbow (llis et al. 1992). 13 Abbildung 9: Der katalytische Reaktionsmechanismus der Hydrolasen am Beispiel der Spaltung eines Esters in die dazugehörige Säure und Alkohol. Die Reaktion erfolgt ohne Verwendung eines Cofaktors und ist somit sehr einfach und effizient. Die Bildung des Acylenzyms ist ein schneller Reaktionsschritt, die Freisetzung der Säure und des Enzyms ist der geschwindigkeitsbestimmende Reaktionsschritt. (Holmquist 2000). 14 Abbildung 10: Übersicht über die katalysierten hydrolytischen Spaltungen der Enzymgruppen der Carboxylesterase, Triacylglycerol Hydrolasen und der Cutin Hydrolasen im wässrigen Milieu. 15 Abbildung 11: Reaktionskinetik der Carboxylesterasen (links) nach Michaelis-Menten und der sigmoide Kurvenverlauf der Reaktionskinetik der Lipasen (rechts) (Pütz 2006). 16 Abbildung 12: Struktur der offenen und geschlossenen Lipase von Burkholderia cepacia BcL. Die offene Kristallstruktur ist blau dargestellt und das geschlossene Homologie-Modell grün, die gelbe Kugel stellt ein Ca 2+ -Ion dar. Die katalytische Triade besteht aus Serin, Histidin und Asparaginsäure (Trodler et al. 2009). 20 Abbildung 13: Polykondensationsreaktion von Terephthalsäure und Ethylenglycol zu Polyethylenterephthalat. 23 Abbildung 14: Struktur eines zyklischen PET-Trimers. 24 Abbildung 15: Schematische Darstellung des Schmelzspinnverfahrens von PET-Fibrillen (links) und Darstellung einer beheizten Schmelzspinndüse (Jahreiß 2005). 26 Abbildung 16: Anordnung der PET-Ketten vor (links) und nach (rechts) dem Verstrecken unter Ausbildung von geordneten kristallinen Bereichen (Jahreiß 2005). 27 Abbildung 17: Darstellung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den durch Verstrecken entstandenen geordneten PET-Ketten (grün). 27 Abbildung 18: Darstellung möglicher Faserquerschnitte und berflächen (links) und die PET-Fasern vor und nach dem Texturieren (rechts) (Jahreiß 2005). 28 Abbildung 19: DSC-Kurve einer PET-Folie ( 29 Abbildung 20: Darstellung der chemischen Struktur der Polyethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Trimere und der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011). 31 Abbildung 21: Darstellung der chemischen Struktur der Polytrimethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Dimere und der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011). 32 Abbildung 22: Darstellung der chemischen Struktur der angewandten Polyethylenterephthalat Modellsubstrate (Zimmermann und Billig 2011). 32 Abbildung 23: Kalibrierungskit für die pi Bestimmung, Breiter pi Bereich (ph 3-10, rechte Spur, GE Healthcare). 52 Abbildung 24: Elutionsprofil des Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie eluiert von einer XK 26/60 Säule, Superdex 200 prep grade, 320 ml SV, 50 mm Tris HCl ph7,2 150 mm NaCl, 2,5 ml/min, 280 nm und dazugehörige Kalibrierkurve (kleine Abbildung). 53

10 Abbildung 25: Wachstumskurve von T. fusca KW3 im Czapek-Medium bei 50 C und 150 rpm. 77 Abbildung 26: SDS-PAGE und Aktivitätsfärbung mit den Esterasen in den zellfreien Überständen des MSV-Mediums nach 10 tägiger Inkubation bei 50 C mit PET-Fasern (Spur 1), recyceltes PET-Granulat (Spur 2), einer PET-ligomerpräparation (Spur 3), einer zyklischen PET-ligomerpräparation (Spur 4), BHET (Spur 5), PBT-Fasern (Spur 6), einer Suberinpräparation (Spur 7) und einer Cutinpräparation (Spur 8). 79 Abbildung 27: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit recyceltem PET-Granulat, PET-ligomerpräparation, zyklische PET-ligomerpräparation, BHET, PBT und PET-Fasern über einen Zeitraum von 10 Tagen im MSV-Medium. 80 Abbildung 28: Bestimmung der Esteraseaktivitäten ( ) und der spezifischen Esteraseaktivitäten ( ) während des Wachstums im MSV-Medium unter Zugabe von Suberin. 82 Abbildung 29: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit Suberin im MSV-Medium, links Coomassiegefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1, 7: Roti -Mark SDS Proteinstandard; Spur 2: Nullwert; Spur 3, 8: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 7 Tagen Kultivierung; Spur 6: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung. 82 Abbildung 30: Biotrockenmasseproduktion ( ) und Esteraseaktivität ( ) von T. fusca KW3 im MSV-Medium. 83 Abbildung 31: Graphische Darstellung der Esteraseaktivität ( ) und der spezifischen Esteraseaktivität ( ) gebildet während der 10-tägigen Kultivierung im MSV-Medium mit PET-Fasern. 84 Abbildung 32: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit PET-Fasern im MSV-Medium, links Coomassiegefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1 und 7: Roti -Mark SDS Proteinstandard; Spur 2: Nullwert; Spur 3: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 8 Tagen Kultivierung; Spur 6, 8: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung. 84 Abbildung 33: SDS-PAGE der Rohenzymlösungen nach Kultivierung mit unbehandelten PET-Fasern bzw. DET im MSV- Medium, Gel gefärbt mit Coomassie- und mit Aktivitätsfärbung. Spur 1, 8: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 2: T. fusca DSM mit PET-Fasern kultiviert; Spur 3: T. fusca DSM mit DET kultiviert; Spur 4: T. fusca DSM mit PET-Fasern kultiviert; Spur 5: T. fusca DSM mit DET kultiviert; Spur 6: T. fusca KW3 DSM 6013 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 7: T. fusca KW3 DSM 6013 mit DET kultiviert. 86 Abbildung 34: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit DET ( ) und PET-Fasern ( ) über einen Zeitraum von 13 Tagen im MSV-Medium. 87 Abbildung 35: Elutionsprofil der Enzymlösung während des zweiten Aufreinigungsschritts (Phenylsepharose, Säulenvolumen 25 ml, Puffer A: 20 mm Phosphatpuffer ph 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mm Phosphatpuffer ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 96 Abbildung 36: Elutionsprofil der Enzymlösung während des dritten Aufreinigungsschritts (DEAE-Sepharose, Säulenvolumen 54 ml, Puffer A: 20 mm Phosphatpuffer ph 8, Puffer B: 1 M NaCl in 20 mm Phosphatpuffer ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 96 Abbildung 37: Elutionsprofil der Enzymlösung während des vierten Aufreinigungsschritts (ctyl-sepharose, Säulenvolumen 1 ml, Puffer A: 20 mm Phosphatpuffer ph 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mm Phosphatpuffer ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 97 Abbildung 38: Elutionsprofil der Enzymlösung während des fünften Aufreinigungsschritts (Sephadex 200, Säulenvolumen 110 ml, Puffer: 0,15 M NaCl in 20 mm Tris/HCl ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau) und die Esteraseaktivität (schwarz). 97 Abbildung 39: SDS-PAGE der Aufreinigung der TfCa aus T. fusca KW3. Spur 1: Enzymlösung nach der Dialyse; Spur 2: Enzymlösung nach der HIC 1; Spur 3: Enzymlösung nach der AIEX; Spur 4: Enzymlösung nach der HIC 2; Spur 5: Enzymlösung nach der SEC; Spur 6: Low Molecular Weight Längenstandard (Billig et al. 2010). 98 Abbildung 40: Elutionsprofil der TfCa während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mm NaH 2 P 4, 300 mm NaCl; ph 8,0, Puffer B: 50 mm NaH 2 P 4, 300 mm NaCl, 250mM Imidazol, ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-npb Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 106 Abbildung 41: Elutionsprofil der TfCa während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mm Phosphatpuffer ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-npb Aktivität (schwarz). 106 Abbildung 42: Elutionsprofil der TfCut2 während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mm NaH 2 P 4, 300 mm NaCl; ph 8,0, Puffer B: 50 mm NaH 2 P 4, 300 mm NaCl, 250 mm Imidazol, ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-npb Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 107 Abbildung 43: Elutionsprofil der TfCut2 während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mm Phosphatpuffer ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-npb Aktivität (schwarz). 107 Abbildung 44: SDS-PAGE der Aufreinigung der rekombinant produzierten TfCa in E. coli (A) und der rekombinant produzierten TfCut2 in E. coli (B). Spur M: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 1, 4: Rohenzymlösung nach Zellaufschluss; Spur 2, 5: Enzymlösung nach Ni-Affinitätschromatographie; Spur 3, 6: Enzymlösung nach SEC. 108 Abbildung 45: PhastGel der Bestimmung des isoelektrischen Punktes der TfCa. (linkes Gel PhastGel IEF 3-9, rechtes Gel PhastGel IEF 4-6,5) Spur 1: 26,7 ng TfCa; Spur 2: 66,7 ng TfCa; Spur 3: 133 ng TfCa; Spur 4: 26,7 ng TfCa; Spur 5: 53,4 ng TfCa; Spur 6: Kalibrierungskit für die pi Bestimmung, Breiter pi Bereich (ph 3-10, GE Healthcare). 113 Abbildung 46: Laufstrecken der Proteine des Roti -Mark SDS Proteinstandards (Fa. Carl Roth GmbH) aufgetragen gegen den Logarithmus ihres Molekulargewichtes. 114 X

11 Abbildung 47: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation in unterschiedlichen ph- Werten von 4 bis 11 bestimmt mit p-npb als Substrat. 115 Abbildung 48: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation in verschiedenen ph-werten von 3 bis 11 bestimmt mit p-npb als Substrat. 115 Abbildung 49: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation bei 40 C, 50 C und 55 C bestimmt mit p-npb als Substrat (Billig et al. 2010). 116 Abbildung 50: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation bei 30 C, 40 C, 50 C und 55 C bestimmt mit p-npb als Substrat. 116 Abbildung 51: Lineweaver-Burk Darstellung für die enzymkatalysierte Hydrolyse der CTR durch die TfCa. Mit Hilfe der doppeltreziproken graphischen Darstellung konnten die Geschwindigkeitskonstanten V max und K m bestimmt werden. 119 Abbildung 52: ph und Temperaturoptimum der TfCa beim Abbau von zyklischen PET-Trimeren, bestimmt per RP HPLC (Billig et al. 2010). 119 Abbildung 53: Gaschromatographische Analyse des Blindwerts (ohne Enzym) der Cutinhydrolyse. Abbildung 54: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 1 U TfCa der Cutinhydrolyse Abbildung 55: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 2 U TfCa der Cutinhydrolyse. Abbildung 56: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 4 U TfCa der Cutinhydrolyse Abbildung 57: PCL-Agarplatten nach 24 stündiger Inkubation mit TfCa (linkes Photo), mit dem Kulturüberstand des Suberin- MSV-Mediums (mittleres Photo) und mit Kulturüberstand des Cutin-MSV-Mediums (rechtes Photo). 122 Abbildung 58: Lokalisation des Tfu_2427 Gens im Genom von T. fusca YX (Quelle: Abbildung 59: Proteinsequenz von Tfu_2427 aus T. fusca YX, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv sind gelb markiert. Die ersten 10 Aminosäuren am N-Terminus, anhand derer die Identifikation erfolgte, sind unterstrichen (Billig et al. 2010). 123 Abbildung 60: Proteinsequenz der TfCa aus T. fusca KW3, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv sind gelb markiert, die identifizierten Unterschiede zu Tfu_2427 aus T. fusca YX sind rot markiert (Billig et al. 2010). 124 Abbildung 61: Alignment der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (tfu), der Carboxylesterase Arth_3983 aus Arthrobacter FB24 (art), der Carboxylesterase SC6127 aus Streptomyces coelicolor (sco), der putativen Carboxylesterase FRAAL0556 aus Frankia alni (fal) und der putativen p-nitrobenzylesterase SACE_2933 aus Saccharopolyspora erythraea (sen) (Billig et al. 2010). 125 Abbildung 62: Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-helices gekennzeichnet und gelb die β-faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade (Billig et al. 2010). 126 Abbildung 63: Ausschnitt aus der Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-helices gekennzeichnet und gelb die β-faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade. 126 Abbildung 64: Homologie-Modelle der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (a) verglichen mit verschiedenen PET- Cutinasen. Die Strukturen der Cutinasen aus H. insolens (b), F. solani sp. pisi (c), der Cutinasen Tfu_0882 (d) und Tfu_0883 (e) aus T. fusca KW3 und der Cutinase aus P. mendocina (f) sind dargestellt (Billig et al. 2010). 127 Abbildung 65: SDS-PAGE der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen, linkes Gel mit Aktivitätsfärbung, rechtes Gel Aktivitäts- und Coomassie-Färbung. Spur 1: Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3; Spur 2: rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 3: rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 4: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (Chen et al. 2010); Spur 5: Cutinase aus Fusarium solani sp. pisi (Vertommen et al. 2005); Spur 6: Cutinase von Novozymes. Zum Vergleich die Kulturüberstände verschiedener MSV-Medien, Spur 7: Cutin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; Spur 8: Suberin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; St 1 : Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas); St 2 : PageRuler TM Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas). 138 Abbildung 66: PCL Abbautest der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen (obere Reihe: Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (links), rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Mitte, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008), rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (rechts, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); mittlere Reihe: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (links, Chen et al 2010), Cutinase aus F. solani sp. pisi (Mitte, Vertommen et al. 2005), Cutinase von Novozymes (rechts); untere Reihe : rekombinant produzierten Hydrolasen aus T. fusca KW3: Carboxylesterase TfCa (links), Cutinase TfCut1 (Mitte), Cutinase TfCut2 (rechts). Abbildung 67: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit TfCa aus T. fusca KW Abbildung 68: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 von Chen et al und Chen J et al Abbildung 69: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von Vertommen et al Abbildung 70: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen et al Abbildung 71: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinasepräparation von Novozymes. 142 Abbildung 72: Rasterelektronenmikroskopische Analyse der enzymatisch behandelten APET-Film berflächen: Unbehandelte Kontrolle (A), Inkubation mit TfCa bei 50 C 74 h (B) und Inkubation mit Cutinase FsC bei 30 C 74 h (C). 144 Abbildung 73: Chromatogramm der HPLC Analyse des enzymatischen APET Abbaus durch die TfCa. 146 XI

12 XII Abbildung 74: MS-Spektren der Hydrolyseprodukte: TPA (m/z: 121,0; 164,9; 352,9), MHET (m/z: 120,9; 208,8; 440,9), BHET (m/z: 120,9; 252,9), EBT (m/z: 357,0) und EMT (m/z: 401,0). 147 Abbildung 75: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit TfCa aus T. fusca KW Abbildung 76: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 von Chen et al. 2010, Chen J et al Abbildung 77: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase aus F. solani pisi von Vertommen et al Abbildung 78: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen et al Abbildung 79: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der PET-Fasern mit der Cutinasepräparation von Novozymes. 150 Abbildung 80: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit TfCa aus T. fusca KW Abbildung 81: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase 1 aus T. fusca WSH03-11 von Chen et al. 2010, Chen J et al Abbildung 82: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 von Chen et al. 2010, Chen J et al Abbildung 83: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit rekombinanter TfCut Abbildung 84: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit rekombinanter TfCut Abbildung 85: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase aus F. solani pisi von Vertommen et al Abbildung 86: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen et al Abbildung 87: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation der zyklischen PET-Trimeren mit der Cutinase-Präparation von Novozymes. 155 Abbildung 88: Effekt der rtfca Konzentration auf die Hydrolyse von PET-Trimeren (Reaktionszeit 4 Stunden). 159 Abbildung 89: Effekt der rtfcut2 Konzentration auf die Hydrolyse von PET-Trimeren (Reaktionszeit 4 Stunden). 160 Abbildung 90: Effekt der Reaktionszeit auf die Hydrolyse von PET-Trimeren mit rtfca. 161 Abbildung 91: Effekt der Reaktionszeit auf die Hydrolyse von PET-Trimeren mit rtfcut Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Vertreter der Actinomyceten-Gruppe (Madigan et al. 2009). 2 Tabelle 2: Hauptmonomere des Cutins: C 16 : Hexadecansäure, 16-Hydroxyhexadecansäure, Dihydroxyhexadecansäure; 5 C 18 : ctadeca-9-ensäure, 18-Hydroxyoctadeca-9-ensäure, 18-Hydroxy-cis-9,10-epoxyoctadecansäure, 9,10,18- Trihydroxyoctadecansäure. (*Δ12 ungesättigte Analoga können auftreten; y = 8,7,6,oder 5; x+y = 13) (Kolattukudy 2002). 5 Tabelle 3: Struktur der Monomere Suberins: Aliphatische Monomere: 1-Alkanole; Alkansäuren; ω-hydroxyalkansäuren; α,ω-dialkansäuren; 9(10),ω-Dihydroxyalkansäure; 9,10-Dihydroxyalkansäure; 9,10,18-Trihydroxyalkansäure; 9,10- Dihydroxy-α,ω-Dialkansäure; 9,10-Epoxy-ω-Hydroxyalkansäure; 9,10-Epoxy-α,ω-Dialkansäure; Ferulasäure-Ester (mit 1-Alkanole); Glycerin. Aromatische Monomere: a) R 1 =R 2 =H, p-cumarsäure; R 1 =H, R 2 =H, Kaffeesäure; R 1 =CH 3, R 2 =H, Ferulasäure; R 1 =R 2 =CH 3, Sinapinsäure. b) R 1 =R 2 =H, p-cumarylalkohol; R 1 =CH 3, R 2 =H, Coniferylalkohol; R 1 =R 2 =CH 3, Sinapylalkohol. c) R 1 =H, p-cumaroyltyramin; R 1 =CH 3, Feruloyltyramin. (Bernards 2002). 6 Tabelle 4: Gegenüberstellung der prozentualen Anteile der typischen Cutin- und Suberin-Monomere. (Pollard et al. 2008). 10 Tabelle 5: Übersicht lipolytische Enzyme I, Esterasen (Gruppe II-VIII) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010). 18 Tabelle 6: Übersicht lipolytische Enzyme II, Lipasen (Grup. I.1-I.8) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010). 21 Tabelle 7: PET Biofunktionalisierung und analysierte Effekte (Zimmermann und Billig 2011). 33 Tabelle 8: Vergleich der PET-Hydrolasen von F. solani (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009), T. insolens (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009) und T. fusca (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008). 39 Tabelle 9: Das Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie. 52 Tabelle 10: Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels. 70 Tabelle 11: Zeitlicher Ablauf der Silberfärbung. 71 Tabelle 12: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 im MSV-Medium mit verschiedenen Additiven über einen Zeitraum von 10 Tagen. 80 Tabelle 13: Bildung von PET-Hydrolasen bei Bakterien. 93 Tabelle 14: Bildung von PET-Hydrolasen bei Pilzen. 94 Tabelle 15: Aufreinigungstabelle der TfCa aus T. fusca KW3 (Billig et al. 2010). 98 Tabelle 16: Aufreinigungstabelle der TfH aus T. fusca DSM (Kleeberg et al. 2005). 99

13 XIII Tabelle 17: Aufreinigungstabelle der Cutin-induzierten p-npb Hydrolase aus T. fusca (Chen S et al. 2008). 100 Tabelle 18: Aufreinigungstabelle der Cutinase aus P. mendocina ATCC (Sebastian et al. 1988). 100 Tabelle 19: Aufreinigungstabelle der Cutinasen und p-npp Hydrolase aus F. solani f. pisi (Purdy und Kolattukudy 1975a). 102 Tabelle 20: Aufreinigungstabelle der extrazellulären Cutinasen (Lin und Kolattukudy 1980a). 103 Tabelle 21: Aufreinigungstabelle der PET-Hydrolase aus P. citrinum (Liebminger et al. 2007). 104 Tabelle 22: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCa. 108 Tabelle 23: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCut Tabelle 24: Aufreinigungstabelle der rekombinanten periplasmatischen (pp-rtfh) und zytoplasmatischen (zp-rtfh) TfH (Dresler et al. 2006). 109 Tabelle 25: Expression der rekombinanten TfH in E. coli und B. megaterium (Yang et al. 2007). 109 Tabelle 26: Übersicht zur Affinitätsaufreinigung der His6-Tag rtfh produziert durch B. megaterium WH323-pYYBm9 gewachsen in einer LB-Batch Kultivierung und Hochzelldichten-Kultivierung (HZDK) mit A5 Medium. I:ohne Vorhbehandlung; II: 50 C für 10 min; III: 18 Stunden Dialyse bei 4 C (Yang et al. 2007). 110 Tabelle 27: Übersicht über die verbleibenden Esteraseaktivitäten nach der Inkubation der TfCa mit verschiedenen Inhibitoren. 117 Tabelle 28: Kinetische Parameter der Hydrolyse von p-np-estern und PET-Trimeren durch die TfCa aus T. fusca KW Tabelle 29: Identifizierte N-terminale Sequenz der TfCa aus T. fusca KW Tabelle 30: Vergleich der Eigenschaften der TfCa mit Cutinasen aus T. fusca. 128 Tabelle 31: Vergleich der PET-Hydrolasen aus F. solani FsC (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009), T. insolens HiC (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina PmC (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009), T. fusca TfH/Cutinase 2 (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008) und TfCa (Zimmermann und Billig 2011). 133 Tabelle 32: Kinetische Parameter K m und V max bestimmt für verschiedene p-np Ester für die Hydrolasen TfCa, TfH 1/2 (Chen et al. 2010), PmC a (Sebastian et al. 1988), PmC b (Gray et al. 1995), FsC (Purdy und Kolattukudy 1973), FsC 1, FsC 2 und FsE (Purdy und Kolattukudy 1975b). Die geringsten K m Werte je Enzym sind hervorgehoben, ebenso die höchsten V max Werte. 137 Tabelle 33: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit APET-Film. 142 Tabelle 34: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit PET-Fasern. 150 Tabelle 35: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit PET-Trimeren. 156 Tabelle 36: Vergleich der Abbauprodukte der PET Hydrolasen mit den drei PET Substraten. Die beiden Hauptprodukte des Enzyms sind blau unterlegt. 158 Tabelle 37: Proteinkonzentration der eingesetzten Enzyme und die dazugehörigen p-npb-aktivitäten in den Ansätzen des Abbauversuchs. 159

14 XIV Einheiten % Prozent C Grad Celsius µg Mikrogramm µm Mikrometer bp cm cm 2 d g/l g/ml kda LU/ml m/min mg mg/ml mm mm nm S U/ml Basenpaar Zentimeter Quadratzentimeter Tag Gramm / Liter Gramm / Milliliter Kilodalton Lipase Units / Milliliter Meter / Minute Milligramm Milligramm / Milliliter Millimeter Millimolar Nanometer Svendberg Units / Milliliter Abkürzungen Abkürzungen, die dem allgemeinen deutschen Sprachgebrauch entsprechen, werden nicht aufgeführt. 2D-Elektrophorese 3PET AFM AIEX APET AS BEB 2-Dimensionale Elektrophorese Bis(Benzoyloxyethyl)terephthalat Atomkraftmikroskopie Anionenaustauschchromatographie amorphes Polyethylenterephthalat Aminosäure Ethylenglycol-dibenzylester

15 XV BETEB Bis(Benzoyloxyethyl)terephthalat BHET Bis(2-Hydroxyethylterephthalat) BHPT Bis(3-Hydroxypropylterephthalat) BTA Copolyester aus 1,4-Butanediol, Dimethylterephthalat und Adipinsäure C. antarctica Candida antarctica C. cladosporioides Cladosporium cladosporioides CIEX Kationenaustauschchromatographie CTR Cyclo-tris-Ethylenterephthalat DEPA N,N-Diethyl-2-Phenylacetamid DET Diethylterephthalat DMS Dimethylsulfoxid DMT Dimethylterephthalat DNA Deoxyribonukleinsäure DP Diethyl-p-phthalat DSC Differentialrasterkalorimetrie DTT Dithiothreitol EBT 1,2-Ethylen-bis-Terephthalat EDTA Ethylendiamintetraacetat EMT 1,2-Ethylen-mono-Terephthalat-mono(2-Hydroxyethylterephthalat) ESCA Elektronenspektroskopie für chemische Analyse ESEM Umgebungsrasterelektronenmikroskopie et al. und andere (lat.) ETE Diethylterephthalat F. solani Fusarium solani FsC Fusarium solani Cutinase FTIR Fourier-Transformations-Infrarotspektrometrie GC Gaschromatographie GC-Gehalt Guanin-Cytosin-Gehalt GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie GPET Polyethylenterephthalat Granulat gram (-) gram negativ gram (+) gram positiv G. stearothermophilus Geobacillus stearothermophilus HIC Hydrophobe Interaktionschromatographie

16 XVI HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HTA Hydroxyterephthalat K/S Verhältnis Farbintensitätsverhältnis, bestimmt mit der Kubelka-Munk Gleichung LB-Medium Lysogenie Lösung (lysogeny broth) LC-MS Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie LC-MS/MS Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie/ Massenspektrometrie MG Molekulargewicht MHET Mono(2-Hydroxyethyl)Terephthalat MHPT Mono(3-Hydroxypropyl)Terephthalat mrna Boten-Ribonukleinsäure MSTFA N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid MSV-Medium Mineralsalz-Spurenelemente-Vitamin Medium NaH Natriumhydroxid PET höher kristallines biaxial orientiertes Polyethylenterephthalat P. mendocina Pseudomonas mendocina PBT 1,2-Propylen-bis-Terephthalat PCL Poly-ε-caprolacton PET Dimer Bis-(p-Methylbenzoesäure)Ethylenglycolester PET Trimer Bis-(Benzoyloxyethyl)Terephthalat PET Polyethylenterephthalat PET-B Polyethylenterephthalat-Pellets p-npa para-nitrophenylacetat p-npb para-nitrophenylbutyrat p-npc para-nitrophenylcaprylat p-npp para-nitrophenylpalmitat PmC Pseudomonas mendocina Cutinase PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PTT Dimer Cyclo-Di-Trimethylenterephthalat PTT Polytrimethylenterephthalat PVDF Polyvinylidenfluorid rdna ribosomale Deoxyribonukleinsäure RP-HPLC Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie R t SDS-PAGE Retentionszeit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Elektrophorese

17 XVII SEC Größenausschlusschromatographie SeL Streptomyces exfoliates Lipase SEM Rasterelektronenmikroskopie T Referenzstamm T. fusca Thermobifida fusca T. insolens Thermomyces insolens T. lanuginosus Thermomyces lanuginosus T d TDC TFA TfCa TfCut TfH Tfu T g TiC T m TPA TPCK UV XPS Denaturierungstemperatur Natrium-Taurodeoxycholat Tetrahyrofuran Thermobifida fusca Carboxylesterase Thermobifida fusca Cutinase Thermobifida fusca Hydrolase Thermobifida fusca Glasübergangstemperatur Thermomyces insolens Cutinase Schmelztemperatur Terephthalsäure Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon Ultraviolett Röntgenphotoelektronenspektroskopie Aminosäuren: A Ala Alanin I Ile Isoleucin R Arg Arginin C Cys Cystein K Lys Lysin S Ser Serin D Asp Asparaginsäure L Leu Leucin T Thr Threonin E Glu Glutaminsäure M Met Methionin V Val Valin F Phe Phenylalanin N Asn Asparagin W Trp Trytophan G Gly Glycin P Pro Prolin Y Tyr Tyrosin H His Histidin Q Gln Glutamin

18 Einführung 1 1 Einführung 1.1 Actinomyceten Klassifizierung Actinomyceten sind filamentöse, Sporen bildende gram (+) Bodenbakterien. Die Angehörigen dieser Gruppe weisen einen hohen GC-Gehalt von 63-78% auf. Actinomyceten gehören zur Klasse der Actinobakterien, zu denen auch die Corynebakterien, Arthrobacter, Brevibakterien, Propionibakterien, Eubakterien, Bifidobakterien, Acetobakterien und Thermoanaerobacter zählen. Die Actinomyceten werden aufgrund ihrer Eigenschaften in 8 Gruppen unterteilt (Tabelle 1). Actinobacteria Abbildung 1: Phylogenetischer Stammbaum des Lebens auf Grundlage der 16S rdna Untersuchungen. Die Gruppe der Actinobakterien ist im linken oberen Bereich angeordnet (

19 Einführung 2 Tabelle 1: Vertreter der Actinomyceten-Gruppe (Madigan et al. 2009). Bezeichnung, Eigenschaften und Beispiele Actinomyceten: nicht säurefest, fakultativ aerob, keine Myzelbildung, verzweigt; Actinomyces (anaerob bis fakultativ aerob, filamentöse Mikrokolonien, Filamente jedoch transitorisch, fragmentieren zu coryneformen Zellen, können human-/tierpathogen sein, kommen in Mundhöhle vor), Arachnia, Bacterionema, Rothia, Agromyces Mycobakterien: säurefest, übergangsweise Filamente; Mycobacterium (pathogene Saprophyten, obligat aerob, wächst langsam, Lipidgehalt der Zellen und Zellwände hoch, enthält Wachse und Mycolsäure; verursacht Tuberkulose, Lepra, Granulome, Vogeltuberkulose, auch Bodenmikroben) GC-Gehalt (DNA) Stickstofffixierende Actinomyceten: Symbionten von Pflanzen, bilden echte Mycelien; Frankia (bilden Knöllchen an Pflanzenwurzeln, wahrscheinlich mikroaerophil, wächst langsam, fixiert Stickstoff) Actinoplanes: bilden echte Mycelien, bildet Sporen, die in Sporangien liegen Actinoplanes, Streptosporangium Dermatophilus-Gruppe: bilden große Mengen beweglicher, kokkoider Elemente, Luftmycel fehlt, gelegentlich verantwortlich für Infektionen der berhaut (Epidermis) Dermatophilus, Geodermatophilus Nocardien: Mycelfäden brechen häufig unter Bildung kokkoider oder länglicher Elemente auseinander, gelegentlich Bildung von Luftsporen, manchmal säurefest, Lipidgehalt der Zellen und Zellwände sehr hoch Nocardia: verbreiteter Bodenorganismus, obligat aerob, viele Kohlenwasserstoffverwerter Rhodococcus: Bodensaprophyten, verbreitet im Darm verschiedener Insekten, verwerten Kohlenwasserstoffe Streptomyceten: Mycel bleibt intakt, üppiges Luftmycel und lange Sporenketten Streptomyces: fast 500 gültig beschriebene Arten, viele bilden Antibiotika Andere Gattungen (morphologisch unterschieden): Streptoverticillium, Sporichthya, Kitasatoa, Chainia Micromonospora-Gruppe: Mycel intakt, Sporen werden einzeln, in Paaren oder kurzen Ketten gebildet, einige thermophil, Saprophyten des Erdbodens und verrottender Pflanzenmasse, eine Art bildet Endosporen Micromonospora, Microbispora, Thermobispora, Thermoactinomyces, Thermomonospora Thermobifida (Thermomonospora) fusca Die Kolonien von T. fusca sind farblos, das gebildete Luftmycel hingegen weiß und scharf umgrenzt. Die Lufthyphen sind geradlinig oder gewunden, einfach oder verzweigt und bilden einzelne akropetale Luftsporen. T. fusca ist nicht säurefest, eurythermal thermophil und fakultativ anaerob

20 Einführung 3 (Hensen 1957). Das Temperaturoptimum für das Wachstum liegt bei C und der optimale ph von 7,5 bis 11. T. fusca ist Katalase stark positiv, xidase negativ, die Säureproduktion aus D-Glucose ist schwach positiv und die Nitratreduktion negativ. Der Mikroorganismus kann Casein, Gelatine, Kreatin und Elastin proteolytisch hydrolysieren. Es erfolgt ebenfalls eine Hydrolyse von Stärke, Agar, Pektin, Cellulose, Xylan, Arbutin und Aesculin, hingegen keine von Chitin, Xanthin, Hypoxanthin, Guanin und Tyrosin. T. fusca kann die Kohlenhydrate D-Galaktose und Laktose verwerten, D-Ribose und D-Xylose hingegen nicht (McCarthy et al. 1984). Phylogenetische Untersuchungen auf Grundlage der 16S rrna zeigten keine enge verwandtschaftliche Verbindung zu den anderen Gruppen des Actionmyceten-Klusters (Embley et al. 1994). Abbildung 2: T. fusca KW3 mit 1000facher Vergrößerung (links, Färbung mit Safranin) und Makroskopisches Aussehen nach Wachstum auf Czapek-Medium (rechts). Aufgrund der vielfältigen hydrolytischen Aktivität von T. fusca wurden in der Vergangenheit bereits verschiedenste Untersuchungen zur Identifikation und Aufreinigung von hydrolytischen Enzymen durchgeführt. Dabei erfolgte unter anderem eine Charakterisierung der Polygalakturonat-Lyase (EC ) (Stutzenberger 1987), des Xylan-abbauenden Systems (Endoxylanase, α- Arabinofuranosidase, β-xylosidase) (Bachmann et al. 1991), einer Maltotriose produzierende α- Amylase (Busch et al. 1997), einer Acetylxylanesterase (Yang et al. 2008) und von Cutinasen (Kleeberg et al. 2005, Cheng et al. 2008). Durch die lückenlose Sequenzierung der genomischen DNA von T. fusca (Lykidis et al. 2007) können nun mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden weitere interessante Proteine identifiziert und charakterisiert werden. Die Proteom- und Transkriptom-Analyse der extrazellulären Proteine und des mrna Levels mittels 2D-Elektrophorese und LC-MS/MS erfolgte ebenfalls für einen T. fusca Stamm nach Wachstum auf Cellubiose- und Glucose-haltigem Medium (Chen et al. 2007).

21 Einführung 4 T. fusca KW3 (DSM 6013) wurde aus Kompost isoliert und es erfolgten bereits Studien zur thermophilen Xylanase-Produktion mit diesem Stamm (Röthlisberger et al. 1992, Casimir-Schenkel 1992). Das Neuisolat unterscheidet sich durch eine Resistenz gegenüber Kristallviolett, einer oberen Wachstumsgrenze bei 60 C und einer Alkalitoleranz bis ph 11. Ein besonderes Interesse bei der Suche nach technisch anwendbaren Enzymen gilt dem Abbau der Biopolymere Cutin und Suberin, von Pflanzen gebildete natürliche Polyester aus aliphatischen und aromatischen Regionen. Cutin ist ein Bestandteil der Cuticula, welche die Barriere zwischen der Pflanze und ihrer Umwelt bildet. Die Cuticula verhindert das Austrocknen der Pflanze, reguliert den Gasaustausch und schützt vor mechanischen und Strahlungsschäden ebenso wie vor Pflanzenfressern und pathogenen mikrobiellen Attacken. Suberin hingegen, befindlich unter Anderem in Korkzellen und im Periderm (äußere Barriere der Rinde und der unterirdischen Pflanzenteile wie Wurzeln und Knollen), dient als Diffusionsbarriere (Nawrath 2002, Kolattukudy 2002). T. fusca produziert ebenfalls diese interessanten hydrolytischen Enzyme, auf deren Aktivität und Bedeutung in den folgenden Kapiteln näher eingegangen wird (Fett et al. 1999, Kleeberg et al. 2005, Cheng et al. 2008). 1.2 Biopolyester Cutin und Suberin Bestandteile des Cutins Die Bezeichnung Cutin wurde von Cutose abgeleitet, was die ursprüngliche Bezeichnung für eine Gewebsschicht der Epidermis von Blättern war, welche eine Resistenz gegenüber starken Säuren vorwies. Cutin wurde sowohl in den Blättern von Land-, als auch von Wasserpflanzen gefunden, aber ebenfalls in Stengeln, Blattstielen, Blütenteilen, Früchten, einige Samenschalen und im Inneren von Zitronen. Die Stärke der Cutinschicht variiert je nach Spezies und Pflanzenteil. In den Blättern von höheren Pflanzen beträgt die Dicke der Cutinschicht zwischen 0,5 und 14 µm mit < 20 bis 600 µg Cutin pro cm 2 berfläche. In manchen Früchten mit hochentwickelter Cuticula beträgt der Cutingehalt bis zu 1,5 mg pro cm 2. Bei niederen Pflanzen ist die Cutinschicht sehr dünn (~0,1 µm) (Kolattukudy 2002).

22 Einführung 5 Abbildung 3: Schematische Darstellung der Einlagerung von Cutin in einem Blatt. Die Stärke, Struktur und Zusammensetzung der einzelnen Schichten der Cuticula können stark variieren abhängig von Spezies, rganen und Entwicklungsphase. Die epicuticulären Wachse (EW) bedecken die Cuticula (C) komplett, die aus Cutin und darin eingelagerten intracuticulären Wachsen besteht. Die cuticulären Schichten (CL) bestehen höchstwahrscheinlich aus Cutin und Polysacchariden der Zellwand, könnten aber vielleicht auch intracuticuläre Wachse enthalten. (PW: primäre Zellwand, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008). Typische Monomere des Cutins sind C16 und C18 Fettsäuren, welche auch ein- oder mehrfach hydroxyliert, ungesättigt oder epoxyliert sein können (Kolattukudy 2002). Tabelle 2: Hauptmonomere des Cutins: C 16 : Hexadecansäure, 16-Hydroxyhexadecansäure, Dihydroxyhexadecansäure; C 18 : ctadeca-9-ensäure, 18-Hydroxyoctadeca-9-ensäure, 18-Hydroxy-cis-9,10-epoxyoctadecansäure, 9,10,18- Trihydroxyoctadecansäure. (*Δ12 ungesättigte Analoga können auftreten; y = 8,7,6,oder 5; x+y = 13) (Kolattukudy 2002). C 16 -Familie C 18 -Familie * CH H CH CH H CH H CH H x H y CH H H CH H Bestandteile des Suberins Suberin ist abgleitet von dem lateinischen Wort suber, was Kork bedeutet. Der Begriff Suberin wurde bereits vor 200 Jahren von Michel Eugène Chevreul ( ) verwendet, um den im Kork enthaltenen wasserunlöslichen Bestandteil zu beschreiben. Dieses mehrteilige Material besteht aus verschiedenen polymeren Domänen, die kovalent an die hoch komplexe Zellwand gebunden sind.

23 Einführung 6 Abbildung 4: Schematische Darstellung der Einlagerung von Suberin in der Endodermis einer Wurzel. Abgebildet sind zwei angrenzende Zellen mit Mittellamelle (ML) und Pektinschicht zwischen ihren primären Zellwänden (PW). Die Suberinlamellen befinden (SL) sich auf der Innenseite der primären Zellwand. (SW: sekundäre Zellwand, PM: Plasmamembran, Cy: Cytoplasma, V: Vakuole) (Pollard et al. 2008). Tabelle 3: Struktur der Monomere Suberins: Aliphatische Monomere: 1-Alkanole; Alkansäuren; ω-hydroxyalkansäuren; α,ω-dialkansäuren; 9(10),ω-Dihydroxyalkansäure; 9,10-Dihydroxyalkansäure; 9,10,18-Trihydroxyalkansäure; 9,10- Dihydroxy-α,ω-Dialkansäure; 9,10-Epoxy-ω-Hydroxyalkansäure; 9,10-Epoxy-α,ω-Dialkansäure; Ferulasäure-Ester (mit 1- Alkanole); Glycerin. Aromatische Monomere: a) R 1 =R 2 =H, p-cumarsäure; R 1 =H, R 2 =H, Kaffeesäure; R 1 =CH 3, R 2 =H, Ferulasäure; R 1 =R 2 =CH 3, Sinapinsäure. b) R 1 =R 2 =H, p-cumarylalkohol; R 1 =CH 3, R 2 =H, Coniferylalkohol; R 1 =R 2 =CH 3, Sinapylalkohol. c) R 1 =H, p-cumaroyltyramin; R 1 =CH 3, Feruloyltyramin. (Bernards 2002). Aliphatische Monomere H Aromatische Monomere CH H H CH HC H H CH CH a) R2 H R1 H H H CH CH 2 H HC CH H H CH b) R2 H R1 HC CH H N Me H H H H R2 c) H R1 H

24 Einführung 7 Suberin besteht aus polyaliphatischen Bereichen mit langkettigen Hydroxyfettsäuren und Dicarboxylsäuren und geringeren Mengen an sehr langen Fettsäuren und Fettalkoholen. Desweiteren gibt es noch polyaromatische Domänen mit verschiedenen aromatischen Carbonsäuren und Alkoholen, deren genaue Struktur bisher noch nicht eindeutig bekannt ist. Diese Domänen können auch aufgrund ihres Aussehens unterschieden werden. Die aromatischen Domänen zeigen eine dunklere Färbung gegenüber den aliphatischen Domänen. (Bernards 2002, Kolattukudy 2002) Struktur der Biopolymere Bisher wurden die verschiedensten Modelle zur möglichen Struktur von Cutin und Suberin veröffentlicht, allerdings gibt es bisher keine genaue Strukturaufklärung. Die nachfolgenden Ausführungen verdeutlichen die Probleme der Strukturidentifikation aufgrund der Vielzahl an Monomeren und möglichen Bindungsstellen. Abbildung 5: Modell der möglichen Bindungsstrukturen im Biopolyester Cutin (Kolattukudy 2002). Da Cutin ein unlösliches und kompaktes Polymer ist, gibt es nur wenige Möglichkeiten für eine Strukturanalyse. Bei einer Transmissions-Fourier-Transformations-Infrarot-Spektrum Analyse (FTIR) konnten Absorptionen in Bereichen für Hydroxylgruppen (-H), für aliphatische C-H Bindungen, für Carbonylester-Bindungen (C=) und C- Ester identifiziert werden. Des Weiteren wurden verschiedene Analysen zur Identifikation von freien funktionellen Gruppen im Polymer durchgeführt.

25 Einführung 8 Als Schlussfolgerung aus den durchgeführten Untersuchungen liegen die primären Alkoholgruppen im Cutin als Esterbindungen vor, das bedeutet dass das Polymer, ein Polyester, aus hauptsächlich primären Alkoholesterverbindungen besteht. Etwa die Hälfte der sekundären Alkohol-Gruppen ist ebenfalls verestert, was bedeutet, dass Verzweigungen und/oder Quervernetzungen vorliegen. Basierend auf diesem Wissen wurde eine Modelstruktur des Cutins erstellt (Abbildung 5). Weitere Analysen ergaben, dass Cutin ein moderat bewegliches Geflecht darstellt mit Bewegungseinschränkungen wahrscheinlich auf Grund der quervernetzten Seitenketten. Cutin besteht größtenteils aus mittelständigen sekundären Hydroxylgruppen, die dadurch eine große Bedeutung bei der Quervernetzung des Polymers spielen. Für weitere Untersuchungen der Struktur des Cutins wurden auch enzymatisch freigesetzte Cutin-ligomere analysiert. Dabei erfolgte der Nachweis der vorausgesagten sekundären Alkoholester der mittelständigen 10-Hydroxy-Gruppe der Hauptkomponente des Cutins, der 10,16-Dihydroxyhexadacansäure (Kolattukudy 2002). Bisher ist nicht bekannt, ob Cutin als eigenständiges Polymer-Molekül mit unbekanntem Molekulargewicht existiert, verankert an die Zellwand an verschiedenen Stellen oder ob Cutin nur ein hoch verzweigter Bestandteil ist (Pollard et al. 2008). Eine Besonderheit in der Cutinstruktur stellt ein nichtabbaubarer Kern, der nach hydrolytischen Behandlungen zurück bleibt, dar. Er besteht aus einem dreidimensionalen Netzwerk aus Polyethylen- Molekülen mit Doppelbindungen und freien Carboxyl-Gruppen, und enthält zusätzliche Etherbindungen (Kolattukudy 2002). Diese Struktur, bestehend aus aliphatischen Bestandteilen, wird als Cutan bezeichnet und gewonnen durch Delipidation und Depolymerisation der Esterbindungen der Cuticula. Cutan kann aber auch Zellwand-Kohlenhydrate und Aromaten enthalten. Dieses Polymer besteht aus C-- und C-C- verbundenen aliphatischen Ketten. Die Linolensäure scheint im Vergleich zu Palmitin- oder Ölsäure das bevorzugte Substrat für die Biosynthese des Cutans zu sein. Für das allgemeine Verständnis des Cutins ist es wichtig, auch die Struktur und Besonderheiten des Cutans zu verstehen. Ist dieses Polymer mit Cutin verbunden oder ist es ein Bestandteil davon (Pollard et al. 2008)? Bei dem Biopolyester Suberin ist aufgrund der beiden vorherrschenden Domänen eine Strukturidentifikation noch schwieriger. Eine besondere Rolle im Suberin hat das Glycerin: zum Einen dient es als Verbindungsstruktur zwischen den Acyl-Monomeren und bewahrt somit ihre lineare Anordnung und zum anderen ist es auch die Vernetzungsstruktur der beiden Domänen. Die polyaromatische Schicht ist kovalent mit Kohlenhydraten der primären Zellwand verbunden (Abbildung 6). Diese Bindung erfolgt nicht ausschließlich über Esterbindungen. Das Glycerin dient hier ebenfalls als Verbindungsstruktur zwischen den beiden Schichten des Suberins. Die Darstellung zeigt einen Ausschnitt einer suberinisierten Kartoffelzelle bestehend aus 2 aliphatischen Domänen (heller Bereich) und einer aromatischen Domäne (dunkler Bereich), welche kovalent an die primäre

26 Einführung 9 Zellwand gebunden sind. Die hervorgehobenen aromatischen Monomere konnten mittels verschiedener analytischer Methoden nachgewiesen werden. Die eingelagerten Wachse und extrem langkettigen Fettsäuren in der Suberinschicht sind in der Abbildung nicht berücksichtigt (Bernards 2002). Primäre Zellwand Suberin-Lamellen Abbildung 6: Modell der hypotetischen Struktur der Suberinschicht der Kartoffel. P: phenolisches Monomer, C: Kohlenhydrat, S: Suberin (aromatisch oder aliphatisch) (Bernards 2002). Ein bedeutender Unterschied zwischen Suberin und Cutin ist, dass Suberin sich auf der inneren Seite der primären Zellwände befindet. Das aliphatische Monomerenprofil von Suberin ist ähnlich dem von Cutin, es gibt aber auch Unterschiede im prozentualen Anteil und der Kettenlänge der Monomere (Tabelle 4). Abgesehen von den Fettsäuren, ω-hydroxy-fettsäuren und Glycerin, besteht Suberin zusätzlich auch aus hohen Mengen von α,ω-dicarbonsäuren, Hydroxyzimtsäuren (besonders Ferulasäure) und Fettalkoholen. Unterschiedlich ist auch, dass in Suberin eine große Menge an gesättigten Aliphaten gefunden wurden mit einer Kettenlänge >C20. Es wurden ebenfalls Esterbindungen zwischen ω-hydroxy- Fettsäuren und zwischen ω-hydroxy-fettsäuren und α,ω-dicarbonsäuren oder Ferulasäure nachgewiesen (Pollard et al. 2008).

27 Einführung 10 Tabelle 4: Gegenüberstellung der prozentualen Anteile der typischen Cutin- und Suberin-Monomere. (Pollard et al. 2008). Monomertyp Cutin Suberin Unsubstituierte Fettsäure 1-12% 1-10% CH C16:0, C18:0, C18:0 bis C24:0 C18:1, C18:2 ω-hydroxyfettsäuren 1-32% 11-43% H CH C16:0, C18:1, C18:1, C16:0 bis C18:2 C26:0 α,ω-dicarbonsäuren Normal <5% 24-45% aber >50% in C18:1, C18:2, HC CH Arabidopsis C16:0 bis C26:0 C16;0, C18:0, C18:1, C18:2 Mittelständige funktionelle Gruppen Epoxy-Fettsäuren Polyhydroxy-Fettsäuren H H Polyhydroxy-α,ω-Dicarbonsäuren H HC Fettalkohole 1-Alkanole und 1-Alkenole H α,ω-alkandiole und α,ω-alkendiole H Glycerin H H CH CH H CH H 0-34% C18:0 (9,10- epoxy), C18:1 (9,10-epoxy) 16-92% C16:0 (10,16- dihydroxy), C18:0 (9,10,18- trihydroxy) Spuren 0-8% C16:0, C18:1 0-5% C18:1 1-14% 14-26% 0-30% C18:1 (9,10- epoxy-18- hydroxy), C18:0 (9,10-epoxy- 1,18-disäure) 0-2% C18:0 (9,10,18- trihydroxy) 0-8% C18:0 (9,10- dihydroxy) 1-6% C18:0 bis C22:0 0-3% C22:0 Phenole H H H Me 0-1% Ferulasäure 0-10% Ferulasäure, geringere Mengen von Cumarsäure, Sinapinsäure und Kaffeesäure Bei ersten Untersuchungen zur Aufklärung der Bindungen in Suberinpolymeren wurden lineare Dimere der ω-hydroxy-fettsäuren verestert mit α,ω-dicarbonsäuren und quervernetzt mit ω- Hydroxy-Fettsäuren nachgewiesen. Glycerin konnte in verschiedenen Bindungsstrukturen detektiert werden: verestert mit ω-hydroxy-fettsäuren oder α,ω-dicarbonsäuren, verestert in beiden Positionen mit α,ω-dicarbonsäuren oder als Verbinder zwischen zwei α,ω-dicarbonsäuren. Ebenfalls

28 Einführung 11 identifiziert wurde ein trimerer Diester des Glycerins verbunden mit einer ω-hydroxy-fettsäure und Ferulasäure. Damit wurde nachgewiesen, dass die Ferulasäure kovalent an die aliphatische Suberin- Domäne gebunden ist. Schlussfolgerungen der Studien sind, dass Suberin langkettige α,ω-dicarbonsäuren, an beiden Enden mit Glycerin verestert, als Hauptbestandteil des Polymers enthält. Vom Glycerin aus sind 2- und 3- dimensionale Esterbindungen zu α,ω-dicarbonsäuren und ω-hydroxy-fettsäuren ausgebildet. Am Rand des Glycerin-basierenden Polymers ist die Ferulasäure an die aliphatische Domäne als polyaromatische Domäne gebunden und diese ist wiederum gebunden an die Zellwandkohlenhydrate (Franke et al. 2007). Mit 2-dimensionalen Kugel-Stab-Modellen werden mögliche Monomerverbindungen lokaler Polyesterdomänenstrukturen dargestellt (Abbildung 7 b-d). Nur mittig stehende Hydroxyl-Gruppen wurden in die Betrachtung einbezogen und andere mittelständige funktionelle Gruppen wurden nicht berücksichtigt, ebenso wie mögliche Nicht-Ester-Verbindungen und Veresterungen mit den Zellwänden. Es ist bisher nicht bekannt, ob solche klar definierten Domänen aus Hydroxyfettsäure-, α,ω-dicarbonsäure- und Glycerin-Monomeren gebildet werden oder ob die Strukturen vermischt vorliegen (Pollard et al. 2008). a) d) b) c) Fettsäure ω-hydroxyfettsäure Substituierte ω-hydroxyfettsäure Dicarboxylsäure -H Glycerin -CH Ester Abbildung 7: Darstellung der möglichen Verbindungen der Monomere der Biopolyester Cutin und Suberin. a) Hauptsächlich treten dabei primäre Esterbindungen auf (roter Pfeil), wodurch lange Ketten gebildet werden. Die sekundären Esterbindungen (blauer Pfeil) stellen zusätzliche Verzweigungspunkte dar. b) Anordnung der Fettsäure- und ω- Hydroxyfettsäure-Monomere unter Bildung eines Dendrimers. c) Anordnung der α,ω-dicarbonsäure- (DCS) und Glycerin-Monomere unter Bildung einer Dendrimer Struktur, angeordnet um freie H Gruppen um eine Bindung an einige Glycerin Monomere zu ermöglichen. d) Anordnung der DCS- und Glycerin-Monomere unter Bildung einer quervernetzten Domäne. (Pollard et al. 2008).

29 Einführung 12 In den letzten Jahren wurden ebenfalls Studien zur synthetischen Herstellung von Cutin durchgeführt und die erhaltenen Polymere mit dem natürlichen Biopolyester verglichen. Die gebildeten Strukturen der Hauptkomponenten stimmten sehr gut überein (Benίtez et al. 2004). Mittlerweile werden auch die Enzyme des Cutin und Suberin Biosyntheseweges als interessante Biokatalysatoren für die Produktion von Chemikalien und Polymeren studiert (Li et al. 2009). 1.3 Hydrolasen Struktur und katalytischer Mechanismus Die Enzymklasse der Hydrolasen ist eine große Gruppe an strukturell ähnlichen Enzymen mit verschiedensten katalytischen Funktionen. Diese Enzyme katalysieren unter Einbau eines Wassermoleküls die reversible Spaltung von Biomolekülen (Hydrolyse), aber auch unter Abspaltung eines Wassermoleküls die Synthese dieser Strukturen. Die Gemeinsamkeit dieser Klasse ist die α/β Hydrolase Faltungsstruktur, die aus 8 meist parallel angeordneten β-faltblättern (β1-β8) und auf beiden Seiten umgebende stabilisierende α-helices (αa-αf) aufgebaut ist. Eine gewisse Variabilität in der Anzahl der Strukturen ist bei den verschiedenen hydrolytischen Enzymen identifiziert worden, allerdings ist die zentrale Anordnung und Form des aktiven Zentrums als definierte Bindungstasche bei allen Enzymen gleich. Diese dreidimensionale Struktur der Hydrolasen bildet das Gerüst für die enzymatische Funktion und Substratspezifität der Enzyme. Die hydrolytischen Katalysatoren sind ein Beispiel für die divergierende Evolution von Enzymen, die aus einer Struktur durch den Austausch von Aminosäuren oder durch die Insertion/Deletion von Schleifen über einen zeitlichen Abstand entstehen und unterschiedliche katalytische Aufgaben erfüllen. Die Enzyme besitzen dadurch zwar geringe Sequenzhomologien aber eine vergleichbare Raumstruktur und eine identische Anordnung am katalytischen Zentrum. Die Aminosäuren des aktiven Zentrums sind ein Histidin, eine Säure (Asparaginsäure oder Glutaminsäure) und ein Nucleophil (Serin, Asparagin oder Cystein) in einer konservierten Region, welche sich über Wasserstoffbrückenbindungen untereinander stabilisieren (Abbildung 8) (llis et al. 1992).

30 Einführung 13 αe αd αc β8 αb β7 Säure Nuc β6 β5 β4 His β3 αf CH β2 β1 NH 2 αa Abbildung 8: α/β Hydrolase-Faltungsmotiv der Hydrolasen ist eine doubly wound α/β superfold bestehend aus 8 zentral parallel angeordneten β-faltblättern (rot) und 6 umgebenden stabilisierenden α-helices (blau). Im Speziellen kann die Anzahl der Elemente variieren, das allgemeine Gerüst ist aber hochkonserviert. Das aktive Zentrum bilden 3 Aminosäuren (grün), das Nucleophil befindet sich im hoch konservierten Bereich zwischen der αc-helix und dem β5- Faltblatt, dem nucleophilic elbow (llis et al. 1992). Die katalytische Hydrolyse am aktiven Zentrum erfolgt in mehreren Schritten. Im Grundzustand stabilisieren sich die Aminosäuren der katalytischen Triade untereinander durch Wasserstoff- Brückenbindungen (Abbildung 9). Bei Anwesenheit eines Esters im katalytischen Zentrum greift das Nucleophil, in diesem Fall das Serin, den Ester unter Ausbildung eines tetraedrischen Zwischenprodukts nucleophil an. Das frei werdende Proton des Nucleophils übernimmt der Imidazolring des Histidin und dieser wird unterstützt durch das Carboxylatanion der Säure, in diesem Fall der Asparaginsäure. Das gebildete, negativ geladene Intermediat wird durch mehrere Aminosäure-Reste, welche sich in der Region des aktiven Zentrums befinden, stabilisiert. Diese Struktur wird als xyanionen-loch bezeichnet. Im nächsten Schritt erfolgt die Abspaltung des Alkohols und die Bildung eines Enzym-Substrat Komplexes, dem Acylenzym. Durch den Eintritt eines Wassermoleküls in das aktive Zentrum und dessen nucleophilen Angriff am Acylenzym bildet sich wiederum ein tetraetrisches Intermediat, welches durch Wasserstoff-Brückenbindungen im xyanionen-loch stabilisiert wird. Durch die Abspaltung der Säure und ihrer Freigabe erfolgt die Rückführung des aktiven Zentrums in seinen Ausgangszustand und steht somit direkt für die Bindung eines weiteren Esters bereit.

31 Einführung 14 H R His HN N H Ser R R Säure tetrahedraler Übergangszustand II His Ser NH N R H H His Acyl- Enzym- Komplex N Säure H H 2 H N NH H N Ser H N Säure R H N R H Freies Enzym Säure Säure His H N NH R tetrahedraler Übergangszustand I His Ser NH N R H R H N H N H N Ser R H N Abbildung 9: Der katalytische Reaktionsmechanismus der Hydrolasen am Beispiel der Spaltung eines Esters in die dazugehörige Säure und Alkohol. Die Reaktion erfolgt ohne Verwendung eines Cofaktors und ist somit sehr einfach und effizient. Die Bildung des Acylenzyms ist ein schneller Reaktionsschritt, die Freisetzung der Säure und des Enzyms ist der geschwindigkeitsbestimmende Reaktionsschritt. (Holmquist 2000). Eine weitere Besonderheit der Hydrolasen ist das hochkonservierte Pentapeptid G-X-S-X-G, in das das katalytische Serin eingebettet ist. Bei den beiden flankierenden Aminosäuren handelt es sich um Glycin, für X können verschiedene Aminosäuren stehen. Die Enzymklasse der Hydrolasen beinhaltet unter Anderem die Carboxylesterasen (EC , Esterase), die Triacylglycerol Lipasen (EC , Lipase) und die Cutin Hydrolasen (EC , Cutinase). Sie hydrolysieren alle Ester-Verbindungen, variieren aber bezüglich ihres Substratspektrums. Die Carboxylesterase, auch unspezifische Esterase, spaltet unter Einbau eine Wassermoleküls Carboxylester in seine Bestandteile Alkohol und Carboxylsäure. Die Lipasen finden Anwendung bei dem hydrolytischen Abbau von Fetten (Triacylglyceride) in Glycerol und Fettsäuren. Die Cutinasen zeichnen sich durch die Besonderheit der katalytischen Spaltung des Biopolymers Cutin in dessen Monomere (u.a. Fettsäuren, Hydroxyfettsäuren, aliphatische Alkohole, aromatische Säuren) aus. Alle dargestellten Reaktionen laufen im wässrigen Milieu ab.

32 Einführung 15 Carboxylesterase R 1 R 2 + H 2 + R 2 H R 1 H Triacylglycerol Hydrolase R 3 + R 1 CH R 1 R 2 + H 2 H H H + R 2 CH + R 3 CH Cutin Hydrolase CH H CH H x H CH y + (H 2 ) n CH H CH H CH H H CH H n Abbildung 10: Übersicht über die katalysierten hydrolytischen Spaltungen der Enzymgruppen der Carboxylesterase, Triacylglycerol Hydrolasen und der Cutin Hydrolasen im wässrigen Milieu. Die Carboxylesterase zeichnet sich durch die Hydrolyse von kurz- und mittelkettigen, wasserlöslichen Estern aus und ihre Reaktionskinetik kann durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben werden (Abbildung 11). Im Gegensatz dazu hydrolysieren die Lipasen bevorzugt langkettige Triglyceride, welche meist wasserunlöslich sind. Die Reaktionskinetik der Lipasen zeichnet sich durch einen sigmoiden Verlauf aus, da diese Enzyme eine Grenzflächenaktivierung aufweisen (Abbildung 11). Das bedeutet, dass bei geringen Substratkonzentrationen die Lipase inaktiv bleibt bzw. nur geringe Aktivitäten detektiert werden. Sobald aber die Substratkonzentration die spezifische Konzentration (kritische micellare Konzentration) erreicht, ab der eine Agglomeration des Substrats erfolgt, bildet sich eine Grenzfläche zwischen den hydrophoben Substratmicellen und der hydrophilen Wasserphase mit der Lipase aus. Ab dieser Substratmenge steigt die hydrolytische Aktivität der Lipasen rapide an.

33 Einführung 16 Abbildung 11: Reaktionskinetik der Carboxylesterasen (links) nach Michaelis-Menten und der sigmoide Kurvenverlauf der Reaktionskinetik der Lipasen (rechts) (Pütz 2006). Der Grund für dieses Verhalten lässt sich anhand der Struktur der Lipasen erklären. Das aktive Zentrum des Enzyms wird durch eine bewegliche Proteinschlaufe, eine α-helix, abgedeckt. Dieser Deckel (engl.: lid) ist der Grund für die geringen Enzymaktivitäten unterhalb der kritischen mizellaren Konzentration. Sobald diese Proteinschlaufe mit der Grenzfläche der Substratmizelle in Berührung kommt, erfolgt eine Konformationsänderung und der Deckel gibt das aktive Zentrum frei (Abbildung 12). Gleichzeitig wird dadurch die hydrophobe berfläche, die das aktive Zentrum umgibt, frei zugänglich und unterstützt die Interaktion zwischen dem Enzym und dem hydrophoben Substrat. In neueren Studien wurden weitere Lipasen identifiziert und biochemisch charakterisiert, die keine Grenzflächenaktivierung zeigten. Die Lipase LipA aus B. subtilis besitzt zum Beispiel keinen Deckel und die Lipase aus P. aeruginosa LipA besitzt zwar einen Deckel, zeigt allerdings keine Grenzflächenaktivierung. Somit ist die Anwesenheit oder Abwesenheit des Deckels kein struktureller Hinweis zur Unterscheidung zwischen den Carboxylesterasen und Lipasen (Hausmann und Jaeger 2010) Carboxylesterasen Die Carboxylesterasen werden aufgrund ihrer primären Struktur und der biochemischen Eigenschaften in 7 Gruppen (II-VIII) unterteilt (Hausmann und Jaeger 2010). Die meisten Esterasen gehören zu der α/β-hydrolase-faltung Superfamilie. Ausnahmen enthält die Gruppe VIII, die Esterasen mit einem β-lactamase Faltungsmotiv beinhaltet. Im Jahre 2009 waren 696 bakterielle Esterasen in der Enzymdatenbank BRENDA (Schomburg et al. 2004) enthalten und viele von ihnen zeigen keine signifikante Übereinstimmung mit einer der bisher bekannten Esterasefamilien. Einige Vertreter der einzelnen Gruppen sowie einige ihrer Merkmale sind in Tabelle 5 gegenübergestellt.

34 Einführung 17 Bakterielle Esterasen können im Cytoplasma (Droege et al. 2005), im Periplasma (Weadge et al. 2005) oder in der Membran vorhanden sein (von Tigerstrom und Stelmaschuk 1989, Wilhelm et al. 1999) oder sekretiert werden (von Tigerstrom und Stelmaschuk 1989, Xiang et al. 2006). Eine spezifische Funktion der Esterase ist bisher nicht bekannt, sie sind unter normalen Standard- Laborbedingungen nicht überlebenswichtig für die Bakterien (Berger et al. 1998). Sie sind involviert in Prozessen, die eine C-Quelle zugänglich machen, wie die pathogene Infektion, der Pflanzenzellwandabbau oder die Entgiftung (Khalameyzer et al. 1999). Es kommt zum Beispiel zur Esteraseproduktion beim probiotischen Lactobacillus reuteri bei Anwesenheit von Gallensaft und es wird vermutet, dass die Esterase bei der Erkennung von Zellmembranen beteiligt ist (Wall et al. 2007, Whitehead et al. 2008). Andere Esterasen werden durch die Anwesenheit von Wasserstoffperoxid gebildet und helfen dem Bakterium bei der Bewältigung von oxidativem Stress (Baatout et al. 2006). Esterasen sind ebenfalls eingebunden in die Regulation der Kommunikation und Interaktion zwischen den Spezies, sie bauen Signalmoleküle ab (Shinohara et al. 2007, Khalameyzer et al. 1999) oder hydrolysieren Triacylglyceride als Ausgangsstoffe für die Antibiotika-Synthese (lukoshi und Packter 1994). Esterasen sind aufgrund ihrer Fähigkeit, Esterbindungen zwischen der Hydroxyzimtsäure und Zuckern zu hydrolysieren, wichtige Enzyme beim Pflanzenzellwandabbau durch Clostridium und Lactobacillus (Fonaghy et al. 2000, Prates et al. 2001, Wang et al. 2004, Garcia-Conesa et al. 1999). Die einzige identifizierte Esterase im humanpathogenen Helicobacter pylori (Ruiz et al. 2007) ist direkt beteiligt an der Bildung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren und Magenkrebs (Kuster et al. 2006) durch den Abbau der Fette des Magenschleims (Slomiany et al. 1989). Das oft in Krankenhäusern übertragene pathogene Corynebacterium jeikeium besitzt keine eigene Fettsäure-Synthase und spaltet deshalb mit einer Cholesterin-Esterase das Cholesterin im Blut und an extrazellulären Matrixproteinen (Hansmeier et al. 2007, Tauch et al. 2005). Es ist Verursacher von Blutvergiftungen und Herzinnenhautentzündungen. Die LipF aus dem pathogenen Mycobacterium tuberculosis, gehörend zur Gruppe IV der Esterasen, ist ebenfalls ein wichtiger Faktor bei der Infektion des Menschen durch das Bakterium. Als Autotransporter ist die Esterase EstA aus Pseudomonas aeruginosa ebenfalls an der Infektion beteiligt (Camacho et al. 1999, Zhang et al. 2005).

35 Einführung 18 Tabelle 5: Übersicht lipolytische Enzyme I, Esterasen (Gruppe II-VIII) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010). Gruppe Herkunft der Esterase (Proteinnr.) Merkmale II (GDSL) III IV (HSL) V VI Aeromonas hydrophila (P10480) Pseudomonas aeruginosa (33407) Bacillus cereus (Q81AY4) Xanthomonas vesicatoria (Q7X4K7) Streptomyces exfoliatus (Q56008) Kineococcus radiotolerans (A6WEQ4) Clavibacter michiganensis (B0RCM8, B0RFW0) Thermobifida fusca (Q47RJ6, Q47RJ7) Alicyclobacillus acidocaldarius (Q7SIG1) Burkholderia sp. 383 (u.a. Q39FH4) Pseudomonas sp. B11-1 (52270) Bacillus subtilis (68884) Moraxella sp. (P24640) Salmonella typhimurium (Q8ZNL5) Serratia proteamaculans (A8GC20) Rhodobacter sphaeroides (A4WX93, A3PMP7) Spirulina platensis (Q53415) Anabaena variabilis (Q3M6G8) Shewanella amazonensis (A1S771) Rhodoferax ferrireducens (Q21XU9) Enthält die GDSL/SGNH-Esterasen, besitzen kein GXSXG-Motiv am aktiven Zentrum, dafür ein GDS(L)- Tetrapeptid im N-terminalen Bereich; Esterasen enthalten fünf konservierte Sequenzbereiche, GDS(L) mit Ser Block I, Gly in Block II, Asp in Block III und His in Block V Extrazelluläre Enzyme, molekulare Masse von kda, besitzen Ähnlichkeit mit dem menschlichen Blutblättchen-Aktivierungsfaktor Acetylhydrolase (PAF-AH) In dieser Gruppe sind Lipasen (definitionsgemäß) ohne Deckel enthalten z.b. Tfu_0882 und Tfu_0883 aus T. fusca Ähnlich zur Gruppe der Hormonsensitiven Säugetierlipasen, besitzen 3 konservierte Sequenzblöcke, Bock II und III mit den katalytischen AS, Block I mit HGGG Consensus-Sequenz, bevorzugen kurzkettige Substrate und zeigen Esterase- Enzymkinetik, besitzen am aktiven Zentrum eine cap aus 2 separaten helikalen Regionen, spezifische Inhibition Enzyme zeigen auch Homologie zu anderen Enzymgruppen mit dem typischen α/β-faltungsmotiv (Epoxidhydrolase, Dehalogenase, Haloperoxidase), besitzen 3 konservierte Sequenzblöcke, katalytisches Ser in Bock II, Asp und His in Block III, Esterase-Kinetik, kurzkettige Substrate bevorzugt Kleine Enzyme mit kda, bisher nur eine mit 31,6 kda, 40% Sequenzähnlichkeit zu eukaryotischen Lysophospholipasen, 3 konservierte Sequenzblöcke analog zu Gruppe IV und V, bevorzugt kurzkettige Substrate

36 Einführung 19 Fortführung Tabelle 5 Gruppe Herkunft der Esterase (Proteinnr.) Merkmale VII Arthrobacter oxydans (Q01470) Molekulare Masse von ca. 55 kda, hohe Ähnlichkeit zu Streptomyces coelicolor (Q9Z545) Acetylcholinesterase und Darm/Leber Burkholderia sp. 383 (Q398P3) Carboxylesterase, 4 konservierte Sequenzblöcke, Bacillus pumilus (Q66M67) hydrolysieren kurzkettige p-np Ester und Triglyceride, aber auch biotechnologisch interessante Substrate VIII Arthrobacter aurescens (A1RB78) Unterscheiden sich in der Struktur deutlich von den Saccharopolyspora erythraea anderen Gruppen, zeigen Ähnlichkeiten zu β- (A4F8E6) Lactamasen und DD-Peptidasen, Größe ca. 42 kda, Pseudomonas gingeri (B0M0H4) Multimerbildung kann auftreten, hohe Streptomyces anulatus (87861) Lösungsmitteltoleranz, katalytisch aktives Serin befindet sich in SXXK Motiv, Ser und Lys im N- terminalen Block und Tyr bilden aktives Zentrum, zusätzlich wurde eine GXSXG Sequenz am C-Terminus identifiziert Lipasen Überraschenderweise ist die genaue Funktion der Lipase bei Bakterien noch nicht bekannt, da ihre Produktion einer komplexen Regulation unterliegt und sie somit wahrscheinlich nicht nur für die Hydrolyse von Fetten als Energiequelle verantwortlich sind (Hausmann und Jaeger 2010). Die Art der Regulation lässt die Schlussfolgerung zu, dass die Lipasen auch als Virulenzfaktoren auftreten (Degrassi et al. 2008, Devescovi et al 2007, Heurlier et al. 2004, Lewenza et al. 1999, Ulrich et al. 2004) oder ähnlich den Xylan-Esterasen durch die Hydrolyse von Xylan die Schutzbarriere der Wirtszelle zerstören (Khalameyzer et al. 1999). Der die Atemwege infizierende, opportunistisch pathogene Pseudomonas aeruginosa produziert eine Lipase, welche zusammen mit der Phospholipase C Substanzen abbaut, die zur Reduktion der berflächenspannung an den Lungenbläschenmembranen und somit zur Unterstützung der Atmung wichtig sind (Beatty et al. 2005, Schmidt et al. 2007). Isolierte Stämme von P. aeruginosa und Salmonella zeigten untypische Zusammensetzungen der Lipid A Schicht, was sie für die mikrobiellen Abwehrmechanismen des Menschen nicht erkennbar machten und es somit zu häufigeren Erkrankungen kam (Ernst et al. 1999, Guo et al. 1998, Tanamoto und Azumi 2000). Die normale Lipid

37 Einführung 20 A Schicht besteht aus Capron-, Laurin-, Myristin-, Palmitin- und Stearinsäuren, bei den Isolaten wurde allerdings eine Palmitinsäure-Konzentration von bis zu 33% gefunden (Ernst et al. 1999). Ebenso können freie Fettsäuren die normalen Abläufe, wie die Hinderung der Lymphozyten- Proliferation und die Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, im menschlichen rganismus stören (Buttke 1984, Buttke und Cuchens 1984, Hawley und Gordon 1976, Jaeger et al. 1991, Nordstrom et al. 1991, Pourbohloul et al. 1985). Die Anwesenheit einer Lipase bei Propionibacterium acnes unterstützt die Ansiedlung des rganismus in den Talgdrüsenfollikeln der Haut. Durch die Hydrolyse von Glyceriden aus dem Serum werden Fettsäuren freigesetzt, die die Ansiedlung des Bakteriums unterstützen (Burkhart und Burkhart 2003, Gribbon et al. 1993). Eine weitere wichtige Funktion der Lipasen ist der Abbau von lipolytischen Substraten zur Verstoffwechselung. P. aeruginosa YS-7 kann mit Ölgemischen mit einem Wassergehalt von nur 1% zum Wachsen gebracht werden (Shabtai et al. 1991). Microthrix parvicella kann Lipide und Fettsäuren in hohen Konzentrationen in Abwässern abbauen, sowohl aerob als auch anaerob (Nielsen et al. 2002). Die Produktion von Lipasen kann durch die Anwesenheit von Alkanen angeregt werden, allerdings ist der Abbau dieser Substrate noch nicht vollständig aufgeklärt. Selbst wenn die Lipase durch die Alkane induziert wurde, kann sie nicht immer ohne weitere enzymatische Mithilfe die Alkane abbauen (Breuil et al. 1978). Nur sehr wenige Stämme können diese Energiequelle verwerten, Hefestämme noch eher als Bakterienstämme (Margesin et al. 2003). Abbildung 12: Struktur der offenen und geschlossenen Lipase von Burkholderia cepacia BcL. Die offene Kristallstruktur ist blau dargestellt und das geschlossene Homologie-Modell grün, die gelbe Kugel stellt ein Ca 2+ -Ion dar. Die katalytische Triade besteht aus Serin, Histidin und Asparaginsäure (Trodler et al. 2009).

38 Einführung 21 Tabelle 6: Übersicht lipolytische Enzyme II, Lipasen (Grup. I.1-I.8) mit ausgewählten Beispielen (Hausmann und Jaeger 2010). Gruppe Herkunft der Esterase (Proteinnr.) Merkmale I.1 Pseudomonas mendocina (Q8RKT7) Rhodoferax ferrireducens (Q21T36) Vibrio cholerae (u.a. P15493) Chromobacterium violaceum (Q7NUI4) I.2 Burkholderia glumae (Q05489) Pseudomonas KWI-56 (P25275) Burkholderia cepacia (u.a. P22088) Pseudomonas luteola (68551) I.3 Pseudomonas fluorescens Pf1 (Q3KCS9) Pseudomonas sp (Q2KTB3) Serratia marcescens (u.a. Q09KJ5) Uncultered bacterium (A7J993) I.4 Bacillus subtilis (P37957) Bacillus sp. NK13 (B0LW76) Bacillus megaterium (Q8RJP5) Bacillus clausii (Q5WDN0) I.5 Geobacillus zalihae (Q842J9) Bacillus sp. L2 (Q51413) Geobacillus sp. SF1 (Q1L776) Bacillus stearothermophilus (u.a. A0MTM1) Starke Ähnlichkeit zu P. aeruginosa Lipase, molekulare Masse kda, Typ II Sekretionsweg, werden ATPabhängig ins Periplasma transportiert, in die aktive Konformation umgefaltet und in den extrazellulären Raum sekretiert, einige benötigen Faltungsproteine, 2 Asp binden ein Ca 2+ -Ion, das für die katalytisch aktive Struktur benötigt wird, katalytisches His Starke Ähnlichkeit zu B. glumae Lipase, eine etwas größere molekulare Masse als I.1 aufgrund 2 zusätzlicher β-faltblätter, Typ II Sekretionsweg, werden ATP-abhängig ins Periplasma transportiert, in die aktive Konformation umgefaltet und in den extrazellulären Raum sekretiert, einige benötigen Faltungsproteine, 2 Asp binden ein Ca 2+ - Ion, das für die katalytisch aktive Struktur benötigt wird, katalytisches His Molekulare Masse kda, Typ I Sekretionsweg, Ca 2+ - Ion enthalten für katalytische Funktion, näher verwandt mit eukaryotischen Enzymen als mit bakteriellen, das C- terminale Sekretionssignal mit Glycin-reichen Wiederholungen (GGXGXDX(U)X) n kann an das Ca 2+ -Ion binden, welches als Chaperon bei hohen Kalzium- Konzentrationen agiert Molekulare Masse 20 kda, kleinste Lipasen, häufig aus Bacillus sp., enthalten konserviertes AXSXG Pentapeptid, maximale Enzymaktivität bei ph 10,0-11,5, Lipase ist Kalzium-unabhängig und enthält kein Cystein, weisen eine kompakte minimale Hydrolasefaltung auf ohne Deckel und Ca 2+ -Ionen Bacillus Lipasen zeigen nur 15% Ähnlichkeit mit Gruppe I.4, ph ptimum variiert (7,5-9,5), Molekulargewichte ca. 46 kda, wahrscheinlich aufgrund von Insertionen, die eine Zink-Bindungsstelle enthalten, weisen deshalb höhere thermale Stabilität auf

39 Einführung 22 Fortführung Tabelle 6 Gruppe Herkunft der Esterase (Proteinnr.) Merkmale I.6 Staphylococcus hyicus (P04635) Staphylococcus xylosus (Q2TPV1) Staphylococcus warneri (Q5DWE2) Ca. 75 kda großes Präproprotein mit ca. 200 AS am N- terminalen Ende für die effiziente Translokation und mit möglicher Funktion als intramolekulare Chaperone, Staphylococcus aureus (u.a. aktives Enzym ca. 46 kda groß mit breiter P10335) Substratspezifität, ph Stabilität von ph 4 bis 9, einige Lipasen zeigen Aktivitätssteigerung mit Ca 2+ -Ionen und Hemmung durch EDTA, können Polymere bilden, können als Virulenzfaktoren agieren I.7 Streptomyces cinnamoneus (33969) Propionibacterium acnes (u.a. Q59644) Corynebacterium glutamicum Zeigen Ähnlichkeit zu Lipasen der Gruppe I.2 in der Region von AS , Lipase S. cinnamoneus 29,2 kda und P. acnes 36,4 kda, Lipase aus P. acnes besitzt weites Substratspektrum Triacylglyceride und p-np Ester C2-C16 (u.a. Q8NU60) I.8 Pseudoalteromonas haloplanktis (Q3IF07) Hahella chejuensis (Q2SGZ8) Colwellia psychrerythraea (Q48AN1) Pseudoalteromonas tunicata (A4CF12) Neue Gruppe, identifiziert und charakterisiert anhand Lip1 aus P. haloplanktis, 51 kda, gebunden an äußere Bakterienmembran, höhere Aktivität mit langkettigen Estern, Sequenz zeigt keine nähere Übereinstimmung mit anderen lipolytischen Enzymen, eher zu marinen psychrophilen Stämmen, kein Deckel, keine Ca 2+ -Ionen Bindungsstelle, neues Motiv LGG(F/L/Y)STG mit Ser anstatt GXSXG Cutinasen Cutinasen sind die einzigen Enzyme, die das Biopolyester Cutin und das Modellsubstrat Poly-εcaprolacton abbauen können. Sie zeigen einige Eigenschaften von Lipasen (Hydrolyse unlöslicher Substrate) und Esterasen (Hydrolyse von löslichen Substraten). Diese Enzyme werden hauptsächlich von pflanzenpathogenen Pilzen gebildet, es sind aber auch bereits einige Bakterien mit Cutinaseaktivität identifiziert worden. Sie sind die kleinsten Hydrolasen in der α/β-hydrolase Familie (Dutta et al. 2009). Die Enzymklasse der Cutinasen ist eine bisher noch umstrittene Gruppe bei den Hydrolasen. Es gibt einige bekannte und charakterisierte Cutinasen, z.b. die Cutinase aus

40 Einführung 23 Fusarium solani, Thermomyces insolens, Pseudomonas mendocina, Aspergillus oryzae und Thermobifida fusca. Bei der Einteilung der lipolytischen Enzyme wurden die Cutinasen nicht als selbstständige Gruppe deklariert, sondern es erfolgte z. B. aufgrund der Sequenz die Zuordnung der Cutinasen aus T. fusca zur Gruppe III der Esterasen (Hausmann und Jaeger 2010). Bei einem Sequenzalignment zeigten diese Cutinasen Ähnlichkeiten zu Triacylglycerol Lipasen aus Streptomyces albus G und Streptomyces sp. M1 (Kleeberg et al. 2005). Es sollten weitere Untersuchungen erfolgen, um die Zuordnung der Cutinasen bei den lipolytischen Enzymen noch genauer zu versehen. 1.4 Polyethylenterephthalat Synthetische Polymere und die daraus hergestellten Produkte sind aus unserem heutigen Leben nicht mehr wegzudenken. Auch in der Textilindustrie haben die künstlichen Fasern eine große Bedeutung. Speziell Polyesterfasern erlangten in den letzten Jahrzehnten immer mehr Einfluss. Die Produktion dieser Fasern ist in den vergangenen 50 Jahren konstant angestiegen. Im Jahr 2007 waren bereits 76% aller synthetischen Fasern Polyesterfasern. Bei einer jährlichen Produktion von 30,7 Millionen Tonnen waren davon 12,4 Millionen Tonnen Stapelfasern und 18,3 Millionen Tonnen Filamentgarn (Saurer Management AG 2008). Für 2011 wird eine weltweite Produktion von 36 Millionen Tonnen prognostiziert (Chemical Market Associates Inc. 2010). Die PET-Fasern werden weit verbreitet genutzt, sowohl einzeln als auch in Mischungen mit anderen Fasern. Einige ihrer vielen Vorteile, die sie für die Textilindustrie so unverzichtbar machen, sind ihre starke Reißfestigkeit, ihre Beständigkeit und die Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Vielzahl von Chemikalien. Doch besitzen Polyesterfasern auch einige ungünstige Eigenschaften, wie zum Beispiel ihre starke Hydrophobie, eine daraus resultierende geringe Wasseradsorption und sie neigen zum Pilling. Polyethylenterephthalatfasern (PET), die bedeutendsten Polyesterfasern, werden durch Polykondensation aus Terephthalsäure und Ethylenglycol hergestellt (Abbildung 13). CH + H H R C C R CH n Terephthalsäure Ethylenglycol PET Abbildung 13: Polykondensationsreaktion von Terephthalsäure und Ethylenglycol zu Polyethylenterephthalat.

41 Einführung 24 Doch dabei entstehen ebenfalls einige unerwünschte Nebenprodukte, die die negativen Eigenschaften der Polyesterfasern noch verstärken. Dabei handelt es sich um lineare und zyklische ligomere der Ausgangsstoffe. Besonders die Anreicherung von zyklischen Trimeren (Cyclo-tris- Ethylenterephthalat, CTR), welche extrem wasserunlöslich sind, hat die Bildung von Agglomeraten auf den Fasern und eine daraus resultierende Störung bei der Weiterverarbeitung (u.a. beim Färben) zur Folge. Ebenfalls zeigen diese zyklischen Trimere eine Tendenz, sich an metallischen berflächen anzulagern und haben somit auch negative Auswirkungen auf die Färbe- und Veredelungsmaschinerie. Bisher angewandte Methoden zur Entfernung der zyklischen Trimere, wie zum Beispiel der Abbau unter hohen Temperaturen, mit NaH und mittels kationischer Tenside, haben ebenfalls sehr viele negative Auswirkungen auf die Fasern und die Maschinen. Zum Einen vermindert die aggressive Behandlung die Qualität der Polyesterfasern und zum anderen wird ein hoher Gewichtsverlust beobachtet. Weiterhin kommt es neben dem hohen Energieeinsatz durch die Anwendung der Chemikalien zu einer Anhäufung umweltschädigender Abfälle und zu Störungen an den Maschinen (Valk et al. 1970; Senner 1973; Hempel 1979; Grosse et al. 1994; Höhn 2003). Zyklischer PET-Trimer Abbildung 14: Struktur eines zyklischen PET-Trimers Konventionelle PET-Faserbehandlung Die bei der Polykondensation entstehenden niedermolekularen Nebenprodukte sind vielfältig und können sowohl zyklische als auch lineare Verbindungen mit einem Polymerisationsgrad von 2 bis 10 Einheiten sein, wobei nicht alle die weitere Bearbeitung der Textilfaser im gleichen Maße beeinflussen. Die wichtigsten Problemverursacher sind die zyklischen Trimere und im geringen Ausmaß die Tetramere, Pentamere und Hexamere (Valk et al. 1970, Senner 1973, Hempel 1979, Grosse et al. 1994, Höhn 2003). Zyklische und lineare ligomere mit höheren Polymerisationsgraden entstehen nur in kleinen Mengen. In Abhängigkeit vom Faserherstellungsprozess beträgt die Menge

42 Einführung 25 an an der Faser lokalisierten ligomer zwischen 1 bis 3% des Fasergewichtes. Während des Prozesses der Hochtemperatur-Färbung erfolgt ein Austritt von bis zu 70% der PET-ligomer aus der Faser. Durch weitere Färbe- und Abkühlungsprozesse bilden sich ligomerablagerungen auf den Färbemaschinen, welche mit jeder Färbung zunehmen. Die überwiegende Menge der als Ablagerungen vorliegenden ligomere (ca %) bilden eine grobdisperse Aufschwemmung, die von den PET-Produkten mittels Filtration abgetrennt werden kann. Diese so gewonnenen ligomere werden auch als berflächenoligomere bezeichnet und bestehen zu 97 bis 99% aus zyklischen Trimeren. Sie verursachen eine Vielzahl von negativen Beeinträchtigungen bei der Weiterverarbeitung der PET-Ware, eine Verringerung der Qualität des Produktes als auch technische Probleme, wie unter anderem eine Leistungsverringerung der Maschinen, einen höheren Energieverbrauch und längere Stillstandzeiten. Um diese Probleme auf ein Minimum zu reduzieren, wurden in der Vergangenheit bereits einige Verfahren entwickelt (Dugal et al. 1973, Kusch 1974, Baker 1974, Werkes 1975, Keller et al. 1981, Yang und Li 2000, Höhn 2003). alkalische Vorbehandlung bei hohen Temperaturen Die Nachteile dabei sind erhöhte Kosten durch den zeit- und energieaufwendigen Arbeitsschritt, ein Einsatz von umweltschädlichen Chemikalien ebenso wie eine Beschädigung der Textilfasern. Vorbehandlung zur PET-ligomerentfernung mit chlorierten (Methylenchlorid, Perchlorethylen) oder chlorfreiem Lösungsmittel (Dioxan) Dies bietet sich aus umwelttoxikologischen und sicherheitstechnischen Gründen nicht als Alternative an. Einsatz von Dispergatoren (Tenside) zur Verhinderung der Ablagerung von austretenden ligomer Diese Methode führt zu einem höheren Gehalt an organischen Verbindungen im Abwasser. alkalisches Färben Positiv ist dabei eine gleichzeitige Verseifung der ligomere, diese Methode eignet sich aber nicht für alle Textilfärbungen. Nachwäsche als Lösemittelwäsche mit Tetrachlorethen oder Dispergatorwäsche Auch dieses Verfahren führt zu einem höheren Gehalt an organischen Verbindungen in den Abwässern. Nachreinigung als alkalische Verseifung mit Tetraalkylammoniumverbindungen als Katalysator Auch hier treffen die bereits oben genannten Nachteile zu.

43 Einführung 26 Diese Verfahren und auch alle nach dem ligomermobilisierenden Färbeprozess angewandten und beschriebenen Methoden gegen die PET-ligomerdeposition weisen ähnliche wirtschaftliche, technische und ökologische Nachteile, wie ein hoher zusätzlicher Energieeinsatz, die Verwendung von produkt-, umwelt- und personenschädigenden Chemikalien und besonders deren Entsorgung, auf. Sowohl aus diesen Gründen, aber auch aufgrund des drastischen Gewichtsverlusts der PET-Fasern und der Verschlechterung ihrer Qualität während der Bearbeitung (Zeronian und Collins 1989, Shukla et al. 1997), wurde in den letzten Jahren zunehmend nach einem biotechnologischen Prozess zur ligomerbearbeitung und -entfernung geforscht, um die traditionellen Faserverarbeitungsmethoden mit ihren Nachteilen zu ersetzen (Gübitz und Cavaco-Paulo 2001) Charakterisierung von PET Bei der PET-Herstellung erfolgen anschließend verschiedenste Modifikationsschritte, welche sich auf die Eigenschaften des PET-Textiles oder Films auswirken. Während des Schmelzspinnverfahrens (Abbildung 14) wird die Spinnmasse geschmolzen und anschließend durch eine beheizte Spinndüse mit einer Geschwindigkeit von 4000 m/min gepresst. Diese Spinndüsen weisen eine Größe zwischen 1-10 cm auf und bestehen aus bis zu Spinndüsenlöchern mit einem Durchmesser zwischen 0,05 und 1 mm (Abbildung 15). Durch die anschließende Luftkühlung erstarren die Fibrillen und es erfolgt das Verstrecken, was eine Neuanordnung der PET-Ketten in der Fibrille zur Folge hat. Abbildung 15: Schematische Darstellung des Schmelzspinnverfahrens von PET-Fibrillen (links) und Darstellung einer beheizten Schmelzspinndüse (Jahreiß 2005).

44 27 Einführung Das Verstrecken erfolgt entweder unter sehr hohen Geschwindigkeiten beim Abziehen von der Schmelzspinndüse oder indem das gesponnene Filament vor dem Aufrollen über mehrere verschieden große Rollen geführt wird. Beim Verstrecken werden die zuvor wirr durcheinander liegenden PET-Ketten in Faserrichtung und auch zueinander ausgerichtet (Abbildung 16). Dadurch bilden sich auch Wechselwirkungen zwischen den Ketten aus, wie die Wasserstoffbrückenbindungen (Abbildung 17), und es entstehen teilkristalline Bereiche, welche die Festigkeit der Fasern deutlich erhöhen. Diese Bindungen sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht stabil und würden beim Waschen zerstört werden, deshalb erfolgt anschließend eine Hitzefixierung. Abbildung 16: Anordnung der PET-Ketten vor (links) und nach (rechts) dem Verstrecken unter Ausbildung von geordneten kristallinen Bereichen (Jahreiß 2005). Abbildung 17: Darstellung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den durch Verstrecken entstandenen geordneten PET-Ketten (grün). Verstrecken H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H

45 Einführung 28 Die Eigenschaften von PET-Fasern, wie Glanz, Transparenz, Farbeindruck (dunkler/heller), Schmutzsichtbarkeit, Griff (weicher/härter), eine Volumenerhöhung und Wärmeisolierung, werden ebenfalls durch ihren Faserquerschnitt bzw. der Faseroberfläche beeinflusst (Abbildung 18). Eine weitere Modifikation zur ptimierung der Volumenzunahme, der elastischen Dehnung, besserer Wärmeisolierung (durch Lufteinschlüsse), des flauschigen Griffs und zur besseren Feuchtigkeitsaufnahme für die Herstellung von elastischen Bekleidungswaren ist die Texturierung. Dabei werden die zuvor glatten Synthesefasern mechanisch gekräuselt und somit liegen nun Faserschlingen zwischen der Haut und dem Kleidungsstück, was zur Verbesserung der Trageeigenschaften führt (Abbildung 18). Weiterhin hat die Modifikation eine höheren Feuchtigkeitsaufnahme und einen erhöhten Lufteinschluss zur Folge, hingegen wird Glanz und Pilling vermindert (Jahreiß 2005). Abbildung 18: Darstellung möglicher Faserquerschnitte und berflächen (links) und die PET-Fasern vor und nach dem Texturieren (rechts) (Jahreiß 2005). Die Textilveredelung, ein Hauptgebiet der Textilchemie, umfasst sämtliche Arbeitsprozesse, die die äußeren Eigenschaften der Textilien verschönern, wie Färben, Bleichen, Bedrucken, sowie Maßnahmen, die ihren Gebrauchswert steigern (Pflegeleichtausrüstung, Knitterfestmachen), sowie Imprägnierung und Silikonisieren (weicher und geschmeidiger, durch Minimierung der Reibung der Fasern untereinander). Diese Maßnahmen werden im unversponnenen Zustand der Textilfaser ( in der Flocke ) durchgeführt. Dazu zählt ebenfalls das Finish oder auch Ausrüstung genannt, die letzte Bearbeitung von Textilien. Es dient zur Verschönerung, Hervorhebung oder Unterdrückung bestimmter Eigenschaften. Dazu zählen unter anderem Waschen, Bleichen, Färben, Bedrucken, Prägen, Imprägnieren und Hydrophobieren (d.h. wasserabweisend machen, z.b. durch Aluminiumsalze oder Paraffinprodukte), knitterfest machen, Mattieren (z.b. durch Einschlüsse von Titandioxid in die Faser), antimikrobiell machen (durch Zusätze von z.b. Bisphenolen oder

46 Einführung 29 Hexachlorophen; wodurch es zu weniger Hautpilzen und Körpergeruch kommt) und schwerentflammbar machen (z.b. durch Borax oder Titankomplexe) (Jahreiß 2005). PET besteht aus kristallinen und amorphen Bereichen und weist somit sowohl eine Glasübergangstemperatur (für die amorphen Bereiche) als auch eine Schmelztemperatur (für die kristallinen Bereiche) auf. Die Glasübergangstemperatur (T g ) ist die Temperatur, bei der ganz oder teilweise amorphe Polymere vom glasigen oder hartelastischen, spröden Zustand in den gummielastischen, flexiblen Zustand übergehen. T g wird daher auch "Erweichungstemperatur" genannt und ist für jeden Kunststoff spezifisch (Abbildung 19). Da Wärme nichts anderes als kinetische Energie ist, bewegen sich unterhalb der Glasübergangstemperatur die Molekülketten kaum. Bei der Erwärmung des Kunststoffes bewegen sie sich immer mehr, halten aber noch zusammen, bis schließlich mit dem Erreichen der Glasübergangstemperatur sich längere Abschnitte der Molekülketten frei bewegen können. Die bei Temperaturen oberhalb der Glasumwandlungstemperatur (ca. 80 C) beweglichen Molekülketten kristallisieren bei ca. 160 C aus (Abbildung 19, Kristallisationspeak), bevor bei ca. 255 C der endotherm ablaufende Schmelzvorgang beginnt (Abbildung 19, Schmelzpeak). PET kann mit Hilfe der Differentialrasterkalorimetrie (DSC) bezüglich der Glasumwandlungstemperatur, dem Schmelzverhalten, der Kristallinität und des Kristallisationsverhaltens charakterisiert werden (Abbildung 19). Dabei erfolgt mit der Probe eine lineare Erhitzung und anhand der Enthalpieänderungen bezüglich einer Referenz kann ein wie in Abbildung 19 dargestelltes Diagramm erstellt werden. Durch die Integration des Schmelzpeaks kann die Kristallinität der vorliegenden PET Probe berechnet werden. T g Kristallistionspeak Schmelzpeak Abbildung 19: DSC-Kurve einer PET-Folie (

47 Einführung 30 Die Glasübergangstemperatur hängt im Wesentlichen von der Struktur der Polymere ab. Die Flexibilität der Hauptkette ist einer der wichtigsten Faktoren. Ein Kunststoff hat eine niedrige Glasübergangstemperatur, wenn sich die Molekülketten bei geringen Temperaturen schon von sich aus gut bewegen können. Das bedeutet, dass Polymere, die aus aliphatischen Bausteinen aufgebaut sind, eine geringere Glasübergangstemperatur besitzen als Polymere, welche aus aromatischen Monomeren, wie der Terephthalsäure, zusammengesetzt sind. Bei PET handelt es sich um ein Polymer, das sowohl aliphatische als auch aromatische Bestandteile besitzt und eine Glasübergangstemperatur von ca. 80 C Biofunktionalisierung von PET In den letzten Jahrzehnten erfolgten verschiedenste Studien über die Biofunktionalisierung von Polyethylenterephthalat, eine Übersicht darüber gibt Zimmermann und Billig (2011). Zunächst wurde noch angenommen, dass aromatische Polyester, also auch PET, resistent gegenüber einem hydrolytischen Abbau sind (Kint und Munoz-Guerra 1999, Müller et al. 2001). Ferner erfolgten Veröffentlichungen von verschiedenen Autoren, die keine enzymatischen Effekte auf den PET-Fasern nachweisen konnten (Tokiwa und Suzuki 1977, Levefre et al. 1999). Weitere Untersuchungen hingegen dokumentieren die Möglichkeit der biokatalytischen Modifikation der PET-Fasern. Veränderungen in den physikalischen Eigenschaften wie Reißfestigkeit, Viskosität und Dehnungsverhalten von PET-Film und Fasern wurde nach der Inkubation mit einer Enzym- Präparation aus Cladosporium cladosporioides festgestellt (Sato 1983). Ferner wurde von da et al. (1999) beschrieben, dass die Inkubation mit Arthrobacter und Trichosporon Spezies ebenfalls Modifikationen der PET-Fasern zur Folge hat. Ebenfalls konnte eine Verbesserung der Wasserbenetzbarkeit und der Absorptionseigenschaften sowie eine Verbesserung der Anfärbbarkeit von PET-Textilien und Fasern nach einer enzymatischen Hydrolyse mit bakteriellen Cutinasen aus Pseudomonas mendocina (Hsieh und Cram 1998, Hsieh et al. 2003, Bott et al. 2003, Kellis et al. 2001, Yoon et al. 2002, Dyson et al. 2005), aus Thermobifida fusca (Alisch et al. 2004, Alisch-Mark et al. 2006, Heumann et al. 2006, Feuerhack et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009, Brueckner et al. 2008) und mit eukaryotischen Cutinasen aus Fusarium solani ( Neill und Cavaco-Paulo 2004, Silva et al. 2005, Alisch-Mark et al. 2006, Heumann et al. 2006, Araujo et al. 2007, Neill et al. 2007, Nimchua et al. 2007, Nimchua et al. 2008) und Thermomyces insolens (Abo et al. 2004, Svendsen et al. 2005, McCloskey und Jump 2005, Liu et al. 2008) nachgewiesen werden (Tabelle 7). Die Enzyme bewirken dabei durch die partielle Hydrolyse von Esterbindungen und die dadurch entstehenden Hydroxyl- und Carboxylgruppen eine Zunahme der hydrophilen Eigenschaften auf der berfläche der PET-Fasern. Mit Hilfe einer solchen Behandlung erhält man bei Polyestertextilien verbesserte

48 Einführung 31 Eigenschaften, wie zum Beispiel größere Bindung von kationischen Farbstoffen, einen Depilling Effekt, die Entfernung von Polyesterschlichte und eine bessere Entfernbarkeit von Ölflecken. In weiteren Untersuchungen wurden Textilien und Fasern mit eukaryotischen Lipasen aus Aspergillus sp. (Fischer-Colbrie et al. 2004, Heumann et al. 2006, Wang et al. 2008), aus Thermomyces lanuginosus (Almansa et al. 2008, Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009), aus Candida antarctica (Anderson et al. 1999, Khoddami et al. 2001, Lee und Song 2010, Kim und Song 2006), mit der bakteriellen Lipase aus Burkholderia cepacia (Heumann et al. 2006, Kim und Song 2006) und einer tierischen Lipase (Kim und Song 2006, Kim und Song 2008, Hsieh und Cram 1998) behandelt und dabei eine Erhöhung der Hydrophilie erzielt. Weiterhin konnte eine Verbesserung der Eigenschaften der PET-Fasern durch die Inkubation mit Esterasen und Proteasen bewiesen werden (Kontkanen et al. 2006, Zhang et al. 2004, Zhang et al. 2006, Liebminger et al. 2007, Kim und Song 2010). Abbildung 20: Darstellung der chemischen Struktur der Polyethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Trimere und der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011). Neben den PET-Textilien wurden in den letzten Jahren auch Studien zur Modifikation und zum Bioabbau von PET-Folien, welche unter anderem in der Verpackungsindustrie Anwendung finden, durchgeführt. Dabei erfolgte mit den bereits benannten Cutinasen aus F. solani (Vertommen et al. 2005, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina (Ronkvist et al. 2009), T. fusca (Müller et al. 2005, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009) und T. insolens (Abo et al. 2004, Ronkvist et al. 2009) die partielle Hydrolyse der Folien unter verschiedenen Bedingungen (Tabelle 5). Ebenfalls waren die Lipase aus T. lanuginosus (Almansa et al. 2008, Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009) und die Esterase aus C. cladosporioides (Sato 1983) in der Lage, den PET-Film zu modifizieren. Diese hydrophilen PET-Filme werden ferner für medizinische Anwendung genutzt.

49 Einführung 32 Abbildung 21: Darstellung der chemischen Struktur der Polytrimethylenterephthalat Polymerkette, der zyklischen Dimere und der enzymatisch freigesetzten Hydrolyseprodukte (Zimmermann und Billig 2011). Der direkte Abbau von zyklischen PET-Trimeren erfolgte bereits mit den Cutinasen aus T. fusca (Chen et al. 2010) und T. insolens (Andersen et al. 1999, Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Abo et al. 2004, Jump und McCloskey 2004, Svendsen et al. 2005, Figueroa et al. 2006). Für Screening-Studien, die ptimierung der Hydrolysebedingungen und kinetische Studien wurden in den letzten Jahren ebenfalls diverse kurzkettige Modellsubstrate eingesetzt (Abbildung 20-22) (Andersen et al. 1999, Kellis et al. 2001, Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Jump et al. 2004, Abo et al. 2004, Zhang et al. 2004, Dyson et al. 2005, Svendsen et al. 2005, Figueroa et al. 2006, Heumann et al. 2006, Michels et al. 2006, Pütz 2006, Zhang et al. 2006, Liebminger et al. 2007, Eberl et al. 2008, Wang et al. 2008, Eberl et al. 2009, Chen et al. 2010). Nach der Behandlung der PET-Textilien oder -Filme kommen verschiedenste analytische Methoden zur Charakterisierung der modifizierten berfläche zur Anwendung. Dabei wird zwischen der direkten und der indirekten berflächenanalytik unterschieden. Abbildung 22: Darstellung der chemischen Struktur der angewandten Polyethylenterephthalat Modellsubstrate (Zimmermann und Billig 2011).

50 Tabelle 7: PET Biofunktionalisierung und analysierte Effekte (Zimmermann und Billig 2011). Enzym Cutinase Vorkommen Fusarium solani Pseudomonas mendocina Thermobifida fusca Substrat Textilien Film PET-Trimer Textilien, Fasern DET Film Textilien, Fasern Film (PET; PTT) CTR, BETEB, BHPT, zyklische PTT Dimer, BHET, PET Trimer Effekt bei PET Hydrolyse, erhöhte Hydrophilie, erhöhte Anfärbbarkeit Hydrolyse, Abbau, Gewichtsverlust, Änderung der berflächeneigenschaften Hydrolyse erhöhte Hydrophilie, Gewichtsverlust, erhöhte Anfärbbarkeit, Änderung der berflächeneigenschaften Hydrolyse Hydrolyse, Änderung der berflächeneigenschaften, Gewichtsverlust Hydrolyse, erhöhte Hydrophilie, erhöhte Anfärbbarkeit, Gewichtsverlust Gewichtsverlust, erhöhte Hydrophilie Hydrolyse Literatur Neill und Cavaco-Paulo 2004, Silva et al. 2005, Alisch-Mark et al. 2006, Heumann et al. 2006, Araujo et al. 2007, Neill et al. 2007, Nimchua et al. 2007, Nimchua et al Vertommen et al. 2005, Ronkvist et al Heumann et al. 2006, Eberl et al Hsieh und Cram 1998, Hsieh et al. 2003, Bott et al. 2003, Kellis et al. 2001, Yoon et al. 2002, Dyson et al Kellis et al. 2001, Dyson et al Ronkvist et al Alisch et al. 2004, Alisch-Mark et al. 2006, Heumann et al. 2006, Feuerhack et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009, Brueckner et al Müller et al. 2005, Eberl et al. 2008, Eberl et al Heumann et al. 2006, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009, Chen et al Einführung 33

51 Fortführung Tabelle 7 Enzym Lipase Vorkommen Thermomyces insolens Schweinepankreas Burkholderia cepacia Candida antarctica Thermomyces lanuginosus Aspergillus sp. Substrat Textilien, Fasern DET, BEB, PET Trimer, CTR Film Textilien Textilien, PET Trimer Textilien, Fasern BEB, DET Textilien, Fasern, Film (PET; PTT) BHPT, BHET, PET Trimer Textilien, PET Trimer Effekt bei PET Hydrolyse, erhöhte Hydrophilie, erhöhte Anfärbbarkeit, Gewichtsverlust Hydrolyse Hydrolyse, Änderung der berflächeneigenschaften, Gewichtsverlust erhöhte Hydrophilie, erhöhte Anfärbbarkeit, Änderung der berflächeneigenschaften Hydrolyse, erhöhte Hydrophilie Hydrolyse, erhöhte Hydrophilie, Änderung der berflächeneigenschaften Hydrolyse, erhöhte Hydrophilie Hydrolyse Hydrolyse, erhöhte Hydrophilie Literatur Abo et al. 2004, Svendsen et al. 2005, McCloskey und Jump 2005, Liu et al Andersen et al. 1999, Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Abo et al. 2004, Jump und McCloskey 2004, Svendsen et al. 2005, Figueroa et al Abo et al. 2004, Ronkvist et al Kim und Song 2006, Kim und Song 2008, Hsieh und Cram 1998 Heumann et al. 2006, Kim und Song 2006 Anderson et al. 1999, Khoddami et al. 2001, Lee und Song 2010, Kim und Song 2006 Almansa et al. 2008, Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2008, Eberl et al Eberl et al. 2008, Eberl et al Fischer-Colbrie et al. 2004, Heumann et al Einführung 34

52 Fortführung Tabelle 7 Enzym Esterase Protease Vorkommen Aspergillus oryzae Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis Cladosporium cladosporioides Thermobifida fusca Melancarpus albomyces Schweineleber Penicillium citrinum Papain Substrat Textilien, DP PET Dimer, PET Nanopartikle, Dialkylphthalate Film, Fasern CTR, PET Nanopartikle Textilien Fasern, DET Textilien, PET Trimer Textilien Effekt bei PET Hydrolyse, erhöhte Hydrophilie, erhöhte Anfärbbarkeit, Gewichtsverlust Hydrolyse Hydrolyse, Änderung der physikalischen Eigenschaften Hydrolyse erhöhte Hydrophilie, erhöhte Anfärbbarkeit Hydrolyse, Änderung der Faseroberflächen Hydrolyse, erhöhte Hydrophilie Hydrolyse, erhöhte Hydrophilie Literatur Wang et al Pütz 2006, Michels et al Sato et al eser et al. 2010, Billig et al Kontkanen et al Zhang et al. 2004, Zhang et al Liebminger et al Kim und Song 2010 Einführung 35

53 Einführung 36 Zur direkten berflächenanalytik zählen unter anderem XPS (Röntgenphotoelektronenspektroskopie), bekannt auch als ESCA (Elektronenspektroskopie für chemische Analyse), FTIR (Fourier-Transformations-Infrarotspektrometrie), SEM (Rasterelektronenmikroskopie) bzw. ESEM (Umgebungsrasterelektronenmikroskopie) und AFM (Atomkraftmikroskopie). Während der XPS Analyse wird die elementare Zusammensetzung der PET berfläche in einem Bereich von 10 nm detektiert und die spezifischen funktionellen Gruppen nachgewiesen. Enzymatische Modifikationen durch Hydrolasen wurden bereits mehrfach bestätigt (Vertommen et al. 2005, Feuerhack et al. 2008, Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2009), allerdings ist eine vorherige Reinigung der PET-Filme notwendig, um verfälschende Proteinverunreinigungen zunächst zu entfernen (Vertommen et al. 2005, Feuerhack et al. 2008). Mit der FTIR Analyse werden ebenfalls chemische Veränderungen auf der PET-berfläche nachgewiesen. Mit Hilfe infraroter Strahlung werden die Moleküle in ein energetisch höheres Niveau versetzt und die bei der Rückkehr in den nicht angeregten Zustand freiwerdende Strahlung wird analysiert und gibt Rückschlüsse über die Zusammensetzung der Probe (Goddard und Hotchkiss 2007). Änderungen in der chemischen Struktur von PET-Filmen nach einer enzymatischen Behandlung wurden mittels FTIR bereits von Donelli et al nachgewiesen. Das SEM nutzt einen Elektronenstrahl, um die berfläche abzutasten und somit ein dreidimensionales Abbild zu erschaffen. Damit können Veränderungen wie Ablagerungen oder Löcher nachgewiesen werden. Fasermodifikationen wurden bereits bestätigt durch eine Schweineleber Esterase (Zhang et al. 2004, Zhang et al. 2006), Lipasen von C. antarctica und aus Schweineleber (Lee und Song 2010, Kim und Song 2006) und Cutinasen aus P. mendocina und T. insolens (Kellis et al. 2001, Yoon et al. 2004). Die Cutinase aus T. insolens bildete während der Enzymbehandlung von PET-Filmen viele Löcher und somit eine rauere berfläche (Ronkvist et al. 2009). Nach der Inkubation von PTT- (Polytrimethylenterephthalat) Fasern mit der Cutinase aus T. fusca zeigte sich hingegen keine berflächenveränderung per ESEM (Eberl et al. 2008, Brueckner et al. 2008). Die Abtastung der berfläche beim AFM erfolgt mit einer dünnen Nadel, welche einen Laserstrahl aussendet. Der von der berfläche reflektierte Laserstrahl wird von einem Photodetektor aufgenommen und in eine berflächenaufnahme umgewandelt. Bisher wurde per AFM die berflächenveränderung von PET- Fasern nach der Behandlung mit der Cutinase aus T. fusca nachgewiesen (Feuerhack et al. 2008). Bei der indirekten berflächenanalyse wird die Modifikation mit Hilfe weiterer Agenzien detektiert. Die gesteigerte Hydrophilie der Textilien wird mittels Kontaktwinkelmessung, Steighöhenbestimmung, Tropfentest, Flüssigkeitsaufnahmekapazität, Feuchtigkeitsaufnahme und Färbetests mit anschließender Farbintensitätsmessung nachgewiesen. Für diese Analysemethoden ist es ebenfalls wichtig, dass das noch verbliebene Enzym an der berfläche vor dem Nachweis entfernt wird, da sonst verfälsche Ergebnisse auftreten (Vertommen et al. 2005, Brueckner et al. 2008, Donelli et al. 2009). Bei der Kontaktwinkelmessung wird der auftretende Winkel eines Wassertropfens auf einer

54 Einführung 37 festen berfläche bestimmt. Je kleiner der Winkel ist, desto hydrophiler ist die berfläche (ca ), ab 90 gilt der Feststoff als hydrophob und ab ca. 160 als superhydrophob, was auch als Lotuseffekt bekannt ist. Enzymatisch behandelte PET-berflächen wurden unter anderem von Hsieh und Yu 1992, Hsieh 1995, Yoon et al. 2002, Heumann et al. 2006, Donelli et al und Lee und Song 2010 mit dieser Methode analysiert. Bei der Steighöhenbestimmung wird die Wasseraufnahme eines Textilstreifens, der mit einem Ende in eine Flüssigkeit getaucht ist, nach definierten Zeitabständen in Zentimetern bestimmt. Eine hohe Steighöhe geht einher mit einer hydrophilen berfläche des PET-Textils (Fischer-Colbrie et al. 2004, Alisch-Mark et al. 2006, Müller 2006). Eine ähnliche Methode zum Nachweis der Hydrophilie ist der Tropfentest, bei dem der Zeitabstand von der Aufbringung eines definierten Tropfens Flüssigkeit auf ein PET-Textil bis zur vollständigen Aufnahme des Tropfen in das Textil gemessen wird (Heumann et al. 2006, Brueckner et al. 2008, Liu et al. 2008). Das Verhältnis an Flüssigkeit, das ein trockenes PET-Textil maximal aufnehmen kann, zum Textil wird als Flüssigkeitsaufnahmekapazität bezeichnet. Die Flüssigkeitsaufnahme hingegen ist die Menge an Wasser, welche eine trockene Faser oder Textil aus der Luft mit definierter Feuchtigkeit absorbiert kann. Beide Methoden verdeutlichen Veränderungen in den Absorptionseigenschaften von modifizierten PET-Textilien (Hsieh et al. 1996, Hsieh und Cram 1998, Kim und Song 2006, Lee und Song 2010). Aufgrund der eingefügten hydrophilen funktionellen Gruppen werden die Textilien verstärkt durch kationische oder reaktive Farbstoffe angefärbt. Die Brillianz der Farbe kann durch eine Farbintensitätsmessung bestimmt werden und somit indirekt die Hydrophilie nachweisen (Yoon et al. 2001, Alisch et al. 2004, Neill und Cavaco-Paulo 2004, Brueckner et al. 2008, Eberl et al. 2009). Die enzymatische Hydrolyse kann nicht nur durch die Modifikationen auf der berfläche nachgewiesen werden, sondern auch freigesetzte Hydrolyseprodukte können mit verschiedensten Methoden analysiert werden. Da diese wasserlöslichen Produkte Derivate der Terephthalsäure bzw. Terephthalsäure direkt sind, können sie einfach im ultravioletten Wellenlängenbereich von nm spektrophotometrisch detektiert werden (Kellis et al. 2001, Alisch et al. 2004, Neill und Cavaco-Paulo 2004). Da enthaltene Proteine die UV Messung beeinflussen, dient dieser Nachweis nur zum Screening nach PET Aktivität. Terephthalsäure kann ebenfalls mittels Dünnschichchromatographie nachgewiesen werden (Fischer-Colbrie et al. 2004, Pütz 2006, Liebminger et al. 2007). Die Bestimmung der Konzentrationen der verschiedenen Hydrolyseprodukte; u. a. TPA, MHET und BHET; freigesetzt aus PET-Textilien, Filmen, zyklischen PET-Trimeren und weiteren Modellsubstraten kann per RP-HPLC (Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) erfolgen (Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Fischer-Colbrie et al. 2004, Vertommen et al. 2005, Figueroa et al. 2006, Heumann et al. 2006, Eberl et al. 2008, Eberl et al. 2009, Ronkvist et al. 2009, Chen et al. 2010). Terephthalsäure einzeln kann auch mittels Fluoreszenz-Spektroskopie detektiert

55 Einführung 38 werden, dazu erfolgt zunächst die Bildung von Hydroxyterephthalsäure (HTA), welche bei 329 nm angeregt und bei 425 nm die freigesetzte Emissionsstrahlung gemessen wird ( Neill und Cavaco- Paulo 2004, Nimchua et al. 2007). Die freigesetzte TPA kann ebenfalls mittels Titration mit NaH nach der enzymatischen Hydrolyse nachgewiesen werden (Kim und Song 2008, Kim und Song 2010). Für kinetische Studien zur Charakterisierung verschiedener PET-Hydrolasen erfolgte auch schon die Anwendung eines ph-staten um die Säurefreisetzung über einen längeren Zeitraum zu detektieren (Ronkvist et al. 2009). Bei den Untersuchungen mit den verschiedenen PET-Hydrolasen wurde eine Korrelation der enzymatischen Abbaurate mit dem Temperaturunterschied zwischen der Glasübergangstemperatur T g (amorphe Bereiche) bzw. der Schmelztemperatur T m (kristalline Bereiche) und der Hydrolysetemperatur identifiziert. Da die Polymerketten in der Nähe dieser charakteristischen Temperaturen deutlich mobiler sind, können sie schneller erreicht und hydrolysiert werden durch die PET-Hydrolasen. Deshalb sollten die PET Hydrolysen nahe der T g von amorphen PET erfolgen (Witt et al. 1997, Marten et al. 2003, Marten et al. 2005) PET-Hydrolasen In den letzten Jahren wurden verschiedene Enzymgruppen für eine enzymatische Hydrolyse von PET Substraten eingesetzt, mit unterschiedlichen Abbauraten als Folge. Die am häufigsten verwendeten Enzyme gehören zur Gruppe der Cutin Hydrolasen (EC ), bekannt auch als Cutinasen (Tabelle 5). Die am häufigsten eingesetzten und somit am besten charakterisierten PET-Cutinasen sind die rekombinant produzierten Wildformen oder bereits optimierten Mutanten isoliert aus den Bakterienstämmen Pseudomonas mendocina (zuvor Pseudomonas putita), Thermobifida fusca und den eukaryotischen Stämmen Fusarium solani und Thermomyces insolens. Bei den drei zuerst genannten Enzymen handelt es sich definitiv um Cutinasen, da diese Enzyme nachgewiesene hydrolytische Aktivität gegenüber dem Biopolyester Cutin zeigten (Sebastian et al. 1987, Kleeberg et al. 2005, Purdy und Kolattukudy 1973, Purdy und Kolattukudy 1975). Die Cutinase aus T. insolens wird von der ersten literarischen Erwähnung an als Cutinase bezeichnet, einen eindeutigen Nachweis anhand von Daten sind die Autoren aber bisher schuldig geblieben (Sandal et al.1995, Andersen et al. 1999, Riegels et al. 2001, Hooker et al. 2003, Abo et al. 2004, Svendsen et al. 2005, Figueroa et al. 2006, Ronkvist et al. 2009). Trotz dieses fehlenden Nachweises wird für die nachfolgende Darstellung in Übereinstimmung mit der Literatur weiterhin die Hydrolase als Cutinase bezeichnet.

56 Einführung 39 Tabelle 8: Vergleich der PET-Hydrolasen von F. solani (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009), T. insolens (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009) und T. fusca (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008). F. solani T. insolens P. mendocina T. fusca Anzahl der Aminosäuren Molekulargewicht 22 kda kda 30 kda 28 kda Isoelektrischer Punkt 7,2 8 nb 6,43 ph ptimum 6,5-8,5 8,5-9,5 9,0-9,5 6,5-8,0 Temperatur ptimum 50 C C 50 C C Katalytische Triade Ser120 Asp175 His188 Ser140 Asp195 His208 Ser126 Asp176 His206 Ser132 Asp176 His210 GXSXG Motiv G-Y-S-Q-G G-Y-S-Q-G G-H-S-Q-G G-H-S-M-G α-helices / β-faltblätter 5 / 5 Nb 7 / 9 Nb nb: nicht bestimmt Die wichtigsten Informationen über die vier Cutinasen sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Es ist deutlich ersichtlich, dass alle Enzyme eine ähnlich kleine Größe zwischen 20 und 30 kda aufweisen, ein neutrales bis leicht alkalischen ph ptimum und ein thermophiles Temperatur ptimum besitzen. Die katalytische Triade besteht bei allen vier Cutinasen aus den Aminosäuren (AS) Serin, Asparaginsäure und Histidin, natürlich an verschiedenen Positionen im Protein, aber dennoch in einem Abstand von maximal AS. Das spezifische Hydrolase-Motiv ist bei den beiden eukaryotischen Cutinasen identisch, bei den bakteriellen Cutinasen unterscheidet es sich nur in einer flankierenden Aminosäure. Die Cutinase aus F. solani ist das am besten untersuchte Enzym für den PET-Abbau. Es wurden bereits mehrere Reviews veröffentlicht, die eine Übersicht über die wichtigsten katalytischen und strukturellen Eigenschaften der Cutinase beinhalten. Die angewandten Methoden für die Cutinaseinduktion, die rekombinante Produktion und Aufreinigung wurden in dem Übersichtsartikel von Carvalho et al beschrieben. Die F. solani Cutinase ist aufgebaut aus 197 Aminosäuren, besitzt ein Molekulargewicht von 22 kda und vier nichtvariable Cysteine bilden zwei Disulfidbrücken. Die Cutinase gehört zur Klasse der Serin-Esterasen und zeigt die typische α/β-hydrolase Faltung. Die katalytische Triade ist zusammengesetzt aus Ser120, Asp175 und His188. Mit einer ortsspezifischen Mutagenese wurden Studien über die funktionellen Interaktionen mit verschiedenen Substraten und zur Identifikation der Struktur und Bindungen am aktiven Zentrum durchgeführt. Es sind viele Daten über die thermale Stabilität der Cutinase in eingekapselten Präparationen und in kovalent

57 Einführung 40 gebundenen oder absorbierten Strukturen beschrieben worden. Hingegen gibt es bisher keine Informationen über die thermale Stabilität des frei gelösten Enzyms (Carvalho et al. 1999). Eine Cutinase Präparation von Genencore International, Inc. (GCI 2002/1410) wurde zum ersten Mal für die Hydrolyse von Polyester eingesetzt. Freigesetzte Hydrolyseprodukte von PET-Textilien wurden durch die Fluoreszenzdetektion von Hydroxyterephthalat nachgewiesen, ebenso die Steigerung der Hydrophilie durch die Anfärbung und Farbintensitätsbestimmung (Andre und Charmoille 1999, Neill und Cavaco-Paulo 2004) wurde eine granulierte Cutinase von Unilever Research and Development Laboratory, Vlaardingen, gelöst in Puffer, eingesetzt und war in der Lage aromatische Hydrolyseprodukte vom einem amorphen PET-Film (APET; 4,1% Kristallinität) und von PET Granulat (GPET; 13,7% Kristallinität) während einer 5-tägigen Inkubation bei 30 C freizusetzen, detektiert durch RP-HPLC. Die Cutinase setzte mehr Hydrolyseprodukte vom geringer kristallinen APET und nur Spuren an Produkten vom höher kristallinen biaxial orientierten PET (PET; 48,2% Kristallinität) frei. Die Hydrolyseprodukte wurden identifiziert als TPA (R t : 11,0 min), MHET (R t : 12,3 min) und BHET (R t : 12,9 min). Das Haupthydrolyseprodukt war MHET, aber das Verhältnis von MHET zu TPA war abhängig vom Verhältnis von Enzym zum Substrat. Zusätzlich wurden höher molekulare Hydrolyseprodukte während der Inkubation freigesetzt, allerding konnten die Produkte zu diesem Zeitpunkt nicht strukturell identifiziert werden. Veränderungen auf der Polyesteroberfläche wurde detektiert mittels einer ESCA-Analyse und zeigten Modifikationen auf dem PET-Film (Vertommen et al. 2005). Aus der Kultivierung eines neuen Fusarium sp. wurde eine Rohenzymlösung gewonnen, die hydrolytische Aktivität gegenüber PET-Fasern bei 30 C besaß und freigesetzte aromatische Produkte wurden mittels Fluoreszenz-und UV-Absorbtionsmessung nachgewiesen (Nimchua et al. 2007, Nimchua et al. 2008). Die genetisch modifizierte F. solani Cutinase, erhalten durch die Substitutionen L81A und L182A, zeigte eine gesteigerte Polyesteraktivität gegenüber PET-Textilien. Die mit Hilfe von ortsspezifischen Mutationen eingeführten Strukturen am aktiven Zentrum unterstützten die Stabilisierung des Enzyms und erlauben eine bessere Einbettung des Substrates (Araújo et al. 2007). Mit der L182A Substitutionsmutante und dem Wildtyp Enzym erfolgten mehrere Studien über den Einfluss der Durchmischung auf die hydrolytische Effizienz. Die Inkubation der PET-Textilien erfolgte bei 37 C und die Hydrolyseprodukte wurden mittels Fluoreszenzdetektion nachgewiesen. Die Detektion der Modifikationen an den Textilien erfolgte durch eine Anfärbung mit Reaktivfarbstoffen und der Bestimmung der Farbintensität. In der Studie wurde gezeigt, dass eine geringere Durchmischung höhere Funktionalisierungsraten zu Folge hatte ( Neill et al. 2007). Intensivere Studien zur enzymatischen berflächenmodifikation und Funktionalisierung wurden mit TEXAZYM EM durchgeführt (InoTEX Ltd., Tschechische Republik). Die Enzympräparation zeigte eine

58 Einführung 41 intensive Proteinbande in der SDS-PAGE bei etwa 22 kda, womit es sich bei dem hydrolytischen Enzym um eine Cutinase von F. solani handelt. Die Analyse der PET-Filme, erfolgt per FTIR, brachte Informationen über die chemischen und strukturellen Eigenschaften sowie über den enzymatischen Effekt auf der berfläche des Films. Abschließende Untersuchungen zeigten, dass der enzymatisch behandelte Film effizient mit einem fluorszierenden Alkylbromid (2-Bromomethylnaphthalen (BrNP)) verestert werden konnten, was eines der neuen Anwendungsgebiete des biofunktionalisierten PET ist (Donelli et al. 2009). Bis zum jetzigen Zeitpunkt sind keine Informationen über eine Steigerung der Thermostabilität der löslichen Cutinase von F. solani veröffentlicht. Das Enzym ist instabil oberhalb von 45 C und verliert mehr als 80% seiner Aktivität über einen Zeitraum von 60 Minuten bei 60 C (Dutta et al. 2009). In neuesten Studien wurde die hydrolytische Aktivität der eukaryotischen Cutinase aus F. solani (40 C) und der bakteriellen Cutinase aus T. fusca (60 C) verglichen. Dabei wurde gezeigt, dass die eukaryotische Cutinase mehr Hydrolyseprodukte in Abhängigkeit zu der eingesetzten Menge an Protein (mg) freisetzte im Vergleich zur bakteriellen Cutinase (Chen et al. 2010). Die Cutinase aus F. solani ist eine höchst aktive Hydrolase für PET-Modifikationen und von Interesse für verschiedene Hydrolysestudien. In den nächsten Jahren sollte die Steigerung der Thermostabilität durch eine Substitutionsmutagenese stärker untersucht werden, um das Interesse an dieser Cutinase für die Anwendung zur PET Modifikation noch zu steigern. Thermomyces (Humicola) insolens ist ein thermophiler Pilz. Ein lipolytische Enzym wurde in einer E. coli Klonbibliothek, hergestellt aus der genomischen DNA aus H. insolens DSM 1800, identifiziert. Die Cutinase wurde rekombinant produziert, chromatographisch aufgereinigt und charakterisiert. Die Bestimmung des Molekulargewichts ergab kda, der isoelektrische Punkt des Enzyms betrug 8. Das ph ptimum lag bei ph 8, aber auch mit einer hohen Aktivität bis ph 10. Das aktive Zentrum der eukaryotischen Cutinase besteht aus den Aminosäuren Ser140, Asp195 und His208. Bei der Untersuchung der lipolytischen Aktivität während eines Waschganges zeigte sich, dass das Enzym eine hervorragende Fettentfernung bei den Textilien erzielte und eine hohe Affinität gegenüber livenöl zeigte (Sandal et al. 1996). Die Cutinase wurde eingesetzt für den Abbau von ETE und BEB, für die Bestimmung ihres Depilling Effekts und die Farbauffrischungsfähigkeit bei Polyestertextilien bei 50 C und zeigte bei allen Untersuchungen ausgezeichnete Ergebnisse (Andersen et al. 1999). Die hydrolytische Aktivität der Cutinase gegenüber zyklischen PET-Trimeren (CTR) wurde ebenfalls untersucht. Während der Inkubation von 16 Stunden bei 30 C wurden durch das Enzym 56% der zyklischen ligomere hydrolysiert. Das Haupthydrolyseprodukt war MHET und nur geringe Mengen an TPA und BHET konnten detektiert werden (Riegels et al. 2001).

59 Einführung 42 Durch eine lokale zufällige Mutagenese konnten neue Varianten der Cutinase hergestellt werden und die positiven Klone wurden durch die Inkubation bei 60 C selektiert. Drei positive Varianten wurden isoliert und durch eine Sequenzierung erfolgte die Identifizierung der Modifikationen A14P + E47K, E47K und E179Q verglichen zur Wildtyp Cutinase. Durch eine ortsspezifische Mutation wurden zusätzliche Modifikationen eingefügt. Für sieben Mutanten erfolgte die Bestimmung der Thermostabilität mittels DSC. Die Wildtyp Cutinase besaß eine T d (thermale Denaturierungstemperatur) von 61 C bei ph 4,5. Fünf der Varianten besaßen eine T d von C, was eine Erhöhung von 3-5 C bedeutete. Eine Variante (E6Q, E10Q, A14P, E47K, R51P, E179Q) wies eine erhöhte Thermostabilität während der CTR Hydrolyse auf und eine optimale ligomerentfernung bei ph 9 und 75 C. Das Temperaturoptimum dieser Mutante lag bei 65 C (Abo et al. 2004). Weitere Mutanten wurden durch eine ortsspezifische Mutagenese mit dotierten ligonukleotiden erzeugt. Die erstellten Bibliotheken wurden nach Varianten mit einer höheren Thermostabilität mittels Hofbildung auf BETEB Agarplatten bei 68 C durchsucht. Alle erzeugten Mutanten bildeten Höfe bei 68 C, der Wildtyp jedoch nicht, seine bevorzugte Wachstumstemperatur lag bei 60 C. Einige Varianten waren auch noch aktiv während der Inkubation bei 76 C. Bei der DSC Thermostabilitätsbestimmung bei ph 10 zeigte der Wildtyp eine T d von 68 C, hingegen zeigten drei Varianten eine T d von C. Somit konnte eine deutliche Steigerung der Thermostabilität erzielt werden. Mit einer dieser Varianten wurden zusätzliche Textilienbehandlungen durchgeführt (Waschgänge, Behandlung der Polyestertextilien und Gewichtsverlustberechnungen, Reinigungseffekt gegenüber Fettflecken, Depillingeffekt und Effekt auf die Wasserabsorption), die meisten Behandlungen erfolgten bei 75 C und die Mutante zeigte exzellente Resultate (Svendsen et al. 2005) veröffentlichten Hooker et al. Abbauergebnisse unter Anwendung einer Cutinase von Novozym North Amerika, Inc. (Franklinton, NC). Die Cutinase wurde für die Hydrolyse von CTR bei 60 C mit verschiedenen CTR- und Enzymkonzentrationen, unter Zugabe von Lösungsmitteln und für eine Langzeitinkubation eingesetzt. Durch die Variation der Reaktionsparameter konnte eine annähernd komplette Hydrolyse der CTR erreicht werden. Die nachgewiesenen Abbauprodukte waren nur TPA, MHET und BHET, es konnten keine linearen Dimere oder Trimere per RP-HPLC detektiert werden. Das bedeutet, dass nach der Ringöffnung eine schnelle Hydrolyse der CTR erfolgte und somit fast alle Esterbindungen gespalten wurden. Die Durchmischung konnte als ein wichtiger Faktor für die Hydrolyserate identifiziert werden. Eine höhere Durchmischung resultierte in einer höheren prozentualen Hydrolyse. Zusätzlich zeigten höhere Enzymkonzentrationen eine komplettere Hydrolyse der Esterbindungen und das Hauptprodukt verschob sich von MHET zu TPA (Hooker et al. 2003).

60 Einführung 43 Weitere Studien mit der entwickelten Cutinase wurden 2006 von der gleichen Arbeitsgruppe durchgeführt. Der Einfluss der Partikelgröße der CTR auf die Enzymkinetik wurde bei 60 C untersucht. Grob dispergierte CTR zeigten eine größere Partikelgröße als aus einer Dioxanlösung ausgefällte CTR. Als Konsequenz für die größere Partikelgröße wurde eine heterogene Kinetik 0. rdnung detektiert, hingegen zeigten die kleineren Partikel eine homogene Kinetik 1. rdnung. Deshalb wurde geschlussfolgert, dass weitere Studien für einen optimaleren Abbau mit Trimeren der kleineren Partikelgröße durchgeführt werden sollten (Figueroa et al. 2006). Zwei Mutanten aus dem Patent von Svendsen et al. (2005) wurden ausgewählt für die Charakterisierung der neuen Varianten. Die Variante A hatte folgende Substitutionen: E6Q, G8D, A14P, N15D, T29M, E47K, S48E, R51P, A88H, N91H, A130V, T166I, L167P, E179Q, R189V und die Variante B: E6Q, G8D, A14P, N15D, E47K, S48E, R51P, A88H, N91H, A130V, E179Q, R189V. Die entwickelten Enzyme wurden angewandt für die Bestimmung ihrer Depilling Eigenschaften bei 70 C mit und ohne der Zugabe von Triton X-100 als Lösungsvermittler und ihrer Fähigkeit zum Biopolishing von 100% Polyester und 50%/50% Polyester/Baumwolle Mischgarn bei 70 C. Die Mutante B zeigte eine höhere hydrolytische Aktivität während der Polyesterbehandlung und exzellente Ergebnisse bei der Anwendungstemperatur von 70 C (Jump und McCloskey 2004). Novozym China veröffentlichte 2008 Ergebnisse von enzymatischen Hydrolysestudien von PET- Textilien zur Steigerung der Hydrophilizität unter Anwendung der Cutinasevariante B von T. insolens. Der optimale ph Bereich für die Enzympräparation lag bei ph 7-9 und der optimalen Temperatur Bereich von 65 bis 80 C. In Verbindung mit Triton X-100 konnte bereits bei einer Cutinasekonzentration von 5 LU/ml eine Durchfeuchtungszeit von 5 Sekunden erreicht werden, hingegen ohne Lösungsvermittler und mit 200 LU/ml Cutinase wurde eine Durchfeuchtungszeit von 180 Sekunden plus x bestimmt. Die Hydrophilizität und Feuchtigkeitseigenschaften wurden analysiert durch den Tropfentest (Liu et al. 2008). Zusätzliche Abbauergebnisse zur PET-Behandlung mit der T. insolens Cutinase wurden 2009 veröffentlicht. Es erfolgte ein Vergleich zwischen der T. insolens Cutinase und zwei weiteren Cutinasen, einer bakteriellen und einer weiteren eukaryotischen. Die PET-Film Hydrolyse erfolgte bei 70 bis 80 C mit der Cutinase aus T. insolens. Der PET-Film mit der geringen Kristallinität wies eine T g von 75 C auf, das bedeutet, dass die Abbaustudien sowohl 5 C unterhalb als auch oberhalb der Glasübergangstemperatur des PET-Films erfolgten und somit unter optimalen Bedingungen. Mit dieser Gewissheit war es nicht verwunderlich, dass die entwickelte Cutinase die besten Abbauergebnisse erzielte mit 100% Gewichtsverlust nach 96 Stunden Inkubation bei 70 C. Ein adäquates Kinetik-Modell für den Filmabbau wurde ebenfalls bestimmt und mittels RP-HPLC wurde TPA als Haupthydrolyseprodukt identifiziert (Ronkvist et al. 2009).

61 Einführung 44 Zu diesem Zeitpunkt ist die entwickelte Cutinase aus T. insolens, erhalten durch ortsspezifische Mutagenese, das wohl beste PET-hydrolysierende Enzym. Die Cutinase aus dem gram (-) Pseudomonas putita (später umbenannt in Pseudomonas mendocina) wurde 1987 aus einer Bakterienkultur aus einer Phyllosphäre identifiziert und zeigte die höchste cutinolytische Aktivität zwischen ph 9 und 11. Die Wachstumstemperatur war für diesen Stamm mit 41 C relativ hoch und bei der Temperaturstabilitätbestimmung zeigte die Cutinase im extrazellulären Überstand nach 1 Stunde Inkubation bei 60 C 100% Restaktivität und bei 70 C 85% Restaktivität (Sebastian et al. 1987). Nach der Aufreinigung der Cutinase wurde das Molekulargewicht mittels SDS- PAGE und Größenausschlusschromatographie auf 30 kda bestimmt und eine monomerische Struktur wurde geschlussfolgert. Das ph ptimum für die Cutinhydrolyse des aufgereinigten Enzyms lag zwischen ph 8,5 und 10,5 (Sebastian et al. 1988). Die Cutinase zeigte keine Grenzflächenaktivierung, aber die typische α/β-hydrolase Faltungsstruktur und ein aktives Zentrum mit Ser126, Asp176 und His206. Es erfolgte ein positionsspezifischer Aminosäurenaustausch, um die Cutinase für die Fetthydrolyse und die Detergenzienanwendung zu verbessern. Die Cutinase aus P. mendocina wurde aufgrund der Triglyceridhydrolyse im alkalischen Bereich ausgewählt. Der Austausch an Position Y202L/R203L steigerte die Acylkettenbindung der Triglyceride und damit die Aktivität gegenüber längeren Triglyceriden mit C18 Acylseitenketten (Boston et al. 1997). Die ersten enzymatischen Behandlungen von PET-Textilien wurden 1988 mit der Cutinase aus P. mendocina, zur Verfügung gestellt von Genencore International, durchgeführt. Die Cutinase steigerte die Durchfeuchtungs- und Absorbtionseigenschaften von Dacron 54 (PET-Homopolymer), Dacron 64 (sulfoniertes PET, SPET) und MicromattiqueR (Mikrodenier PET). Die optimalen Reaktionsbedingungen lagen mit 0,12 g/l Cutinase bei 35 C für 10 Minuten. Im Vergleich zur alkalischen Hydrolyse zeigte die Cutinasebehandlung den Vorteil, dass sie eine stärkere Steigerung der Durchfeuchtung bei einer geringeren Temperatur (Hsieh und Cram 1998, Hsieh et al. 2003) erzielte. In weiteren Studien wurde die Cutinase eingesetzt, um die Farbstoffaufnahme und Absorption von kationischen Farbstoffen bei Dacron 54 und Dacron 64 nach einer Behandlung für 24 Stunden bei 40 C zu untersuchen. Vor der Färbung wurden die Textilien mit einer Protease und Triton X-100 behandelt und gründlich gewaschen, um die anheftenden Proteinverunreinigungen zu entfernen. In einer anderen Untersuchung wurde nachgewiesen, dass die Cutinasebehandlung eine Steigerung des Depillingeffekts zur Folge hatte, zusätzlich wurde ein Gewichtsverlust im Vergleich zur Kontrolle detektiert und die berflächenmodifikationen der PET-Fasern per SEM beobachtet. Die Cutinase modifizierte ebenso PTT Fasern, ebenfalls nachgewiesen durch die Farbstoffaufnahme. Die während der enzymatischen Inkubation freigesetzten Hydrolyseprodukte wurden mittels UV

62 Einführung 45 Absorbtionsmessung und RP-HPLC nachgewiesen. Das detektierte Produkt nach der Natronlaugebehandlung war nur TPA, hingegen bei der Cutinasebehandlung wurde ein unbekanntes Produkt analysiert. Mit der Cutinase aus P. mendocina wurde zum ersten Mal gezeigt, dass nur Textilien mit einer geringen rientierung/kristallinität effektiv hydrolysiert werden im Gegensatz zu hoch orientierten/kristallinen Textilien (Yoon et al. 2002, Dyson et al. 2005). Eine ortsspezifische gesättigte Mutagenese erfolgte mit der Cutinase aus P. mendocina, um die hydrolytische Aktivität gegenüber Polyethylenterephthalat Textilien und/oder die Enzymstabilität zu steigern. Die Mutanten wurden bezüglich ihre Freisetzung von löslichen TPA-enthaltenden Derivaten während der enzymatischen Hydrolyse von PET mittels UV Absorptionsmessung im Plattenleser getestet. Die Stabilitätsuntersuchungen wurden ebenfalls im Plattenleser anhand der Spaltung von p- NPB ermittelt. Die ortsspezifische abgesättigte Mutagenese an den Positionen 63-65, , 205, 209 und 211 hatte Varianten zur Folge, von denen mehr als 2% eine höhere Aktivität besaßen als die Kontrolle. Mutationen an den Positionen 59, 64, 150, 177, 180 und 182 brachten Varianten hervor, von denen mehr als 2% der Klone eine größere Stabilität aufwiesen gegenüber der Kontrolle. Varianten die sowohl eine erhöhte Aktivität und Stabilität zeigten, wiesen Substitutionen an den Positionen 64, 180, 182 und 211 auf. Zusätzliche Mutationen wurden durchgeführt und der Austausch des Serins an den Stellen 20 und 85 kreierten neue Bibliotheken mit neuen Positionen. Mutanten mit einer Substitution von Phenylalanin an der Position 180 durch Isoleucin, Leucin, Asparagin oder Prolin brachten Varianten hervor mit einer erhöhten Stabilität gegenüber dem Wildtyp. Ebenso zeigte ein Austausch des Glycins an der Position 59 mit Phenylalanin, Lysin, Leucin oder Valin eine Erhöhung der Stabilität im Vergleich zum Wildtyp. Die Kombination der Substitutionen von Phenylalanin an der Position 180 und Serin an der Position 205 ergaben Varianten mit einer signifikanten Steigerung der relativen Stabilität. Zusätzliche Austausche an einer bis drei Positionen hatten Mutanten zur Folge mit gesteigerter PET-Hydrolaseaktivität (Bott et al. 2003). Nicht überraschend zeigte die Cutinase von P. mendocina in den Untersuchungen von Ronkvist et al (2009) ein Temperaturoptimum von 50 C. Verglichen zu den Cutinasen von T. insolens und F. solani zeigte die Cutinase von P. mendocina die stärkste Affinität gegenüber PET. Während einer 96 stündigen Abbaustudie bei 50 C setzte die Cutinase nur TPA und Ethylenglycol als lösliche Produkte vom gering kristallinen PET-Film (7% Kristallinität) frei, detektiert durch die RP-HPLC. Der Gewichtsverlust des Films war nur 5% aufgrund der Temperaturdifferenz von etwa 25 C zwischen der Inkubationstemperatur und der Glasübergangstemperatur des PET (Ronkvist et al. 2009). Zusammenfassend ist aufgrund der Tatsache, dass PET besser abbaubar ist bei Temperaturen um 75 bis 80 C, die Temperaturstabilität und die optimale Reaktionstemperatur für eine industrielle Anwendung immer noch zu gering.

63 Einführung 46 Thermobifida (zuvor Thermomonospora) fusca ist ein gram (+), thermophiler, aerober, sporenbildender Actinomycet mit einem Temperaturoptimum zwischen 50 und 55 C. Sein natürliches Habitat sind Dung, Kompost und überhitztes Heu (McCarthy 1989). Vier verschiedene Stämme von T. fusca sind bisher bekannt und untersucht, T. fusca DSM (ATCC 27730) und seine Mutanten, T. fusca DSM 43793, T. fusca YX und T. fusca KW3. Der erste untersuchte Stamm war der Referenzstamm T. fusca DSM 43792, welcher auf die Bildung von cutinolytischer Aktivität getestet wurde. Die Rohenzymlösung zeigte eine optimale Temperatur von 50 bis 70 C und einen optimalen ph von 11. Die Enzympräparation besaß eine Halbwertszeit bei 70 C von 60 Minuten (Fett et al 1999). Weiterführend wurde eine Mutante des Referenzstamms mittels DES und UV-Licht Behandlung erzeugt. Diese Mutante, WSH04, zeigte eine höhere Cutinaseproduktion gegenüber dem Wildtyp. Mit diesem Bakterienstamm erfolgte die ptimierung der Cutinaseproduktion durch eine zweistufige ph Kontrolle und eine maximale Cutinaseaktivität von 19,8 U/ml konnte erreicht werden nach 50 Stunden Inkubation (Du et al. 2007). Eine Enzympräparation von T. fusca KW3 mit Esteraseaktivität, induziert während des Wachstums mit Suberin, zeigte nach der Inkubation mit PET-Fasern, PBT-Fasern und recyceltem PET-Granulat eine Freisetzung von aromatischen Bestandteilen bei 50 C und 70 C. Mit der höheren Temperatur konnten mehr Hydrolyseprodukte nachgewiesen werden. Die Effekte der Fasermodifikation wurden nach der Färbung mit Reaktivfarbstoffen durch die Bestimmung der Farbintensität nachgewiesen, ebenso wie mit der Steighöhenbestimmung und Flüssigkeitsaufnahmekapazitätsmessung (Alisch et al. 2004, Alisch-Mark et al. 2006, Feuerhack et al. 2008). Ein weiteres Enzym mit cutinolytischer Aktivität wurde 2005 aus T. fusca DSM isoliert: BTA1 (TfH). Dieses Enzym wurde induziert durch den aliphatisch-aromatischen Copolyester (BTA40:60) und dessen ligomere, aber nicht mit dem Monomer TPA oder mit Poly-ε-caprolacton (PCL) produziert. Die molekulare Masse des Enzyms war 28,2 kda, der pi lag bei 6,43. TfH ist eine aus 261 Aminosäuren bestehende Serin-Hydrolase. Die katalytische Triade besteht aus den Aminosäuren Ser132, Asp176 und His210. Das Enzym konnte Cutin aus Apfelschalen abbauen und das aktive Zentrum ist frei zugänglich, das heißt, dass kein schließender Deckel das aktive Zentrum bedeckt (Kleeberg et al. 2005). Zusätzlich baute die TfH käufliche PET-Flaschen und PET-B Pellets bei 55 C ab (Müller et al. 2006). In weiteren Arbeiten wurde die Cutinase rekombinant in E. coli und nach einer Codonoptimierung in B. megaterium mit einem N-terminalen Signalpeptid für die B. megaterium Lipase A und einem C-terminalen His 6 -Anhang unter der Kontrolle eines Xylose-induzierten Promotors produziert (Dresler et al. 2006, Yang et al. 2007). Alle diese Studien über die Cutinase TfH aus T. fusca DSM basieren auf einem Patent von Deckwer et al. aus dem Jahr 2000, in dem die Lokalisation der Gene der BTA Hydrolasen BTA1 und BTA2 beschrieben wurde. Beide Enzyme liegen

64 Einführung 47 nacheinander im Genom vor und nach ihrer Transkription und Prozessierung besitzen sie fast das gleiche Molekulargewicht (beide bestehen aus 261 Aminosäuren, BTA1 mit 28,2 kda und BTA2 mit 28,4 kda). Bei einem Sequenzvergleich wurde festgestellt, dass 20 der 261 Aminosäuren sich in den beiden Cutinasen unterscheiden, woraus sich eine 92% Übereinstimmung der beiden Cutinasen ableiten lässt (Deckwer et al. 2000). Bisher wurden nur Studien über eine PET-hydrolysierende Aktivität mit BTA1 (TfH) durchgeführt, da die hydrolytische Aktivität der BTA2 geringer war. Die rekombinante TfH baute das PET Modellsubstrat BETEB ab und steigerte die Hydrophilität von PET- Textilien während der enzymatischen Behandlung (die Inkubationstemperatur wurde nicht genannt). Der Nachweis der Modifikation erfolgte mittels Steighöhenbestimmung und Tropfentest (Heumann et al. 2006). Die Hydrolyse von BHPT, der bis(3-hydroxypropyl)ester der Terephthalsäure, erfolgte bei 60 C über einen Zeitraum von 24 Stunden. Die TfH hydrolysierte zunächst das BHPT zu MHPT und später den Monoester komplett zu Terephthalsäure. Hingegen wurde beim Abbau von zyklischen PPT-Dimeren bei 60 C durch die TfH kein BHPT nachgewiesen. Zu Beginn der Hydrolyse war das Hauptprodukt MHPT (bis etwa 48 Stunden Inkubation), aber nach 96 Stunden wurde TPA in höheren Konzentrationen detektiert. Die PTT-Film-Modifikationen durch die TfH bei 60 C wurden nachgewiesen durch die Erniedrigung des Kontaktwinkels nach der Behandlung und durch den fehlenden Kristallisationspeak bei 72 C, analysiert per DSC. Dabei betrug der Temperaturunterschied zwischen der Inkubationstemperatur und der Glasübergangstemperatur (T g ) 12 C. Die Behandlung von PTT-Textilien mit der Cutinase aus T. fusca bei 60 C zeigte ebenfalls eine hydrolytische Aktivität durch die Freisetzung von MHPT und TPA, den bestimmten Gewichtsverlust und eines deutlichen Anstiegs des K/S Verhältnisses (Eberl et al. 2008). Weiterhin wurde die enzymatische Behandlung von PET-Textilien mit der TfH bei 60 C untersucht. Die Modifikationen wurden nachgewiesen durch die Detektion der Hydrolyseprodukte per HPLC, von den amorphen Textilien wurden TPA, MHET und BHET freigesetzt und von den semi-kristallinen Textilien TPA und MHET. Veränderungen in der elementaren Zusammensetzung der Textilien nach der enzymatischen Behandlung wurden durch eine XPS-Analyse nachgewiesen. Zusätzlich erfolgte der Nachweis der berflächenmodifikationen durch einen Tropfentest, durch die Bestimmung der Durchfeuchtungszeit und eine K/S- Verhältnisbestimmung (Brueckner et al. 2008). Überraschenderweise ergab die Zugabe von Triton X- 100 zum BETEB (3PET)-Abbau keine Steigerung der hydrolytischen Aktivität der Cutinase während der Inkubation bei 60 C. Hingegen zeigte die Addition von N,N-Diethyl-2-Phenylacetamid (DEPA), einem Weichmacher, eine Steigerung der Abbaurate bei den semi-kristallinen PET-Filmen und Textilien. Daraus wurde geschlussfolgert, dass für die Cutinase aus T. fusca die Zugabe eines Weichmachers für eine Steigerung der Hydrolyserate angewandt werden sollte (Eberl et al. 2009). Basierend auf der vollständigen Sequenzierung des Genoms von T. fusca YX im Jahre 2008 (Lykidis et al. 2008) wurden zwei ähnliche Cutinasen aus T. fusca WSH03-11 identifiziert (Chen S et al. 2008,

65 Einführung 48 Chen J et al. 2008). Beide Enzyme, kloniert und produziert in E. coli, wiesen ähnliche enzymatische Eigenschaften auf und beide hydrolysierten Apfelcutin unter Freisetzung von Cutinmonomeren. Die optimale Temperatur für die Hydrolyse von Triolein und p-npb lag bei beiden Enzymen bei 60 C und der optimale ph Wert lag bei 8. Eine verbleibende Restaktivität von 80% nach 160 Stunden Inkubation bei 40 C und eine Restaktivität von 50% nach 40 Stunden Inkubation bei 60 C wurde nachgewiesen (Chen S et al. 2008). Die identifizierten Cutinasen zeigten eine 93% Übereinstimmung ihrer Proteinsequenz. Interessanterweise konnte während der Inkubation der Enzyme mit zyklischen PET-Trimeren (CTR) bei 60 C nur eine Cutinase lösliche Hydrolyseprodukte freisetzen. Die löslichen Hydrolyseprodukte wurden mittels RP-HPLC analysiert und per LC-MS verifiziert (Chen et al. 2010). Zusammenfassend ist bekannt, dass der thermophile Actinomycet T. fusca zwei Isoenzyme mit mehr als 90% Übereinstimmung produziert, welche sich in ihrer Hydrolyserate gegenüber PET deutlich unterscheiden. Nur mit einer der Cutinasen konnten PET-Textilien effektiv modifizieren werden. Die Untersuchung der Unterschiede der beiden Enzyme durch die Bestimmung der Kristallstrukturen, durch Sequenzvergleiche und Mutationsanalysen und die Bestimmung ihres Einflusses auf die katalytische Aktivität gibt einen interessanten Einblick in die PET-Hydrolysereaktion. Zusätzlich sollte auch für diese Enzyme eine Steigerung der Thermostabilität und Aktivität durch eine ortsspezifische Mutagenese oder einen Austausch von Aminosäuren im Hinblick auf eine industrielle Anwendung erfolgen.

66 Einführung Zielsetzung Besonders thermophile Actinomyceten sind außerordentlich leistungsfähig beim Abbau von Kunststoffen sind (Kleeberg et al. 1998). Ferner spielen Actinomyceten, darunter auch Thermomonospora spp., eine wichtige Rolle beim Abbau von Pflanzenpolymermaterial und sind ebenfalls in der Lage, eine große Vielfalt an hydrolytischen extrazellulären Enzymen zu bilden (Wilson 1988; Zimmermann 1989; Röthlisberger et al. 1992; Hilge et al. 1998). Bei Untersuchungen mit Streptomyces spp. (Lin und Kolattukudy 1980; Fett et al. 1992) und Thermomonospora fusca (Fett et al. 1999) konnte eine Cutinaseaktivität nachgewiesen werden, welche die Hydrolyse des aliphatischen Pflanzenpolyesters Cutin verursachte. Von Zimmermann et al. (1985) und Bernards et al. (1995) ist bekannt, dass auch der pflanzliche Polyester Suberin sowohl aliphatische als auch aromatische Regionen enthält und aufgrund seiner Struktur zur Induktion von Polyester hydrolysierenden Enzymen in Actinomycetenisolaten eingesetzt werden könnte. Diese hydrolytischen Enzyme können mit ihren günstigen Eigenschaften, wie zum Beispiel Temperaturstabilität oder Substratspezifität, bei der Entwicklung eines biotechnologischen Verfahrens zum Abbau von PET-ligomer eingesetzt werden. Dadurch eröffnet sich die Chance, durch den Einsatz von spezifischen Biokatalysatoren zur Elimination von synthetischen PET-ligomer ein alternatives umweltfreundliches biotechnologisches Verfahren zur Textilveredelung von Chemiefasern zu erhalten. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung eines biokatalytischen Abbaus von PET-ligomeren, welcher umweltfreundlich und faserschonend zugleich ist und somit eine optimale Alternative zur problembehafteten industriellen Textilveredelung darstellt. Mit dem aus Kompost gewonnenen Actinomyceten Thermobifida fusca KW3 wurde ein Enzym (TfCa) produziert, welches in der Lage war, die PET-ligomere auf der Faseroberfläche abzubauen, ohne die Faser zu beschädigen. Nach der ptimierung der Induktion der Hydrolase erfolgte die Produktion des Enzyms in größeren Mengen und es wurde eine Methode zur Aufreinigung entwickelt. Anschließend wurde die TfCa biochemisch charakterisiert und verglichen mit bereits bekannten PET-Hydrolasen. Desweiteren erfolgte die Aufreinigung der beiden rekombinant produzierten Cutinasen TfCut1 und TfCut2 aus T. fusca KW3 parallel zu rekombinant produzierten Carboxylesterase TfCa, welche alle drei in der Lage waren, PET mit unterschiedlicher Effektivität zu modifizieren. Mit den aufgereinigten Enzymen und weiteren bekannten PET-Hydrolasen aus Fusarium solani sp. pisi, T. fusca sp. und einer eukaryotischen Cutinasepräparation von Novozymes erfolgten anschließend Abbauversuche, um den Abbaumechanismus auch im Vergleich zueinander zu untersuchen. Dabei kamen verschiedene PET-Substrate in Form von PET-Trimeren, PET-Fasern und PET-Film zum Einsatz.

67 Material und Methoden 50 2 Material und Methoden 2.1 Materialien Verwendete Mikroorganismen Thermobifida fusca KW3 (Thermomonospora), ein Isolat aus Komposterde, ist ein gram positives aerobes thermophiles und alkalophiles Bakterium, das den Actinomyceten zugeordnet wurde. Hinterlegt ist der Stamm unter der Stammbezeichnung DSM 6013 bei der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland). Die optimalen Wachstumsbedingungen für T. fusca KW3 sind C und ph 7,3 (Casimir-Schenkel 1992). Die Kultivierung von T. fusca KW3 erfolgte auf Czapek-Medium. Des Weiteren wurden T. fusca DSM und T. fusca DSM 43793, bezogen von der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland), in die Arbeiten einbezogen. Die Kultivierung von T. fusca DSM erfolgte ebenfalls mit Czapek- Medium, die Kultivierung von T. fusca DSM mit einem modifizierten Czapek-Medium, welches 6,1 g/l Casein Hydrolysat anstatt 5 g /L Pepton enthielt Verwendete Enzyme Die aufgereinigte Carboxylesterase (EC ) TfCa aus T. fusca KW3 wurde mit einer spezifischen Aktivität von 11,6 U/mg bei den Abbauuntersuchungen eingesetzt, dazu wurde die erhaltene vereinigte Enzymlösung gefriergetrocknet und bei 20 C gelagert. Für die Abbauuntersuchungen wurde ebenfalls eine eukaryotische Cutinase (EC ) aus Fusarium solani pisi, erhalten von Unilever Research and Development Laboratory in Vlaardingen, eingesetzt. Die Cutinase lag in immobilisierter Form vor und wurde, wie von Vertommen et al. (2005) beschrieben, vorbereitet. Weiterhin wurde eine Cutinase, vorliegend als flüssiges Konzentrat von Novozymes (NS-29061, LN05012), für die Abbauuntersuchungen verwendet. Die Cutinasen 1 und 2 aus dem Isolat T. fusca WSH03-11 wurden rekombinant produziert von Chen S et al. (2008) erhalten und lagen lyophilisiert vor (Chen J et al. 2008). Die rekombinant produzierten Cutinasen TfCu1 und TfCu2 und die Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3, bereitgestellt von Herrn Ren Wei und Herrn Thorsten eser, lagen aufgereinigt mit einer spezifischen Aktivität von 230 U/mg, 155 U/mg und 204 U/mg in Lösung vor.

68 Material und Methoden Größenstandards Low Molecular Weight Marker (GE Healthcare) Der Proteinstandard diente zum Abschätzen der molekularen Größe der Proteine im SDS Gel. Die enthaltenen Proteine besaßen eine Größe von g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol und g/mol Roti -Mark Standard (Fa. Carl Roth GmbH) Der Roti -Mark SDS Proteinstandard wurde für die Berechnung des Molekulargewichtes der Esterase verwendet. Die enthaltenen Proteine besaßen eine Größe von g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol und g/mol Spectra TM Multicolor Broad range Protein Ladder (Fermentas) Der Proteinstandard diente zum Abschätzen der molekularen Größe der Proteine im SDS Gel. Die enhaltenen Proteine besaßen eine Größe von g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol und g/mol PageRuler TM plus prestained protein ladder (Fermentas) Der Proteinstandard diente zum Abschätzen der molekularen Größe der Proteine im SDS Gel. Die enhaltenen Proteine besaßen eine Größe von g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol, g/mol und g/mol.

69 Material und Methoden Kalibrierungskit für pi Bestimmung (ph 3-10, GE Healthcare) Das Kalibrierungskit für die pi Bestimmung wurde für die Berechnung des pi der Esterase mittels Isoelektrischer Fokusierung verwendet. Abbildung 23: Kalibrierungskit für die pi Bestimmung, Breiter pi Bereich (ph 3-10, rechte Spur, GE Healthcare) Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie (LMW, GE Healthcare) Das Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie wurde für die Kalibrierung der Größenausschlusschromatographiesäule verwendet. Tabelle 9: Das Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie. Protein Molekulargewicht (g/mol) Herkunft Position Blue dextran Conalbumin Hühnerei a valbumin Hühnerei b Carboanhydrase Schweineerythrozyten c Ribonuclease A Schweinepankreas d Aprotinin Schweinelunge e

70 UV (mau) ln Molekulargewicht Material und Methoden c y = -0.03x R² = Elutionsvolumen (ml) a b d e Elutionsvolumen (ml) Abbildung 24: Elutionsprofil des Kalibrierungskit für die Größenausschlusschromatographie eluiert von einer XK 26/60 Säule, Superdex 200 prep grade, 320 ml SV, 50 mm Tris HCl ph7,2 150 mm NaCl, 2,5 ml/min, 280 nm und dazugehörige Kalibrierkurve (kleine Abbildung) Chemikalien Die Chemikalien wurden, wenn nicht weiter erwähnt, mit der Reinheit p.a. eingesetzt. Acros rganics (Geel, Belgium) Diethylterephthalat (DET), 2-Naphtylacetat, Phenylmethyl-sulfonylfluorid Thiamindichlorid (PMSF), Aldrich Chemical Company (St. Louis, UAS) p-aminobenzoat, (NH 4 ) 6 Mo 7 24 x 4 H 2, Terephthalsäure (TPA) Fluka Chemie (Buchs, Schweiz) Coomassie Brilliant Blue R250, Jodacetamid, N,N - Methylenbisacrylamid, Poly(ε-caprolacton) (PCL) Grüssing GmbH (Filsum, Deutschland) Essigsäure, KH 2 P 4, NaH 2 P 4 x 2 H 2, Na 2 HP 4, (NH 4 ) 2 S 4, NH 4 H Macherey-Nagel GmbH & Co. KG (Düren, Deutschland) N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid (MSTFA)

71 Material und Methoden 54 Merck (Darmstadt, Deutschland) Acrylamid, AgN 3, Biotin, CuCl 2 x 2 H 2, Eisessig, Ethanol absolut, FeCl 3 x 6 H 2, FeS 4 x 7 H 2, Glycerin, konz. HCl, Hefeextrakt, Hexansäure (Caproinsäure), Isopropanol, KCl, K 2 HP 4, MgS 4 x 7 H 2, MnCl 2 x 4 H 2, NaN 3, Natriumsulfit, NH 4 Cl, Niacinamid, Triton-X-100, Vitamin B 12, ZnCl 2 Riedel de Haën AG (Seelze, Deutschland) n-caprylsäure, Malachitgrün-xalat, Safranin T Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland) Acetonitril HPLC rein, Agar, Buttersäure, CHAPS, Glycin, β-mercaptoethanol, Methanol HPLC rein, NaCl, NaH, NH 4 HC 3, Pepton, Roti-Quant, Saccharose, SDS, Tributyrin, Tricaprylin, Trifluoressigsäure (TFA), TRIS Scharlau Chemie S.A. (Barcelona, Spanien) 1,4-Dioxan Serva Feinbiochemika GmbH (Heidelberg, Deutschland) Bromphenolblau, BSA, EDTA Sigma Chemical Company (St. Louis, UAS) Ammoniumpersulfat, bis (2-hydroxyethyl) Terephthalat (BHET), Chymotrypsin, D,L-6,8- Dithiooctansäure, Dithiothreitol (DTT), Ethylenglycol, Fast Red TR Salt, Folsäure, Formaldehyd, Gum arabicum, Methyloleat, Na 2 B 4 7 x 10 H 2, para- Nitrophenylacetat (p-npa), para-nitrophenylbutyrat (p-npb), para-nitrophenylcaprylat (p-npc), para- Nitrophenylpalmitat (p-npp), D-Panthotensäure, Pyridoxalhydrochlorid, Riboflavin, N,N,N,N - Tetramethylethyldiamin, Tosyl-L-phenylalaninechloromethylketon (TPCK), Tricaproin, Trypsin, Zitronensäure VEB Laborchemie Apolda (Deutschland) Ammoniumoxalat, CaC 3, xalsäure

72 Material und Methoden Geräte und Materialien Chromatographie-Säulen XK 16/20 (GE Healthcare, München, Deutschland) XK 16/40 (GE Healthcare, München, Deutschland) XK 16/100 (GE Healthcare, München, Deutschland) ctyl Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, München, Deutschland) Dialyse Spectra/Por Membrane, MWC (Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, USA) Elektrophorese Typ P8DS, wl Separation Systems Inc. (Portsmouth, USA) Protean II xi Cell (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) PhastSystem TM (GE Healthcare, Schweden) ESCA PHI Quantera XPS (Physical Electronics Inc., Chanhassen, USA) 0,45 µm Filter Zapcap -CR (Schleicher & Schuell MicroScience GmbH, Dassel, Deutschland) GC CP-3380 (Varian Inc., Palo Alto, USA) GC Säule Roti Cap-5-0,25 µm, 30 m x 0,25 mm ID (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland) GC-MS Finnigan Trace GC ultra, Finnigan MAT 95XP (Thermo Electron, Waltham, USA) GC-MS Säule Thermo TR-5MS, 30 m x 0,25 mm ID 0,25 µm, C12 (Thermo Electron, Waltham, USA)

73 Material und Methoden 56 HPLC Äkta Basic 10 (Pumpe P-903, Detektor UV-900, Fraktionssammler Frac-900, Motor Valve PV-908, Injektionsventil Inv-907, Mischkammer M ml) (GE Healthcare, München, Deutschland) Elite LaChrom (Pump L-2130, Diode Array Detector L- 2455, Autosampler L-2200, Column oven L-2350) (VWR Hitachi, Darmstadt, Deutschland) Inkubationsschüttler Innova 4400 (New Brunswick Scientific Co., Edison, USA) Heraeus T12 (Kendro Laboratory Products GmbH, Wien, Österreich) Schüttler Typ 3006 (GFL - Gesellschaft für Labortechnik mbh, Burgwedel, Deutschland) Isoelektrische Fokusierung PhastSystem TM, PhastGel IEF 3-9 und PhastGel IEF 4-6,5 (GE Healthcare, München, Deutschland) LC-MS HP 1100 Serie HPLC Technologie (Agilent Technologies, Santa Clara, USA), UV Detektor (Cohesive Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc., Franklin, USA), Massenspektrometer Esquire 3000 plus mit Elektrospray-Ionisation und Ionenfalle (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland) LC-MS Säule Gemini Säule 150 x 2,00 mm 5 µ C18 110A (Phenomenex, Aschaffenburg, Deutschland) MALDI Tof/Tof Bruker Photometer Cary 50 Bio UV-Visible Spectrophotometer (Varian Inc., Palo Alto, USA) Plattenleser PowerWave XS (Bio-Tek, Instruments, Bad Friedrichshall, Deutschland)

74 Material und Methoden 57 Power supply Typ E844 (Consort nv, Turnhout, Belgium) Rundfilter Durchmesser 90mm (Schleicher & Schuell MicroScience GmbH, Dassel, Deutschland) Säulenmaterial Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (low sub) (GE Healthcare, München, Deutschland) Toyopearl DEAE-650M (Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Germany) Superdex 200 prep grade (GE Healthcare, München, Deutschland) Säule RP Chromsep HPLC Colum SS 250 x 4,6 mm Microsorb C18 (Varian Inc., Palo Alto, USA) Schüttler HTM 130L (HLC Biotech, Bovenden, Deutschland) Sequenzer Procise clc Sequencing System, Model 492cLC (Applied Biosystems, Foster City, USA) Thermoblock für Derivatisierung Typ BBA2 (Grant-Boekel, Grant Instruments, Cambridge, UK) Zentrifuge Rotina 46R (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland) Micro R22 (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland)

75 Material und Methoden Software Folgende Software wurde für Analysen oder die Auswertung von Analysen oder Datensätzen verwendet: Cary WinUV Kinetics (Varian Inc., Palo Alto, USA) Unicorn 3.21 (GE Healthcare, Uppsala, Schweden) PyML (DeLano Scientific, San Carlos, USA) Varian Star 5.5 (Varian Inc., Palo Alto, USA) EZChrom Elite (VWR, Darmstadt, Deutschland) Xcalibur 1.4 (Thermo Electron, Waltham, USA) KC4 v3.3 (Bio-Tek, Instruments, Bad Friedrichshall, Deutschland) Nährmedien Die Medien wurden 20 min bei 121 C und 1 bar Überdruck autoklaviert. Temperaturlabile Lösungen wurden sterilfiltriert und nach dem Autoklavieren und Abkühlen steril dem Medium zugeführt. Soweit nicht anders angegeben wurden die Medienbestandteile in deionisiertem Wasser gelöst. Für die Herstellung von festen Medienplatten wurden der Kulturlösung vor dem Autoklavieren 15 g/l Agar zugesetzt. Czapek-Medium (Vollmedium) Saccharose 30 g/l NaN 3 3,0 g/l K 2 HP 4 1,0 g/l MgS 4 x 7 H 2 0,5 g/l KCl 0,5 g/l FeS 4 x 7 H 2 0,001 g/l Hefeextrakt 2,0 g/l Pepton 5,0 g/l ph-wert 7,3 MSV-Medium (Mineralsalz-Spurenelement-Vitamin-Medium) (Produktionsmedium) Pepton Mineralsalzlösung 1 Spurenelementlösung 2 5 g/l 12,5 ml/l 1 ml/l

76 Material und Methoden 59 Additiv 2 g/l Gelöst in 50 mm Phosphatpuffer ph 8 Nach dem Autoklavieren steril zugeben Vitaminlösung 3 1 ml/l Zusammensetzung der Lösungen: 1 Mineralsalzlösung: 0,4 g/l CaC 3 ; 6 g/l KH 2 P 4 ; 1 g/l MgS 4 x 7 H 2 ; 1 g/l NaCl; 10 g/l NH 4 Cl; 3 g/l (NH 4 ) 2 S 4 2 Spurenelementlösung: 0,01 g/l CuCl 2 x 2 H 2 ; 0,2 g/l FeCl 3 x 6 H 2 ; 0,01 g/l MnCl 2 x 4 H 2 ; 0,01 g/l Na 2 B 4 7 x 10 H 2 ; 0,01 g/l (NH 4 ) 6 Mo 7 24 x 4 H 2 ; 0,04 g/l ZnCl 2 3 Vitaminlösung: 20 mg/l p-aminobenzoat, 6 mg/l Biotin, 50 mg/l D,L-6,8-Dithiooctansäure, 20 mg/l Folsäure, 20 mg/l Niacinamid, 10 mg/l D-Panthotensäure, 100 mg/l Pyridoxalhydrochlorid, 50 mg/l Riboflavin, 10 mg/l Thiamindichlorid, 50 mg/l Vitamin B 12, Sterilfiltrieren und nach dem Autoklavieren Medium zusetzen Als Additive im MSV Medium wurde Polyethylenterephthalat und Polyethylenbutyrat in folgender Form eingesetzt: unbehandeltes, vorgewaschenes Polyethylenterephthalat-Garn (Dr. Th. Böhme KG, Geretsried, Deutschland); zyklische PET-ligomerpräparation (~90%, 9/03, Dr. Th. Böhme KG, Geretsried, Deutschland); lineare und zyklische PET-ligomerpräparation (Prof. Andreaus, FURB Universität in Blumenau, Brasilien); PET-Granulat (TEXPET A P800, particle size 4-8 mm, Texplast GmbH Wolfen, Deutschland); Polybutylenterephthalat-Garn (AMTEX Ltd., 78/34-1 CS, Barcelona, Spanien).

77 Material und Methoden Suberin- und Cutin-Präparationen Die Suberinpräparation wurde durch die Behandlung von Kartoffelschalen mit einem Ammoniumoxalat-xalsäure-Puffer bei 100 C und 24 Stunden Inkubation unter Rühren hergestellt. Die Schalen wurden mit dest. Wasser gespült, getrocknet und zerkleinert (Fernando et al. 1984). Die Cutinpräparation wurde wie oben beschrieben aus Apfelschalen gewonnen. Nach dem Waschen der Schalen mit Wasser erfolgte die Behandlung mit Cellulase (Sigma, 5 g/l), Amylase (Sigma, 1 g/l) und Pektinase (Aspergilus niger, Fluka, 1 g/l) in Natriumacetat Lösung (ph 5, 50 mm) für 30 C und 16 Stunden. Die Reste wurden getrocknet und im Soxhlet mit Chloroform für Stunden extrahiert. Die Enzymbehandlung und Extraktion wurde noch zweimal wiederholt und die Reste wurden getrocknet und zerkleinert (Fernando et al. 1984) PET-Substrate für die Abbauuntersuchungen Die Abbauuntersuchungen erfolgten an drei verschiedenen PET Substraten, welche im gleichen Gewichtsverhältnis zum Einsatz kamen. Zu den Substraten gehörte eine APET Folie (Vertommen et al. 2005), welche 3% (w/w) Isophthalat enthielt, um amorphe Regionen in der Folie zu erzeugen. Diese wurde bereitgestellt von Herrn Dr. V.A. Nierstrasz, Universität Gent. Das zweite Substrat waren unbehandelte PET-Fasern, erhalten von der Firma Dr. Th. Böhme KG Geretsried, welche für die Inkubation in etwa 1 cm große Stücke geschnitten wurden. Als drittes Substrat wurde eine zyklische PET Trimerpräparation eingesetzt, welche mittels Soxlett-Extraktion mit Dichlormethan und 1,4- Dioxan aus PET Stoffen gewonnen wurden. Die PET Stoffe wurden ebenfalls von der Firma Dr. Th. Böhme KG Geretsried bezogen Puffer und Lösungen Soweit nicht anders angegeben wurden die Substanzen in deionisiertem Wasser gelöst. 50% Acetonitril Acetonitril 500 ml/l 47.5%iges Acetonitril / 5%ige TFA Lösung Acetonitril 475 ml/l TFA 50 ml/l Acrylamidstammlösung Acrylamid 292 g/l N,N -Methylenbisacrylamid 8 g/l

78 Material und Methoden 61 Aktivitätsfärbelösung Lösung 1: 2-Naphthyl Acetat 20 mg (SDS-PAGE) Aceton 5 ml 100 mm Tris/HCl ph 7,5 50 ml Lösung 2: Fast Red TR Salt 50 mg 100 mm Tris/HCl ph 7,5 50 ml Die Lösungen vor der Färbung frisch herstellen und im Verhältnis 1:1 mischen. Chloroform/Methanol Gemisch Chloroform 85 ml (Extraktion) Methanol 15 ml 100 mm Citrat-Phosphat-Puffer Lösung 1: 100 mm Citronensäure x H 2 21,01 g/l Lösung 2: 100 mm Na 2 HP 4 x 2 H 2 35,6 g/l Lösung 1 wurde mit Lösung 2 auf ph 3, 4, 5, 6 und 7 eingestellt. Coomassie-Färbelösung Coomassie Brilliant Blue R250 0,02 g/l Methanol 450 ml/l Eisessig 90 ml/l Coomassie-Entfärbelösung Methanol 100 ml/l Essigsäure (96%) 75 ml/l 100 mm DTT Stammlösung Dithiothreitol 15,42 g/l (Inhibitoruntersuchungen) (gelöst in 25 mm Phosphatpuffer ph 8) 10 mm DTT Lösung Dithiothreitol 1,54 g/l 100 mm EDTA Stammlösung EDTA 37,23 g/l (gelöst in 25 mm Phosphatpuffer ph 8) Elektrodenpuffer Tris 3 g/l Glycin SDS 14,4 g/l 1 g/l

79 Material und Methoden mm Glycin-NaH Puffer Lösung 1: 100 mm Glycin 7,51 g/l 100 mm NaCl 5,84 g/l Lösung 2: 0,1 M NaH Lösung 1 wurde mit Lösung 2 auf ph 9, 10 und 11 eingestellt. 50 mm Jodacetamidlösung Jodacetamid 9,25 g/l 50 mm Natriumacetat Natriumacetat 4,1 g/l Mit konzentrierter HCl wurde ph 5 eingestellt. 100 mm NH 4 HC 3 NH 4 HC 3 7,9 g/l 10 mm p-np Acetat (gelöst in Ethanol absolut) p-npa 1,811 g/l (Lagerung bei 20 C) 10 mm p-np Butyrat (gelöst in Ethanol absolut) p-npb 2,09 g/l (Lagerung bei 20 C) 10 mm p-np Caprylat (gelöst in Ethanol absolut) p-npc 2,65 g/l (Lagerung bei 20 C) 10 mm p-np Palmitat (gelöst in Ethanol absolut) p-npp 3,78 g/l (Lagerung bei 20 C) 100 mm Phosphatpuffer Lösung 1: NaH 2 P 4 x 2 H 2 15,6 g/l Lösung 2: Na 2 HP 4 14,2 g/l Lösung 2 mit Lösung 1 auf ph 8 eingestellt. Andere Konzentrationen des Puffers wurden durch Verdünnen der Stammlösung hergestellt. 20 mm Phosphatpuffer 1 M NaCl NaCl 58,44 g/l 20 mm Phosphatpuffer, 30% Isopropanol Isopropanol 300 ml/l 100 mm PMSF Stammlösung Phenylmethylsulfonylfluorid 17,42 g/l (Lagerung bei 4 C) (gelöst in Isopropanol)

80 Material und Methoden 63 Proteinbestimmung Roti -Quant, 5fach Konzentrat zur Proteinbestimmung Puffer für die Kartoffelschalenbehandlung Ammoniumoxalat 16 g/l xalsäure 4 g/l Puffer für p-npc und p-npp Gum arabicum 1 g/l Deoxycholat 2 g/l (gelöst in 100 mm Phosphatpuffer ph 7,5) Renaturierungslösung Triton X-100 0,5 ml 100 mm Tris/HCl ph 7,5 100 ml Sammelgelpuffer Tris 60,46 g/l SDS 4 g/l HCl ph 6,8 Silberfärbelösungen Lösung 1: Ethanol 400 ml/l Essigsäure (96%) 100 ml/l Lösung 2: Ethanol 400 ml/l Essigsäure (96%) 100 ml/l Formaldehyd 10 ml/l Lösung 3: Silbernitrat-Färbelösung (frisch ansetzen) NH 4 H 2 ml 0,1 N NaH 28 ml AgN 3 (20%) 5 ml (tropfenweise unter ständigem Rühren zugeben, die Lösung muss klar bleiben) dest. Wasser 115 ml Lösung 4: Entwickler-Lösung (frisch ansetzen) Formaldehyd 1 ml/l Zitronensäure 0,25 g/l Mit NaH den ph-wert 7,3 einstellen. Lösung 5: Essigsäure (96%) 50 ml/l Lösung 6: Essigsäure (96%) 10 ml/l

81 Material und Methoden 64 SDS-Probenpuffer (50 ml, 5-fach) SDS 1,25 g EDTA 18,6 mg Bromphenolblau 2 mg β-mercaptoethanol 2,5 ml Glycerin 20 ml 100 mm Tris/HCl ph 6,8 25 ml Sporenfärbung nach Wirtz Lösung 1: Malachitgrün-xalat 50 g/l Lösung 2: Safranin 5 g/l 100 mm TPCK Stammlösung Tosyl-L-phenylalanine- 35,18 g/l (gelöst in Ethanol absolut, Lagerung bei 4 C) chloromethylketon Trenngelpuffer Tris 181,5 g/l SDS 4 g/l HCl ph 6,8 0,1% Trifluoressigsäure TFA 1 ml/l 100 mm Tris/HCl Tris 12,1 g/l Mit konzentrierter HCl wurde der gewünschte ph-wert eingestellt. Andere Konzentrationen des Puffers wurden durch Verdünnen der Stammlösung hergestellt. 20 mm Tris/HCl ph 8; 0,15 M NaCl NaCl 8,77 g/l Trypsinlösung bzw. Chymotrypsinlösung 0,5 µg/µl Protein in 1 mm HCl 2 µl 50 mm NH 4 HC 3 18 µl

82 Material und Methoden Mikrobiologische Methoden Stammhaltung und Kultivierung Die Kultivierung von T. fusca KW3 erfolgte in einem 300 ml Schüttelkolben mit 50 ml Czapek-Medium für 2 Tage bei 50 C und 100 rpm. Zur mittelfristigen Aufbewahrung bzw. Vereinzelung wurde die Kultur auf Czapek-Agarplatten ausplattiert und ebenfalls 2 Tage bei 50 C inkubiert Mikroskopische Untersuchungen Zellen von T. fusca wurden auf einem bjektträger in physiologischer Kochsalzlösung ausgestrichen. Nach dem Lufttrocknen erfolgte eine Färbung der Zellen mit Malachitgrün für 10 Minuten. Nach Entfernung der Färbelösung wurden die bjektträger einmal hitzefixiert und dann gründlich mit demineralisiertem Wasser gespült. Die Gegenfärbung erfolgte mit Safraninlösung 15 Sekunden lang. Nach dem Spülen mit demineralisiertem Wasser und Lufttrocknen des bjektträgers konnten die Zellen bei einer 1000fachen Vergrößerung mit Immersionsöl mikroskopisch betrachten werden Trockengewichtsbestimmung Für die Trockengewichtsbestimmung wurden Rundfilter verwendet, die zunächst bis zur Gewichtskonstanz 24 Stunden im Trockenschrank bei 105 C getrocknet, im Exsikkator abgekühlt und bis zum weiteren Gebrauch dort aufbewahrt wurden. Das Ausgangsgewicht der Filter wurde dann an einer Feinwaage bestimmt. 3 x 250 ml Czapek-Medium wurden mit T. fusca KW3 angeimpft und 7 Tage in einem Schüttler bei 50 C und 150 rpm kultiviert. Täglich wurden 10 ml Probe entnommen. Die Zellen wurden über eine Filternutsche und einen Rundfilter durch Anlegen eines Vakuums von der Nährlösung getrennt. Der Rundfilter wurde anschließend mit 10 ml demineralisiertem Wasser gespült, um Reste der Nährlösung zu entfernen. Nachdem die Flüssigkeit vollständig abgesaugt wurde, erfolgte die Trocknung des Filters im Trockenschrank bei 105 C über Nacht. Nach dem Abkühlen im Exsikkator wurde das Gewicht des Filters bestimmt. Die Trockenmasse wurde aus der Differenz der Filtergewichte und dem Volumen der Probe berechnet.

83 Material und Methoden Proteinchemische Methoden T. fusca KW3 wurde in 500 ml MSV-Medium mit unbehandelten PET-Fasern bei 50 C und 150 rpm kultiviert, um eine maximale Ausbeute an Esterase zu erhalten. Aller 24 h wurden 200 µl Proben für die Esteraseaktivitätsbestimmung entnommen (siehe 2.4.1). Die Proben wurden abzentrifugiert (10 min, rpm, RT) und die Überstände für den Nachweis eingesetzt. Nach 10 Tagen Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugation (4000 rpm, 20 min, 4 C) entfernt. 200 µl Überstand wurden erneut für die Esteraseaktivitätsbestimmung (siehe 2.4.1) entnommen. Der zellfreie Überstand wurde im Gefriertrockner aufkonzentriert und bei 21 C bis zur weiteren Aufreinigung gelagert. Die Aufreinigung erfolgte bei Raumtemperatur Proteinaufreinigung der Wildtyp TfCa Der gefriergetrocknete Überstand wurde in einem Aliquot demineralisiertem Wasser gelöst und gegen demineralisiertes Wasser für 5-6 Stunden dialysiert. Die Enzymlösung wurde anschließend zentrifugiert (15 min bei x g, 22 C) und der klare Überstand mit 100 mm Phosphatpuffer (ph 8) auf 20 mm eingestellt. Die chromatographische Aufreinigung erfolgte mit einem Äkta Basic 10 HPLC-System. Alle verwendeten Puffer wurden vor Benutzung filtriert und entgast, die Chromatographiesäulen wurden zunächst mit dem Startpuffer equilibriert. Die Enzymlösung wurde auf eine Phenylsepharose 6 Fast Flow (high sub) XK 16/20 Säule (Säulenvolumen 25 ml), equilibriert mit 20 mm Phosphatpuffer ph 8, aufgetragen. Die Elution erfolgte mit einem Gradienten von 0 bis 100% des Elutionspuffers, 30% Isopropanol in 20 mm Phosphatpuffer ph 8. Die aufgefangenen Fraktionen mit Esteraseaktivität wurden vereinigt und das Isopropanol wurde durch Evaporation entfernt. Die vereinigten Fraktionen wurden auf eine DEAE-650M XK 16/40 Säule (Säulenvolumen 54 ml), equilibriert mit 20 mm Phosphatpuffer ph 8, aufgetragen und eluiert mit 1 M NaCl in 20 mm Phosphatpuffer ph 8. Die Fraktionen wurden auf Esteraseaktivität getestet. Fraktionen mit Esteraseaktivität wurden vereinigt und dialysiert gegen 20 mm Phosphatpuffer ph 8. Die vereinigten Fraktionen wurden auf eine HiTrap ctyl Fast Flow Säule (Säulenvolumen 1 ml) aufgetragen und eluiert mit 30% Isopropanol in 20 mm Phosphatpuffer ph 8. Die Fraktionen mit Esteraseaktivität wurden vereinigt und das Isopropanol wurde durch Evaporation entfernt. Die vereinigten Fraktionen wurden auf eine Superdex 200 prep grade XK 16/70 Säule (Säulenvolumen 110 ml) equilibriert mit 0,15 M NaCl in 20 mm Phosphatpuffer ph 8 aufgetragen und eluiert. Die Fraktionen wurden auf Esteraseaktivität getestet.

84 Material und Methoden 67 Nach jedem Reinigungsschritt wurde ein Aliquot der vereinigten Fraktionen entnommen und für die SDS-PAGE Analyse aufbereitet Proteinaufreinigung der rekombinanten TfCa, TfCut1 und TfCut2 Von 3 PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 wurde das jeweilige Gen isoliert, in den Vektor pet21b(+) eingeschleust und in E. coli BL21(DE3) transformiert. Die Proteine besaßen ein His 6 -Tag für die spätere Aufreinigung. Die Produktion der rekombinanten Cutinase TfCut1 und TfCut2 und der Carboxylesterase TfCa erfolgte bei 18 C im LB-Medium sowohl im Schüttelkolben als auch im 5 L Fermenter. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen mit Ultraschall aufgeschlossen und der partikelfreie Überstand für die chromatographische Aufreinigung verwendet. Alle beschriebenen Vorarbeiten wurden von Herrn Thorsten eser und Herrn Ren Wei im Rahmen ihrer Dissertationen entwickelt und beschrieben (eser et al. 2010, Chen S et al. 2008). Die Aufreinigung der rekombinanten Hydrolasen erfolgte mittels eines Äkta Basic 10 HPLC-System. Die HisTrap FF Crude Säule (Säulenvolumen 2 x 5 ml) wurde zunächst mit einem 50 mm Phosphatpuffer mit 300 mm NaCl ph 8 equilibriert und anschließend der partikelfreie Überstand aufgetragen. Es erfolgte eine Gradientenelution (10 Säulenvolumen) bis 100% 50 mm Phosphatpuffer mit 300 mm NaCl und 250 mm Imidazol ph 8. Die Fraktionen wurden auf Esteraseaktivität getestet. Fraktionen mit Esteraseaktivität wurden vereinigt und auf eine Superdex 200 prep grade XK 26/60 Säule (Säulenvolumen 320 ml) equilibriert mit 0,15 M NaCl in 20 mm Phosphatpuffer ph 8 aufgetragen und eluiert. Die Fraktionen wurden auf Esteraseaktivität getestet. Nach jedem Reinigungsschritt wurde ein Aliquot der vereinigten Fraktionen entnommen und für die SDS-PAGE Analyse aufbereitet. 2.4 Analytische Methoden Esterase-Aktivitätsbestimmung Bei diesem Nachweis wird das nach enzymatisch katalysierter Spaltung von chromogenen para- Nitrophenyl-Acylestern freigesetzte gelbe para-nitrophenol bei 410 nm spektrophotometrisch bestimmt (Purdy und Kolattukudy 1973). Ein Unit (U) ist definiert als die Menge an Enzym, die 1 µmol p-npb pro Minute freisetzt.

85 Material und Methoden Bestimmung mittels Spektrophotometer Zu 940 µl 100 mm Phosphatpuffer ph 7,5 erfolgte die Zugabe von 10 µl 10 mm p-nitrophenylbutyrat als Substrat. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µl Enzymlösung gestartet, wobei die Messung 30 Sekunden danach im Cary 50 Bio UV-Visible Spektrophotometer bei 410 nm für eine Minute erfolgte. Die Enzymaktivität wurde in U/ml angegeben Bestimmung mittels Plattenleser Zu 80 µl 100 mm Phosphatpuffer ph 7,5 erfolgte die Zugabe von 10 µl 5 mm p-nitrophenylbutyrat als Substrat. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl Enzymlösung gestartet, wobei die Messung 10 Sekunden danach im Plattenleser PowerWave XS bei 410 nm für fünf Minuten erfolgte. Die Enzymaktivität wurde in U/ml angegeben. Die Messung des Blindwerts erfolgte mit 10 µl Puffer anstatt der Enzymlösung Cutinase-Aktivitätsbestimmung Bei diesem Nachweis werden die durch die enzymatisch katalysierte Spaltung des Biopolyesters Cutin entstehenden Monomere, meist C16 und C18 Hydroxyfettsäuren, durch eine Gaschromatographische Analyse nachgewiesen (Chen S et al. 2008). Das Enzym wurde mit 10 mg Cutinpräparation in 500 µl Phosphatpuffer (25 mm, ph 8) bei 50 C 72 Stunden inkubiert. 500 µl Eisessig wurden dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die freigesetzten Cutinmonomere mit 3 ml Chloroform nach kräftigem Schütteln und Zentrifugation (2000 rpm, 10 min, RT) extrahiert und unter Stickstoffbegasung eingedampft. Die Abbauprodukte wurden in 1 ml Chloroform/Methanol-Gemisch (85:15) aufgenommen, in GC Vials überführt und unter Stickstoff erneut getrocknet. Die Produkte wurden mit MSTFA syliliert und analysiert per GC-MS. Zum Vergleich wurde eine Negativkontrolle der Reaktion ohne Enzymzugabe mit inkubiert und detektiert. Als zusätzlicher Vergleich wurde Cutin chemisch hydrolysiert und die entstandenen Monomere ebenfalls wie oben beschrieben aufgenommen, derivatisiert und per GC-MS analysiert. Die chemische Hydrolyse erfolgte zum einen von 50 mg Cutin in 30 ml Tetrahydrofuran mit 2,5-fachem Gewichtsüberschuss von LiAlH 4. Die Lösung wurde für 72 Stunden bei Raumtemperatur schüttelnd inkubiert und anschließend mit 100 ml dest. Wasser versetzt. Die erhaltene Lösung wurde mit 4 ml HCl angesäuert und mit Di-Ethylether die entstandenen Monomere extrahiert (5 x 150 ml). Die organische Phase wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat von verbleibenden Wasserresten befreit und unter Vakuum vollständig getrocknet (Walton und Kolattukudy 1972). Eine weitere Hydrolyse

86 Material und Methoden 69 von 50 mg Cutin erfolgte in 30 ml 95% Ethanol alkalisch mit 3 g Kaliumhydroxid. Die Lösung wurde unter Stickstoffatmosphäre 72 Stunden bei Raumtemperatur schüttelnd inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit 4 ml HCl angesäuert und die entstandenen Cutinmonomere mit Di- Ethylether extrahiert (5 x 100 ml). Die organische Phase wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat von verbleibenden Wasserresten befreit und unter Vakuum vollständig getrocknet (Gerard et al. 1992) PCL-Abbauuntersuchung Poly(ε-caprolacton) gilt als Modellsubstrat für Cutinasen und wurde zur genaueren Spezifikation der untersuchten Enzyme eingesetzt. Die Untersuchung des PCL Abbaus erfolgte als Screening Methode auf Agarplatten und zur Bestimmung von Abbauraten mittels Plattenleser Bestimmung mittels Hofbildung Zunächst wurden in die Agarplatten (18 g/l Agar in 25 mm Phosphatpuffer ph 8, nach dem Autoklavieren wurden 50 ml/l 1%ige PCL Stammlösung in Aceton zugegeben und die Platten gegossen) ein Loch gestanzt, in das die Enzymlösung gegeben wurde. Die Platten wurden bei optimaler Temperatur 24 Stunden inkubiert und die Hofbildung anschließend ausgewertet Bestimmung mittels Plattenleser Zunächst wurden 0,5 ml PCL Stammlösung (0,27 g PCL in 50 ml Aceton) in 9,5 ml 100 mm Phosphatpuffer ph 7,5 frisch durch mehrfaches Durchmischen suspendiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl Enzymlösung gestartet, wobei die Messung der Klärung 10 Sekunden danach im Plattenleser PowerWave XS bei 600 nm für 10 Minuten erfolgte. Die Enzymaktivität wurde als Abbaurate in mg min -1 ml -1 angegeben. Die Messung des Blindwerts erfolgte mit 10 µl Puffer anstatt der Enzymlösung Quantitative Protein-Bestimmung nach Bradford (1976) Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit einer Roti-Quant Lösung. 200 µl der Roti- Quant Lösung wurden auf 800 µl der zu bestimmenden Proteinlösung pipettiert, gevortext und fünf Minuten inkubiert. Die Analyse erfolgte spektrophotometrisch bei 595 nm und die Konzentration mit einer zuvor erstellten Kalibrierkurve mit BSA als Protein berechnet.

87 Material und Methoden SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Die PAGE wurde nach Laemmli (1970) mit SDS durchgeführt. Als molekularer Standard (MW range Da) wurde der LMW-Marker von der Firma GE Healthcare verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte in einem 12,5%igen Trenngel und einem 4%igen Sammelgel. In Tabelle 10 sind die Mengenangaben der Lösungen zur Herstellung des SDS Gels zusammengefasst. Tabelle 10: Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels. Lösungen Trenngel (12,5%) Sammelgel (4%) Trenngelpuffer 2,6 ml --- Sammelgelpuffer --- 0,78 ml Acrylamidstammlösung 4,36 ml 0,47 ml Wasser, reinst 3,44 ml 1,88 ml Natriumsulfit 3-5 Kristalle pro Gel Ammoniumpersulfat (40%) 10 µl 1,1 µl TEMED 5 µl 2,2 µl Die Glasplatten wurden mit Ethanol entfettet. Zunächst wurde das Trenngel bis zu 2/3 in die Gelkammer gegossen, mit Isopropanol überschichtet und für eine Stunde auspolymerisiert. Nach Entfernen des Isopropanols wurde das Sammelgel gegossen, der Gelkamm eingesetzt und für eine weitere Stunde auspolymerisiert 20 µl Proteinlösung und 5 µl SDS-Probenpuffer (5-fach) wurden gemischt, für 5 min bei 100 C inkubiert und nach dem Abkühlen in die Taschen eingefüllt. Die Proteinauftrennung erfolgte bei 100 V und 4 C Esteraseaktivitäts-Färbung Bei dieser Färbung wird das nach enzymatisch katalysierter Spaltung von 2-Naphthylacetat freigesetzte 2-Naphthol, welches mit Fast Red einen farbigen Komplex eingeht, visuell bestimmt. Dazu wurde das Gel zunächst in 100 ml 100 mm Tris/HCl ph 7,5 und 0,5% Triton X-100 für 30 min renaturiert und anschließend mit den frisch hergestellten Färbelösungen (Lösung 1 und Lösung 2) gefärbt bis rote Banden sichtbar wurden. Anschließend erfolgte eine Entfärbung des Gels bei Bedarf mit einer Entfärbelösung.

88 Material und Methoden Coomassie-Färbung Proteine im Gel wurden mit Coomassie Brilliant Blau R-250 gefärbt (Weber und sborn 1969) und die Entfärbung erfolgte mit einer frisch hergestellten Entfärbelösung Silberfärbung der Proteine Die Silberfärbung der Proteine wurde nach Kleber, Schlee und Schöpp (1997) durchgeführt. Der Zeitliche Ablauf der Färbung ist in Tabelle 11 dargestellt. Gel mit Lösung 1 schwenken Gel mit Lösung 2 schwenken Tabelle 11: Zeitlicher Ablauf der Silberfärbung. Schritt Gel mit demineralisiertem Wasser schwenken Gel mit Lösung 3 schwenken Gel mit demineralisiertem Wasser schwenken Entwicklung in Lösung 4 bis zur Bildung von braunen Flecken auf klarem Grund Abstoppen mit Lösung 5 Lagerung in Lösung 6 Färbezeit 2 x 1 Stunde 1 Stunde 3 x 40 Minuten 15 Minuten 3 x 10 Minuten Bestimmung des pi Die Bestimmung des isoelektrischen Punktes der gereinigten Carboxylesterase erfolgte mit dem PhastSystem TM Gelelektrophorese-System mit einem PhastGel IEF 3-9 Gel und IEF 4-6,5 und dem Kalibrierkit für pi Bestimmung durch Isoelektrische Fokusierung, Broad range pi (ph 3-10). Das Protein wurde in verschiedenen Konzentrationen auf das Gel aufgetragen und fokusiert (IEF 3-9: 2000 V; 2,5 A; 3,5 W; 15 C; 410 Vh; IEF 4-6,5: 2000 V; 5,0 ma; 3,5 W; 15 C; 410 Vh; PhastSystem TM ). Nach der Ausrichtung des Proteins wurden die Gele mittels Silberfärbung angefärbt. Die Standard- Proteine zur Berechnung des pi waren Amyloglucosidase (pi 3,5), Trypsininhibitor (pi 4,55), β- Lactoglobulin A (pi 5,20), Bovine carbonic anhydrase B (pi 5,85), Human carbonic anhydrase B (pi 6,55), Myoglobin-acid band (pi 6,85), Myoglobin-base band (pi 7,35), Lentil lectinacidic band (pi 8,15), Lentil lectin-middle band (pi 8,45), Lentil lectin-basic band (pi 8,65) und Trypsinogen (pi 9,3).

89 Material und Methoden Bestimmung der Molaren Masse Für die Bestimmung des Molekulargewichtes der extrazellularen Esterase wurden die Enzymlösung und der SDS Elektrophorese Standard Roti -Mark mit einer SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem Gel erfolgte eine Aktivitäts- und Coomassie-Färbung. Die Laufstrecken der Proteine des Standards und der Esterase wurden bestimmt. Die bestimmten Laufstrecken der Standards wurden gegen den Logarithmus des Molekulargewichts der Proteine aufgetragen und somit eine Formel zur Berechnung des Molekulargewichts erhalten. Damit konnte das Molekulargewicht der Esterase berechnet werden Bestimmung der Temperatur und ph-wert Stabilität Zur Bestimmung der ph Stabilität erfolgte die Inkubation der Esterase bei 23 C für 7 Tage in Puffern von ph 3 bis 11. Citrat-Phosphat-Puffer wurde für ph 3 bis 7 verwendet, Phosphatpuffer für ph 8 und Glycin-NaH Puffer für ph 9 bis 11. Die Esteraseaktivität wurde mit dem Esteraseaktivitätsmessung bestimmt. Die Bestimmung der Temperaturstabilität der Esterase erfolgte bei Temperaturen von 30 bis 55 C in einem 25 mm Phosphatpuffer für 7 Tage. Die Esteraseaktivität wurde mit dem Esteraseaktivitätsmessung bestimmt Bestimmung der Stabilität gegenüber Inhibitoren Die Esterase wurde mit den Inhibitoren EDTA, Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), Tosyl-Lphenylalanine-chloromethylketon (TPCK) und Dithiothreitol (DTT) bei 30 C für 15 min inkubiert. EDTA wurden in den Konzentrationen 1 mm und 10 mm und DTT mit 0,1 mm; 1 mm und 10 mm in 25 mm Phosphatpuffer ph 8 eingesetzt. PMSF wurde, in Methanol gelöst, mit einer Endkonzentration von 0,1 mm; 1 mm und 10 mm eingesetzt. TPCK, gelöst in Isopropanol, wurde mit den Endkonzentrationen 0,1 mm; 1 mm und 10 mm verwendet. Die Esteraseaktivität wurde mit dem Esteraseaktivitätsnachweis mit p-npb als Substrat bei 410 nm spektrophotometrisch bestimmt Bestimmung der kinetischen Konstanten für die Hydrolyse von p-np Ester Die Substratspezifität gegenüber p-np Estern und Triacylglyceride mit verschiedener Kettenlänge wurde bestimmt. Die Aktivität gegenüber den p-np Estern wurde spektrophotometrisch bei 410 nm mittels Esteraseaktivitäts-Assay determiniert.

90 Material und Methoden Bestimmung der kinetische Konstanten für die Hydrolyse von CTR Die kinetischen Konstanten für den Abbau von zyklischen PET-Trimeren wurden bestimmt. Die Trimere, gelöst in 1,4-Dioxan, wurden in 25 mm Phosphatpuffer ph 8 gelöst und es erfolgte eine Inkubation mit der Esterase bei 50 C für einer Stunde. Die entstandenen Abbauprodukte wurden mittels Reversed Phase HPLC aufgetrennt und bei 241 nm spektrometrisch detektiert Bestimmung optimaler Temperatur und ph-wert für die Hydrolyse von CTR Der optimale ph-wert wurde bestimmt mit einem Reaktionsgemisch gelöst in Citrat-Phosphat-Puffer für ph 3 bis 7, Phosphatpuffer für ph 8 oder Glycin-NaH Puffer für ph 9 bis 11. Alle Puffer besaßen eine Ionenstärke von 100 mm und der Abbau erfolgte bei 50 C. Der Puffer wurde vortemperiert bei 50 C, das Substrat, zyklische PET Trimere gelöst in 1,4-Dioxan, wurde vor Beginn der Reaktion in den Puffer gegeben und gemischt. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Esterase gestartet. Die Inkubation erfolgte für eine Stunde und die gebildeten Produkte wurden per Reversed Phase HPLC aufgetrennt und bei 241 nm detektiert. Die optimale Temperatur wurde bestimmt mit zyklischen Trimeren, gelöst in 1,4-Dioxan, als Substrat und dem optimalen ph-wert, welcher zuvor bestimmt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in 25 mm Phosphatpuffer ph 8 suspendiert und der Abbau erfolgte bei 30 bis 55 C. Der Puffer wurde vortemperiert, das Substrat zugegeben und gemischt. Durch die Zugabe der Esterase erfolgte der Start des Abbaus, welcher eine Stunde inkubiert wurde. Die gebildeten Produkte wurden per Reversed Phase HPLC aufgetrennt und bei 241 nm detektiert N-terminale Sequenzierung Die N-terminale Sequenzierung der Esterase erfolgte durch die Arbeitsgruppe Biochemie und Bioorganische Chemie am Institut für Biochemie, Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie der Universität Leipzig. Dafür wurde die Esterase in einem 12,5% SDS Gel aufgetrennt, auf eine PVDF Membran geblottet und mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt. Die entsprechende Bande wurde ausgeschnitten, halbiert und in den Sequenzer gegeben. Es wurden die ersten 10 Aminosäuren des Proteins sequenziert.

91 Material und Methoden MALDI-TF Sequenzierung Die Esterase wurde im 12,5%igen SDS-Gel aufgetrennt und mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt. Die entsprechende Proteinbande wurde aus dem Gel ausgeschnitten, im 1 mm große Stücke geteilt und mit 100 µl Aqua bidest. 10 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Entfernen des Wassers wurde 100 µl 50% Acetonitril zugegeben und der Ansatz nochmals 10 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt. Der Überstand wurde abgenommen und es erfolgte eine Inkubation der Gelstücke in 80 µl 100% Acetonitril bei Raumtemperatur für 5 min unter Schütteln. Danach erfolgte die Zugabe von 80 µl 100 mm NH 4 HC 3. Nach 10 min Schütteln bei Raumtemperatur wurde der Überstand komplett entfernt und die Gelstücke im einem Vakuumkonzentrator getrocknet. Die getrockneten Gelstücke wurden zur Reduktion und Alkylierung in 80 µl frisch hergestellter 10 mm DTT Lösung für 45 min bei 56 C inkubiert. Nach dem Abkühlen wurde der Überstand abgenommen und sofort 80 µl 50 mm Jodacetamidlösung zugeben (Inkubation im Dunkeln für 30 min). Der Überstand wurde abgenommen, 80 µl 100 mm NH 4 HC 3 Lösung zugegeben und 5 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurden 80 µl 100%iges Acetonitril zugegeben und 10 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Überstand wurde entfernt und die Gelstücke im Vakuumkonzentrator komplett getrocknet. Zu den Gelbanden wurde 6,6 µl Trypsinlösung bzw. Chymotrypsinlösung gegeben und anschließend mit 50 mm NH 4 HC 3 Lösung überschichtet. Der enzymatische Verdau erfolgte bei 37 C über Nacht. Um die verdauten Proteinbruchstücke aus dem Gel zu eluieren, wurde 50 µl 47,5%iges Acetonitril / 5%ige TFA Lösung zugegeben (Schütteln bei RT für 10 min). Der erhaltene Überstand wurde aufgehoben und der Schritt noch zweimal wiederholt. Die erhaltenen Überstände wurden vereinigt, eingefroren und mit dem Vakuumkonzentrator auf etwa 5 bis 10 µl aufkonzentriert. Die Lösung wurde anschließend entsalzt und für die Auftrennung der Bruchstücke auf eine Reversed Phase HPLC mit Nanopumpe aufgetragen. Die Auftrennung und die anschließende MALDI-TF Analyse erfolgte in der Arbeitsgruppe Biochemie und Bioorganische Chemie am Institut für Biochemie, Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie der Universität Leipzig. Die durch die LC aufgetrennten Proteinfragmente wurden auf Trägerplatten gespottet und jeder einzelne per MALDI-TF analysiert und anschließend elektronisch ausgewertet Abbaustudien Für die Abbauuntersuchungen wurden die gleichen Mengen an APET Folie, unbehandelten PET- Fasern und zyklischen PET-Trimeren in 10 ml Phosphatpuffer suspendiert und je 40 U der PET- Hydrolasen bzw. 25 mg der rekombinanten PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 zugegeben. Die

92 Material und Methoden 75 Enzymaktivität wurde mit p-npb als Substrat spektrophotometrisch bestimmt. Die Kolben wurden verschlossen um einer Evaporation der Flüssigkeit vorzubeugen und die Inkubation erfolgte bei 30 C für die Cutinasen aus F. solani pisi (Vertommen et al. 2005, Chen et al. 2010); 50 C für die TfCa, rekombinante TfCa, Cutinase 1 aus T. fusca WSH03-11, Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 und die Cutinase-Präparation von Novozymes; 60 C für die rekombinanten TfCut1 und TfCut2 für 74 Stunden (150 rpm). Es wurden zu verschiedenen Zeiten Proben genommen und per Umkehrphasen HPLC analysiert. Nur die Proben vom Trimer-Abbau wurden nach der Probennahme zentrifugiert (9000 rpm, 15 min) und anschließend wurden bei allen Proben der ph-wert mit 1 M HCl auf 5 bis 6 eingestellt. Die APET-Folie wurde nach der Inkubation mit der TfCa und der Cutinase aus F. solani pisi (Vertommen et al. 2005) aus der Pufferlösung entnommen, mit demineralisiertem Wasser gewaschen, mit einer 1%igen CHAPS-Lösung in Phosphatpuffer zur Entfernung der verbliebenen Proteinreste von den berflächen der Substrate bei 50 C und 150 rpm für 2 Stunden inkubiert und mit demineralisiertem Wasser gewaschen. Die Modifikationen der berflächen der Substrate durch die Inkubation mit den Enzymen wurden mit SEM analysiert Analytik der PET Abbauprodukte Die Analyse der Proben der Abbauuntersuchungen erfolgte wie bei Vertommen et al. (2005) beschrieben, jedoch mit folgenden Änderungen: Die Eluenten der polaren mobile Phase waren 0,1% TFA in Wasser (A) und Acetonitril (B) und das Injektionsvolumen der Proben war bei dem Trimerabbau 10 µl und bei den anderen Abbauexperimenten 30 µl. Es wurden Kalibrierkurven für die Standards Terephthalsäure und Bis(2-hydroxyethyl)terephthalat (BHET) angefertigt. Die detektierten Produktpeaks wurden ebenfalls per LC-MS analysiert. Diese Messungen wurden von der AG Massenspektrometrie am Institut für Analytische Chemie, Universität Leipzig durchgeführt Konzentrationabhängige CTR-Abbaustudien Die Enzyme wurden mit den verschiedenen Konzentrationen für jeweils 4 und 8 Stunden mit der gleichen Menge an CTR (15 mg/0,5 ml CTR; entspricht einer Konzentration von 30 mg/ml) bei 50 C (rtfca) und 60 C (rtfcut) bei 150 rpm inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben wie bereits beschrieben für die RP-HPLC Analyse vorbereitet und analysiert (Billig et al. 2010, Vertommen et al. 2005).

93 Material und Methoden 76 Bei den eingesetzten Enzymlösungen wurde zusätzlich die Esterase-Aktivität mit p-npb als Substrat bestimmt. 2.5 Homologie-Modelling der TfCa und weitere PET-Hydrolasen Die Erstellung des Homologie-Modells der TfCa erfolgte mit dem Programm PHYRE unter der Verwendung der thermostabilen Carboxylesterase aus G. stearothermophilus (PDB code 2GS resp. 2GT) als Vorlage (Bennett-Lovsey et al. 2008, Liu et al. 2007). Eine Plausibilitätsprüfung des endgültigen Modells durchgeführt mit dem Programm VERIFY3D zeigte bei 83% der Aminosäuren einen Messwert über 0,2, was die Übereinstimmung des Modells bestätigte (Eisenberg et al. 1997). Die modellierte Struktur der Cutinase Tfu_0882 aus T. fusca YX basierte auf der Streptomyces exfoliates Lipase (SeL) und wurde mittels dem SWISS-Model homology modeling web server erstellt (Chen S et al. 2008, Schwede et al. 2003). Das Modell der Tfu_0883 Cutinase aus T. fusca YX wurde mittels PHYRE erstellt mit der SeL als Vorlage (Bennett-Lovsey et al. 2008, Chen S et al. 2008, Liu et al. 2007). Die Strukturen der Cutinasen aus F. solani sp. pisi und P. mendocina wurden aus der NCBI Proteindatenbank entnommen ( Longhi et al. 1997, Bott et al. 2003). Die Modellierung der Cutinase aus H. insolens erfolgte mit dem WURST protein threading server (Sandal et al. 1996, Torda et al. 2004). Die dargestellten Abbildungen der Proteinstrukturen wurden mittels PyML erstellt (DeLano 2002).

94 Biotrockenmasse (mg/ml) Ergebnisse und Diskussion 77 3 Ergebnisse und Diskussion 3.1 Screening nach PET-Hydrolasen aus T. fusca Wachstum von T. fusca KW3 im Czapek-Medium Für den Einsatz von T. fusca KW3 zur Esteraseproduktion mussten zunächst Zellen in einem Vollmedium, dem Czapek-Medium, angezogen werden, welche dann anschließend im Enzymproduktionsmedium, dem Mineralsalzmedium (MSV-Medium), das gewünschte Enzym in größeren Mengen synthetisierten. Damit die Zellen sich in der exponentiellen Phase beim Überimpfen befanden, erfolgte die Aufnahme einer Wachstumskinetik des Actinomyceten T. fusca KW3 im Komplexmedium. Dafür wurden drei 250 ml Czapek-Medien mit dem Actinomyceten angeimpft und für 7 Tage bei 50 C und 150 rpm kultiviert. Täglich wurden 10 ml Probe genommen, die Zellen von der Nährlösung abgetrennt, gewaschen und bei 105 C über Nacht getrocknet. Nach dem Abkühlen der Filter im Exsikkator wurde ihr Gewicht bestimmt und die Trockenmasse aus der Differenz der Filtergewichte und dem Volumen der Probe berechnet. 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Kultivierungsdauer (d) Abbildung 25: Wachstumskurve von T. fusca KW3 im Czapek-Medium bei 50 C und 150 rpm. Die Wachstumskurve von T. fusca KW3 im Czapek-Medium wurde als Biotrockenmasse (mg/ml) über die Zeit (Tage) dargestellt (Abbildung 25). In den ersten beiden Tagen erfolgte maximales Zellwachstum in der exponentiellen Phase. Vom zweiten bis vierten Tag folgte die statische Phase,

95 Ergebnisse und Diskussion 78 bei der die Neubildungsrate gleich der Absterberate aufgrund von gebildeten toxischen Nebenprodukten und mangelnden Nährstoffen ist. In dieser Phase werden Sekundärprodukte, wie unter anderem Antibiotika, gebildet. Als letzte Phase schloss sich die Absterbephase an, bei der durch Zelllyse eine deutliche Abnahme der Biomasse erfolgt. Bei T. fusca KW3 im Czapek-Medium konnte hingegen nur ein leichter Abfall der Biotrockenmasse registriert werden. Die Kultivierung der Vorkultur für die spätere Enzymproduktion erfolgte, abgeleitet aus der oben dargestellten Wachstumskurve, in 2 Tagen. Für die Enzymproduktion im Minimalmedium ist es wichtig, möglichst wenig Saccharose aus dem Czapek-Medium mit dem Inoculum in das Produktionsmedium einzutragen, da Glucose ein Hemmer der Esteraseproduktion ist. Deshalb wurden die Zellen nach der sterilen Ernte und erfolgter Zentrifugation in sterilem 25 mm Phosphatpuffer (ph 8) des gleichen Volumens aufgenommen Wachstum von T. fusca KW3 im MSV-Medium Esterasebildung mit verschiedenen synthetischen und natürlichen Polyestern Als Mediumzusatz für eine Esteraseproduktion wurden folgende Polyester-ligomere und Polymere im MSV-Medium eingesetzt (je 2 g/l): recyceltes PET-Granulat, eine PET-ligomerpräparation, eine zyklische PET-ligomerpräparation, BHET, PBT-Fasern und Präparationen der natürlichen Biopolyester Cutin und Suberin. Dazu wurden die MSV-Medien mit den im Czapek-Medium 2 Tage vorkultivierten Zellen angeimpft. Die Kultivierung erfolgte über einen Zeitraum von 10 Tagen. Anschließend wurden die Kulturüberstände gewonnen und Proben davon auf ein SDS Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Darüber hinaus wurde eine Aktivitätsfärbung mit Fast Red und 2-Naphtylacetat durchgeführt. Sowohl unter Einsatz von PET-Fasern, recyceltem PET-Granulat, der PET-ligomerpräparation und PBT-Fasern konnte die Bildung einer ca. 52 kda großen Esterase gelelektrophoretisch nachgewiesen werden (Abbildung 26, Spur 1, 2, 3 und 6). Die zellfreien Überstände unter Verwendung der zyklischen PET ligomerpräparation bzw. BHET zeigten nur eine schwache bzw. keine Bande im SDS- PAGE (Abbildung 26, Spur 4 und 5). Mit diesen Substraten wurde nur wenig bzw. keine Esterase produziert. Hingegen konnte mit Cutin und Suberin als Substrat keine 52 kda Esterase identifiziert werden, aber dafür eine kleinere, ca. 29 kda große Esterase, allerdings in verhältnismäßig großen Mengen (Abbildung 26, Spur 7,8).

96 Ergebnisse und Diskussion kda Esterase 29 kda Esterase Abbildung 26: SDS-PAGE und Aktivitätsfärbung mit den Esterasen in den zellfreien Überständen des MSV-Mediums nach 10 tägiger Inkubation bei 50 C mit PET-Fasern (Spur 1), recyceltes PET-Granulat (Spur 2), einer PET-ligomerpräparation (Spur 3), einer zyklischen PET-ligomerpräparation (Spur 4), BHET (Spur 5), PBT-Fasern (Spur 6), einer Suberinpräparation (Spur 7) und einer Cutinpräparation (Spur 8). Ausgehend von der Zielstellung der Arbeit, eine PET-Trimere abbauende Esterase zu identifizieren, aufzureinigen und zu charakterisieren, stand die durch Kultivierung unter Verwendung der Substrate PET-Fasern, recyceltes PET-Granulat und PET-ligomerpräparation identifizierte 52 kda große Esterase zunächst im Mittelpunkt der nachfolgenden Untersuchung. Inwieweit die durch Induktion mit der Suberin bzw. Cutinpräparation identifizierte 29 kda große Esterase auch PET abbauen kann, wird zu einem späteren Zeitpunkt untersucht. Im nächsten Schritt wurden die gebildeten Esteraseaktivitäten mittels p-npb Aktivitätsbestimmung während 10-tägiger Kultivierung im MSV-Medium mit PBT-Fasern, PET-Fasern, recyceltem PET- Granulat, einer PET-ligomerpräparation, einer zyklischer PET-ligomerpräparation bzw. BHET untersucht. Die Entwicklung der bestimmten Aktivitäten ist in Abbildung 27 graphisch dargestellt und die maximal produzierten Aktivitäten sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Die höchste Esteraseaktivität von 24 mu/ml wurde mit PET-Fasern als Additiv erreicht, wobei während der 10 Tage Kultivierung die Enzymaktivität stetig zunahm. Unter Einsatz von recyceltem PET-Granulat, PBT-Fasern, einer PET-ligomerpräparation, einer zyklischer PET-ligomerpräparation und BHET konnten ebenfalls Esteraseaktivitäten gemessen werden, aber diese waren im Vergleich zur Enzymaktivität aus dem MSV-Medium mit PET-Fasern deutlich geringer. bwohl beim Einsatz von BHET als Mediumzusatz in der SDS-PAGE (Abbildung 26) keine 52 kda große Bande im zellfreien Überstand nachzuweisen war, wurde auch hier nach 3 Tagen Kultivierung eine Esteraseaktivität gemessen, die mit 21 mu/ml nur etwas geringer war als bei Verwendung von PET-Fasern als Induktor (24 mu/ml). Eine Erklärung, warum die Bande in der SDS-PAGE nach 10 Tagen Kultivierung mit BHET nicht nachzuweisen war, ist, dass zu diesem Zeitpunkt bereits keine

97 Enzymaktivität (U/ml) Ergebnisse und Diskussion 80 detektierbare Esterasemenge mehr vorlag. Wahrscheinlich erfolgte mit BHET nur eine Produktion bis zum 3. Tag der Kultivierung und anschließend wurde das Enzym inaktiviert oder abgebaut, was auch mit dem Kurvenverlauf in Abbildung 27 übereinstimmen würde. 0,025 0,02 0,015 0,01 0, Kultivierungsdauer (d) PET ligomerpräparation zyklische PET ligomerpräparation BHET PBT Fasern PET Fasern recyceltes PET Granulat Abbildung 27: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit recyceltem PET-Granulat, PET-ligomerpräparation, zyklische PET-ligomerpräparation, BHET, PBT und PET-Fasern über einen Zeitraum von 10 Tagen im MSV-Medium. Tabelle 12: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 im MSV-Medium mit verschiedenen Additiven über einen Zeitraum von 10 Tagen. Substrat (2 g/l) Kultivierungstag mit der höchsten Enzymaktivität Enzymaktivität (U/ml) Proteinkonzentration (mg/ml) Spezifische Enzymaktivität (U/mg) BHET 3 0,021 0,25 0,084 PET-ligomerpräparation zyklische PET- ligomerpräparation 3 0,007 0,14 0, ,003 0,18 0,018 PET-Fasern 10 0,024 0,17 0,142 PBT-Fasern 10 0,014 0,06 0,240 Für die Proteinaufreinigung ist ebenfalls die gebildete Gesamtproteinmenge im Vergleich zur Esterasemenge von Interesse, um einen optimalen Zeitpunkt für die Ernte der Rohenzymlösung

98 Ergebnisse und Diskussion 81 festzulegen. Um diese Entwicklung genauer zu untersuchen, erfolgte während der Kultivierung von T. fusca KW3 im MSV-Medium mit PET-Fasern zu verschiedenen Zeitpunkten eine Probenahme. Diese Proben wurden anschließend per SDS-PAGE gelelektrophoretisch aufgetrennt und unspezifisch mit Coomassie angefärbt. Zum Vergleich wurde diese Untersuchung ebenfalls mit einer Suberinpräparation im MSV-Medium durchgeführt, um nochmals die Unterschiede zwischen den beiden verwendeten Additiven und der daraus folgenden Enzymproduktion zu verdeutlichen Esterasebildung mit einer Suberinpräparation T. fusca KW3 wurde in 5 Kolben mit 250 ml MSV-Medium mit Suberin als Additiv über einen Zeitraum von 10 Tagen bei 50 C kultiviert. Der zellfreie Überstand von je einem Kolben wurde nach 0, 2, 4, 7 und 10 Tagen Kultivierung durch Zentrifugation gewonnen, die Esteraseaktivität und der Proteingehalt mit den Standardbestimmungen gemessen und der Überstand gefriergetrocknet. In Abbildung 28 sind die Esteraseaktivitäten (U/ml) und die maximalen spezifischen Esteraseaktivitäten (U/mg) der zellfreien Kulturüberstände während des Zeitraums der Kultivierung graphisch dargestellt. Die maximale Esteraseaktivität (8,1 U/ml) und spezifische Esteraseaktivität (50,8 U/mg) wurden nach 48 Stunden Kultivierung gemessen, danach erfolgte eine Aktivitätsabnahme. Bis zum 7. Tag blieb die Esteraseaktivität konstant auf einem Stand von 30 U/mg Protein, danach sank die Aktivität auf 0,03 U/ml und 0,289 U/mg ab. Darüber hinaus wurden Proben der zellfeien Überstände mittels SDS-PAGE gelelektrophoretisch aufgetrennt (Abbildung 29). Dafür wurden die Proben mit gleichen Volumenmengen auf das Gel aufgetragen. Anhand des Gelphotos wird sichtbar, dass während der Kultivierung ein Protein mit ca. 29 kda Größe gebildet wurde, dessen Konzentration bis zum 2. Tag anstieg und anschließend während der weiteren Kultivierung stetig sank.

99 Enzymaktivität (U/ml) Spezifische Enzymaktivität (U/mg) Ergebnisse und Diskussion Kultivierungsdauer (d) 0 Abbildung 28: Bestimmung der Esteraseaktivitäten ( ) und der spezifischen Esteraseaktivitäten ( ) während des Wachstums im MSV-Medium unter Zugabe von Suberin kda 119 kda 66 kda 43 kda 29 kda 20 kda 14.5 kda Abbildung 29: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit Suberin im MSV-Medium, links Coomassiegefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1, 7: Roti -Mark SDS Proteinstandard; Spur 2: Nullwert; Spur 3, 8: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 7 Tagen Kultivierung; Spur 6: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung. Zusätzlich erfolgte die Kultivierung von T. fusca KW3 für die Bestimmung der Biotrockenmassebildung im MSV-Medium mit Suberin in 2 L Erlenmeyerkolben mit 750 ml Medium. Die Kultivierung wurde gestartet durch die Zugabe von 42 ml Inoculum und erfolgte bei 50 C mit 150 rpm im Schüttelinkubator mit täglicher Probenahme von je 35 ml und anschließender Filtration. Das Filtrat

100 Enzymaktivität (U/ml) Biotrockenmasse (mg/ml) Ergebnisse und Diskussion 83 wurde für die Esteraseaktivitätsbestimmung eingesetzt und der Filter mit demineralisiertem Wasser gewaschen, über Nacht getrocknet und nach dem Abkühlen im Exikkator mit der Feinwaage ausgewogen. Die von T. fusca KW3 gebildete Biotrockenmasse in mg/ml und die Esteraseaktivität in U/ml wurden gegeneinander aufgetragen (Abbildung 30). Da das MSV-Medium mit den Zellen aus der Vorkultur angeimpft wurde, lag zum Zeitpunkt 0 ein Trockengewicht an Zellen von 0,7 mg/ml vor. Bis zum vierten Tag gab es eine Zunahme sowohl der Biomasse als auch der Esteraseaktivität. Ab dem vierten bis zum neunten Tag nahm die Biotrockenmasse nicht weiter zu. Nach dem neunten Tag war dann eine Abnahme der Biotrockenmasse zu verzeichnen. Bezüglich der Esteraseaktivität konnte festgestellt werden, dass die Aktivität vom ersten bis vierten Tag stark anstieg und danach auf ein Drittel der maximalen Aktivität abfiel. Vom fünften bis achten Tag blieb die Esteraseaktivität konstant und sank bis zum elften Tag auf 1,3 U/ml ab. Die Unterschiede im Verlauf der Enzymaktivitäten in Abbildung 28 und 30 sind zum Einen auf die verschiedenen Größen der Kultivierungsansätze (250 und 750 ml) und zum Anderen auf die natürlichen Unterschiede der Suberinpräparation zurückzuführen. 7 2,1 6 1,8 5 1,5 4 1,2 3 0,9 2 0,6 1 0, Kultivierungsdauer (d) 0 Abbildung 30: Biotrockenmasseproduktion ( ) und Esteraseaktivität ( ) von T. fusca KW3 im MSV-Medium Esterasebildung mit PET-Fasern Um den optimalen Zeitpunkt für die Gewinnung der 52 kda Esterase Rohenzymlösung in Form des zellfreien Überstandes zu ermitteln, wurde T. fusca KW3 in 5 Erlenmeyerkolben mit je 250 ml MSV- Medium mit PET-Fasern bei 50 C kultiviert. Eine Kontrolle wurde sofort nach der Inokulation abfiltriert und abzentrifugiert, um den zellfreien Überstand zu gewinnen. Diese Probe diente als

101 Enzymaktivität (mu/ml) Spezifische Enzymaktivität (mu/mg) Ergebnisse und Diskussion 84 Nullwert. Nach 2, 4, 8 und 10 Tagen wurden die zellfreien Überstände von je einem weiteren Kolben geerntet und die Esteraseaktivität und der Proteingehalt bestimmt. Die Esteraseaktivität (mu/ml) wurde gegen die Kultivierungsdauer (Tage) aufgetragen (Abbildung 31). Ab der Kultivierungsdauer von 2 Tagen stieg die Esteraseaktivität bis zum 10. Tag auf 35 mu/ml bzw. die spezifische Aktivität auf 673 mu/mg an Kultivierungsdauer (d) Abbildung 31: Graphische Darstellung der Esteraseaktivität ( ) und der spezifischen Esteraseaktivität ( ) gebildet während der 10-tägigen Kultivierung im MSV-Medium mit PET-Fasern. Darüber hinaus wurden Proben der zellfeien Überstände mittels SDS-PAGE gelelektrophoretisch aufgetrennt (Abbildung 32) kda 119 kda 66 kda 43 kda 29 kda 20 kda 14.5 kda Abbildung 32: SDS-PAGE der zellfreien Überstände nach Inkubation mit PET-Fasern im MSV-Medium, links Coomassiegefärbtes Gel; rechts Gel mit Aktivitätsfärbung mit Fast Red. Spur 1 und 7: Roti -Mark SDS Proteinstandard; Spur 2: Nullwert; Spur 3: zellfreier Überstand nach 2 Tagen Kultivierung; Spur 4: zellfreier Überstand nach 4 Tagen Kultivierung; Spur 5: zellfreier Überstand nach 8 Tagen Kultivierung; Spur 6, 8: zellfreier Überstand nach 10 Tagen Kultivierung.

102 Ergebnisse und Diskussion 85 Dafür wurden die Proben mit gleichen Volumenmengen auf das Gel aufgetragen. Anhand des Gelphotos wurde sichtbar, dass bereits nach 2 Tagen Kultivierung ein Protein mit ca. 52 kda Größe gebildet wurde, dessen Konzentration bis zum 10. Tag stetig anstieg. Der optimale Zeitpunkt für die Gewinnung des zellfreien Überstandes für die Aufreinigung der 52 kda PET-Esterase war demnach nach einer 10-tägigen Kultivierung im MSV-Medium mit PET-Fasern. Die Biotrockenmassebestimmung zur Untersuchung der Wachstumskurve von T. fusca KW3 mit PET- Fasern konnte nicht durchgeführt werden, da ein Teil der Biomasse an der Faseroberfläche anhaftete und somit mit den Fasern bei der Filtration von den restlichen Zellen abgetrennt wurde. Somit konnte keine Gesamtbiotrockenmasse bestimmt werden. Anhand der bisherigen Versuche konnte folgendes festgestellt werden: Bei der Kultivierung von T. fusca KW3 im MSV-Medium mit PET-Fasern wurde die Bildung einer 52 kda großen Esterase induziert (Abbildung 32). Erfolgte stattdessen die Kultivierung in Gegenwart von Suberin, wurde eine 29 kda Esterase produziert (Abbildung 29). Da die 52 kda Esterase unter Zusatz von synthetischen Polyestern produziert wurde, war sie von größerem Interesse für die weiteren Untersuchungen. Aus diesem Grund erfolgten alle nachfolgenden Arbeiten mit der 52 kda große Esterase, die mit den PET-Fasern als Substrat gebildet wurde. Allerdings ergab sich daraus das Problem, dass die Produktion der Esterase mit den PET- Fasern einen hohen Zeitaufwand für die Kultivierung beanspruchte, um genügend Rohenzymlösung für eine Aufreinigung des Enzyms bereitzustellen. Aus diesem Grund wurde im Anschluss ein weiteres Terephthalat-enthaltendes Substrat als möglicher Zusatz für die Produktion der gesuchten Esterase getestet. Ebenfalls wurden zwei weitere Spezies der Gattung Thermobifida fusca in das Esterase-Screening mit einbezogen, um zu testen, ob sich die Esteraseproduktion deutlich unterscheidet von der von T. fusca KW Esterasebildung bei T. fusca KW3 DSM 6013, T. fusca DSM und DSM mit PET- Fasern und Diethylterephthalat Das Ziel dieser Untersuchung war es, einen Stamm und einen Zusatzstoff zu finden, mit dem eine maximale Ausbeute an PET abbauender Esterase in der Rohenzymlösung erhalten wird. Neben PET- Fasern wurde als weiteres Additiv Diethylterephthalat (DET), ebenfalls wie BHET ein Derivat der Terephthalsäure, eingesetzt. Diese Substanz wurde dem MSV-Medium wie alle anderen bereits getesteten Additive in einer Konzentration von 2 g/l zugesetzt. Neben T. fusca KW3 wurden zwei weitere, vom DSMZ bezogene Stämme unter den gleichen Bedingungen kultiviert (T. fusca DSM und T. fusca DSM 43793). Bei der Kultivierung sollte die Esterasebildung von T. fusca KW3 mit

103 Ergebnisse und Diskussion 86 PET-Fasern und DET im MSV-Medium verglichen werden mit der Esterasebildung von T. fusca DSM und DSM unter gleichen Bedingungen. Für T. fusca KW3 erfolgte während der Kultivierung eine Probenahme zur Bestimmung der Esteraseaktivitäten im Überstand (Abbildung 34). Darüber hinaus wurden Proben für die SDS-PAGE und die Aktivitätsfärbung entnommen (Abbildung 33). Es ist ersichtlich, dass nach der Kultivierung mit PET-Fasern sowohl bei Stamm T. fusca KW3 als auch bei den Stämmen T. fusca DSM und DSM eine 52 kda große Esterase gebildet wurde, die über die Aktivitätsfärbung mit Fast Red genau auf dem Gel identifiziert werden konnte (rote Banden Spuren 2, 4, 6). Desweiteren konnte gezeigt werden, dass nach Kultivierung mit DET bei allen drei untersuchten Stämmen eine 29 kda große Esterase produziert wurde, die ebenfalls über Aktivitätsfärbung mit Fast Red genau identifiziert werden konnte (rote Banden Spuren 3, 5, 7). Damit konnte festgestellt werden, dass die beiden Additive die Produktion zweier unterschiedlicher Esterasen induzieren: die PET-Fasern eine 52 kda Esterase und DET eine 29 kda Esterase. Somit waren die Stämme bei Anwesendheit von DET, ebenso wie von Suberin und Cutin, nicht in der Lage, die 52 kda Esterase zu synthetisieren. Da sich die produzierten Mengen der 52 kda Esterase bei allen drei Stämmen nicht unterscheiden, wurde bei den weiteren Untersuchungen das Isolat aus der Stammsammlung, T. fusca KW3, verwendet kda 66 kda 45 kda 52 kda 30 kda 29 kda 20.1 kda 14.4 kda Abbildung 33: SDS-PAGE der Rohenzymlösungen nach Kultivierung mit unbehandelten PET-Fasern bzw. DET im MSV- Medium, Gel gefärbt mit Coomassie- und mit Aktivitätsfärbung. Spur 1, 8: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 2: T. fusca DSM mit PET-Fasern kultiviert; Spur 3: T. fusca DSM mit DET kultiviert; Spur 4: T. fusca DSM mit PET-Fasern kultiviert; Spur 5: T. fusca DSM mit DET kultiviert; Spur 6: T. fusca KW3 DSM 6013 mit PET-Fasern kultiviert; Spur 7: T. fusca KW3 DSM 6013 mit DET kultiviert.

104 Esteraseaktivität (mu/ml) Ergebnisse und Diskussion Kultivierungsdauer (d) Abbildung 34: Esteraseproduktion durch T. fusca KW3 mit DET ( ) und PET-Fasern ( ) über einen Zeitraum von 13 Tagen im MSV-Medium. Beim Screening nach PET-Hydrolasen aus T. fusca zeigte sich, dass zunächst die Vorkultur im Czapek- Medium nach zwei Tagen Wachstum die maximale Zelldichte mit noch exponentiellem Wachstum vorwies. Die Zellen wurden steril zentrifugiert, in Puffer resuspendiert, um alle Reste an Glucose zu entfernen, und damit das MSV-Medium angeimpft. Die Kultur im MSV-Medium wurde mit verschiedenen Zusätzen kultiviert, um hydrolytische Enzyme zu produzieren. Während des Wachstums war zu beobachten, dass mit Cutin, Suberin und DET die Produktion eines anderen Enzyms erfolgte, als mit den synthetischen PET- und PBT-Fasern, PET-Granulat und der PET- ligomerpräparation. Mit den Monomeren TPA und Ethylenglycol erfolgte keine Enzymproduktion. Die mit den Biopolyestern und erstaunlicherweise auch mit DET induzierte Hydrolase besaß p-npb Aktivität und wies im SDS-PAGE Gel eine molekulare Größe von 29 kda auf. Desweiteren war die maximale Produktion des Enzyms bei 50 C nach 2 Tagen mit Suberin erreicht und betrug 8,1 U/ml und eine spezifische Aktivität von 50,8 U/mg. Mit den synthetischen Additiven bildete T. fusca KW3 hingegen eine andere, größere Hydrolase von ca. 52 kda und mit p-npb Aktivität. Für dieses Enzym wurde die maximale Produktionsrate nach mindestens 10 Tagen Kultivierung mit 35 mu/ml bzw. die spezifische Aktivität auf 673 mu/mg erreicht. Die Produktion erfolgte ebenfalls bei 50 C, jedoch wurden deutlich geringere Mengen Enzym produziert im Vergleich zur 29 kda Hydrolase (Verhältnis 1:230) mit einem 5fach höheren Zeitaufwand. Diese Produktion zweier verschiedener Esterasen wurde nicht nur bei T. fusca KW3 festgestellt, sondern auch mit den Stämmen aus der Stammsammlung des DSMZ, T. fusca DSM (ATCC 27730) und DSM Fett et al. testeten bereits 1999 verschiedene Actinomyceten auf ihre Produktion von Cutindepolymerisierenden Enzymen (Fett et al. 1999). Von Thermomonospora alba NRRL B T

105 Ergebnisse und Diskussion 88 (NCIMB 10169); T. chromogena ATCC T ; T. curvata ATCC T ; T. formosensis ATCC T ; T. fusca ATCC T (DSM 43792), NRRL B und YX-5p; T. mesophila ATCC T ; T. mesouviformis ATCC T und T. sp. NRRL B produzierte nur der Referenzstamm T. fusca ATCC im Trypton-Hefeextrakt-Medium Cutinase-Aktivität. Ebenso produzierte der verwendete Stamm T. fusca KW3 im MSV-Medium mit Pepton bei Anwesenheit einer Suberin- oder Cutin-Präparation Esteraseaktivität. Mit verschiedenen Substanzen und cutin- bzw. lipidhaltigen Naturprodukten (1-Hexadecanol, ein Cutinhydrolysat, Palmitinsäure, Hexadecan-1-ol, Rizinolsäure, Maisfasern (unbehandelt), Maiskleie, Rizinusöl, Maiskeimöl und livenöl) zeigte der Referenzstamm T. fusca ATCC keine Anregung der Cutinaseproduktion und bei höheren Konzentrationen sogar eine Hemmung des Bakterienwachstums (Fett et al. 1999). T. fusca KW3 produzierte mit den Monomeren Terephthalsäure und Ethylenglycol ebenfalls keine Esteraseaktivität. Hingegen konnte bei T. fusca ATCC mit Apfelcutin, Apfeltrester, Tomatenschalen, Kork und Suberin aus Kartoffeln Cutinase-Aktivitäten nachgewiesen werden, welche mit den Tomatenschalen am höchsten waren. T. fusca KW3 produzierte mit Apfelcutin und Suberin die höchsten Esteraseaktivitäten, wobei die Aktivitäten mit Apfelcutin am Höchsten waren (Daten nicht dargestellt). Geringere Esteraseaktivitäten wurden mit synthetischen PET- und PBT-Fasern, PET- Granulat, der PET-ligomerpräparation und DET bestimmt. Bei Untersuchungen zum biologischen Abbau von aromatisch-aliphatischen Copolyestern mit den neu isolierten T. fusca K13g und K7a-3 erfolgten die Induktion und das Screening nach hydrolytischer Esteraseaktivität mit Polymerfilmen aus 1,4-Butandiol, Terephthalsäure und Adipinsäure (Kleeberg et al. 1998). T. fusca K13g und K7a-3 zeigten bei 16S rdna Sequenzvergleichen die höchsten Übereinstimmungen mit T. fusca DSM T (99,8% und 100%). Nachfolgend wurden weitere Studien zur Produktion dieser Copolyesterabbauenden Hydrolase aus T. fusca DSM mit Ecoflex -Pulver (BTA Copolyester, Partikelgröße < 0,8 mm) als Induktor durchgeführt (Gouda et al. 2002). Die höchsten Aktivitäten der Hydrolase wurden aufgrund des Austauschs von 5 g/l Pepton im MSV-Medium durch 1,87 g/l NH 4 Cl und 5 g/l Pektin erzielt (von 1,5 U PCL-Film /mg und 0,8 U/mg Protein auf 1,8 U PCL-Film /mg und 6,0 U/mg Protein ). Die Actinomycetenisolate M5, M9 und Thermobifida fusca KW3b (jetzt KW3), alle isoliert aus Kompost, wurden in einem Minimalmedium mit PET-Garn, DET oder einer Suberinpräparation aus Kartoffelschalen (je 2 g/l) zur Enzymproduktion 8 Tage bei 45 C kultiviert (Alisch et al. 2004). Die produzierte Enzymaktivität, bestimmt mit p-npb, lag für alle Isolate mit PET-Fasern und DET als Induktor während der 8 Tage bei maximal 40 mu/ml, ebenso für M5 und M9 mit der Suberinpräparation. Die einzige Ausnahme war T. fusca KW3b, der nach 8 Tagen mit der Suberinpräparation 120 mu/ml aufweisen konnte (Alisch et al. 2004).

106 Ergebnisse und Diskussion 89 Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die Zugabe von Glucose zum Produktionsmedium bei T. fusca ATCC und T. fusca KW3 eine stark hemmende Auswirkung auf die Enzymproduktion besaß (Fett et al. 1999). Auch bei Gouda et al erfolgte beim Einsatz von Glucose, Saccharose oder Stärke anstatt Pektin keine Produktion der Hydrolase. Weiterhin konnte kein signifikanter Einfluss des eingesetzten Inokulationsvolumens (1 bis 15 ml auf 80 ml Medium) auf die maximal produzierte Enzymaktivität (1,3 bis 1,7 U PCL-Film /ml) identifiziert werden (Gouda et al. 2002). Bei der Untersuchung des Einflusses der freigesetzten BTA-Monomere auf die Esteraseproduktion wurden die Natriumsalze der Adipinsäure und der Terephthalsäure und 1,4-Butandiol dem Kulturmedium vor der Inokulation beigesetzt. Bei einer Konzentration von 50,1 mg 1,4-Butandiol oder 68,0 mg Adipinsäure oder 50,4 mg Terephthalsäure zusätzlich zu 250 mg BTA-Pulver wurden keine hydrolytischen Aktivitäten im Medium detektiert. Das bedeutet, dass diese Konzentrationen sich auf eine weitere Enzymproduktion hemmend auswirken, nicht aber auf bereits produziertes Enzym, welches die Monomere während eines Abbaus freisetzt. Beim Vergleich von BTA-Filmen, -Pulver und -Nanopartikeln als Induktor zeigte sich, dass die Polymeroberfläche keinen bedeutenden Einfluss auf die Enzymproduktion nach 48 Stunden hatte. Hingegen zeigte die Variation der BTA-Pulver Konzentration im Produktionsmedium einen interessanten Einfluss auf die produzierte Menge an hydrolytischem Enzym. Beim Scale-up der Produktion vom Schüttelkolben zum 100 L Fermenter wurden stets Enzymaktivitäten um die 1,5 U PCL-Film /ml und spezifische Aktivitäten von 4 bis 6 U/mg Protein nach 48 Stunden Inkubation erreicht. Die untersuchte Hydrolase aus T. fusca DSM besaß ein Molekulargewicht von ca. 30 kda (Gouda et al. 2002). Weiterführend zu Fett et al. (1999) erfolgte die Erzeugung von Mutanten des Referenzstamms T. fusca ATCC (T. fusca WSH04) mit einer höheren Cutinaseproduktion mittels Behandlung mit Diethylsulfat (Du et al. 2007). Weiterhin wurde der Einfluss von Glucose, Saccharose, löslicher Stärke, Ethanol und Natriumacetat auf die Cutinaseproduktion untersucht und es zeigte sich, dass mit dem Zusatz von Ethanol und Natriumacetat ähnliche Zelltrockengewichte und Cutinaseaktivitäten erreicht werden konnten, die spezifische Cutinaseaktivität aber höher beim Einsatz von Natriumacetat war. Bei der Untersuchung des Einflusses der Natriumacetatkonzentration auf die gebildete Zellmasse und Cutinaseaktivität zeigte sich, dass mit einer Konzentration von 7,5 g/l die höchsten Ergebnisse erzielt wurden. Das beste Zellwachstum wurde mit ph 7,3 und die höchste Cutinaseproduktion mit ph 7,6 erreicht. Deshalb entwickelten Du et al. (2007) eine 2-Phasen ph-kontrollierte Kultivierung mit 20 Stunden bei ph 7,3 für eine maximale Biomasseproduktion und anschließend bei ph 7,6 nach 50 Stunden Kultivierung für eine maximale Cutinaseproduktion (Du et al. 2007). Hu et al. (2010) isolierten von kompostierten Polyesterfilmen zwei Gruppen von Mikroorganismen, Actinomyceten (vier Gattungen) und Bacillen (drei Gattungen). Von diesen Isolaten war nur Thermobifida alba AHK119 in der Lage, den aliphatisch-aromatischen Copolyesterfilm (Apexa, zuvor

107 Ergebnisse und Diskussion 90 Biomax 4026 und 4027, ein Polyethylenterephthalat Copolymer aus Terephthalsäure, Ethylenglycol und einer ungenannten Komponente) abzubauen, ebenso die Partikelgröße von Polymeren (PCL, Bionolle EM-301 (Polybutylensuccinat-co-adipat (PBSA)), Ecoflex ) zu verringern und dabei Terephthalsäure freizusetzen. Verantwortlich für den Abbau war eine Hydrolase von ca. 30 kda Größe (Hu et al. 2010). Bisher wurden allerdings nicht nur aus Thermobifida cutinolytische oder PETabbauende Enzyme identifiziert, sondern ebenfalls aus anderen Bakterienstämmen und auch Pilzen. Aus einer phyllospherischen Bakterienkultur wurde 1987 von Sebastian et al. ein fluoreszierender Pseudomonas putita ATCC (wurde umbenannt zu P. mendocina) Stamm isoliert. Das Isolat produzierte eine extrazelluläre Cutinase während des Wachstums mit Cutin, aber nicht mit Cutin Hydrolysaten im Vergleich zur eukaryotischen Produktion von Fusarium solani sp. pisi. Die während der Hydrolyse freigesetzten Cutinmonomere wurden mittels Dünnschichtchromatographie nachgewiesen (Sebastian et al. 1987). Bei der SDS-PAGE und der Gelfiltration zeigte das Enzym ein Molekulargewicht von 30 kda und eine monomere Form (Sebastian et al. 1988). El-Bendary et al. haben 2010 die berflächenhydrolyse von PET-Textilien durch Lipasen aus den Bacillus Isolaten 5W und 6C untersucht. Die Lipase aus dem Bacillus 5W Isolat wurde in größeren Mengen als PET-oberflächenmodifizierendes Enzym mit 6% Baumwollsamenmehl und ph 7,5 produziert (90U/ml). Die beste Ausbeute wurde mit 25 ml Medium, 25 x 10 6 CFU/ml Inoculum und 24 Inkubation erzielt. Die Zugabe von Pepton zum Medium steigerte die Lipaseproduktion um 22,5% (130,7 U/ml) (El-Bendary et al. 2010). F. solani f. pisi produzierte während des Wachstums mit Cutin extrazelluläre Cutindepolymerisierende Enzyme, welche alle Gruppen von Cutinmonomeren freisetzten (Purdy und Kolattukudy 1973). Aus dem extrazellulären Überstand wurden zwei Isoenzyme, eine Cutinase und eine unspezifische Esterase (p-nitrophenylpalmitat Hydrolase) mit einem Molekulargewicht von 22 kda bzw. 52 kda isoliert (Purdy und Kolattukudy 1975a). Cutinhydrolysate im Medium hatten eine Produktion einer extrazellulären Cutinase bei einem in Glucose-Medium gewachsenen F. solani f. sp. pisi zur Folge (Lin und Kolattukudy 1978). Die Produktionsrate war abhängig von der Menge des Cutinhydrolysates, welches bis zu einer Konzentration von 80 µg/ml zugegeben wurde, und bei dieser Konzentration erfolgte kein weiterer Anstieg der Produktion. Bei Anwesenheit von Glucose erfolgte keine Cutinaseproduktion. Die Induktion der Cutinase durch Cutinhydrolysate wurde nicht durch Actinomycin D (zytotoxisches Antibiotika) inhibiert und durch Cordycepin (Antitumor, antifungales und antivirales Reagenz) sogar noch erhöht. Durch die Zugabe von Cycloheximid mit dem Induktor oder bis zu 12 Stunden nach der Zugabe des Induktors resultierte ein fast sofortiger Stillstand der Cutinaseproduktion. Ebenso unterdrückte Deoxyglucose, ein Hemmer der Proteinglykosylierung, die Produktion der Cutinase mit Cutinhydrolysaten. Die ω-hydroxyfettsäuren waren deutlich effizienter bei der Induktion der

108 Ergebnisse und Diskussion 91 Cutinase als alle anderen noch polareren Säuren des Cutins. Experimente mit Derivaten und Analogas der ω-hydroxy-c 16 -Fettsäuren zeigten, dass eine freie Hydroxylgruppe an der ω-position als ein wichtiger Faktor für die Cutinaseinduzierende Aktivität zu sehen ist. Ebenfalls erfolgte mit n- aliphatischen primären Alkoholen (C 14 oder mehr) die Produktion der Cutinase, wobei n-c 16 am effizientesten induzierte. Das bedeutet, dass die Monomere als das chemische Signal agieren, welches die extrazelluläre Hydrolase induziert (Lin und Kolattukudy 1978). Ebenfalls wurden Cutinasen aus fünf verschiedenen phytopathogenen Pilzen und Bakterien, F. roseum culmorum, F. roseum sambucinum, Ulocladium consortiale, Streptomyces scabies und Helminthosporium sativum, mit einem Molekulargewicht von ca. 25 kda isoliert. Eine Suspension mit Sporen oder Mycelien einer 14 Tage alten Kultur wurde dafür in 100 ml eines Mineralmediums mit ph 7,2 und 0,5 g Cutin gegeben (Lin und Kolattukudy 1980a). Das F. solani pisi Isolat T-8 war in der Lage, mit Suberin aus Kartoffelschalen als einzige Kohlenstoffquelle zu wachsen. Der extrazelluläre Überstand dieser Kulturen hydrolysierte p- Nitrophenylbutyrat und radioaktiv markiertes Apfelcutin. Der Großteil der Esterase war an die Suberin enthaltende Mycelmatte gebunden und konnte mit einer 0,4% Triton X-100 Lösung ausgewaschen werden. Die Enzymlösung enthielt zwei Isoenzyme mit einem Molekulargewicht von 23 kda. Desweiteren wurde festgestellt, dass F. solani pisi sehr ähnliche oder gleiche Polyesterasen bildet für den Abbau von Cutin und Suberin, wenn diese als einzige Kohlenstoffquellen im Medium vorhanden sind (Fernando et al. 1984). Nimchua et al. (2007) verwendete für die Isolation von Mikroorganismen mit PET-hydrolysierenden Enzymen sowohl Pflanzenproben, wie Blätter, Blüten, unterirdische Speicherorgane und Früchte, als auch Bodenproben gesammelt an verschiedenen Stellen in Nord-Thailand. Die PCL abbauenden Isolate und der F. solani f. sp. pisi wurden anschließend mit Mineralmedium kultiviert (Nimchua et al. 2007). Verschiedene Microfungi wurden von Pflanzenoberflächen und Bodenproben mittels PCL- Mineralmedium-Platten isoliert. 22 der 115 Isolate zeigten Hofbildung, was auf eine Cutinaseaktivität schließen ließ. Die Produktion der Cutinase im Mineralmedium mit Suberin aus Kartoffeln oder PET- Fasern wurde mittels p-npb Aktivitätsbestimmung nachgewiesen, wobei alle Isolate p-npb Aktivität zeigten. Das Isolat PBURU-B5 besaß die höchste p-npb Aktivität mit PET-Fasern und wurde identifiziert als F. solani (Nimchua et al. 2008). Wang et al. (2008) untersuchten die ptimierung der Kulturbedingungen der Lipaseproduktion und die Bereitstellung einer spezifischen Lipase für die PET-Hydrolyse aus Aspergillus oryzae CCUG. Die unter Zusatz von livenöl produzierte Lipase konnte die Eigenschaften der PET-Textilien nicht deutlich ändern, deshalb wurden Diethyl-p-phthalat (DP), BHET und PET-Fasern als Zusätze verwendet. Mit BHET wurden die besten Produktionsraten erreicht und die extrazelluläre Lipase hydrolysierte das PET Modellsubstrat DP (Wang et al. 2008).

109 Ergebnisse und Diskussion 92 Zur Identifikation neuer PET-modifizierender Mikroorganismen erfolgte ein Screening mit Bodenproben von verschiedenen Mülldeponien und von einer Abwasserkompostierungsanlage als Inoculum. Die gesuchten Mikroorganismen sollten mit PET als alleinige C-Quelle wachsen können. Die Kultivierung erfolgte in einem Mineralsalzmedium mit Spurenelementen bei ph 7 (für Bakterien) und ph 5 (für Pilze). Das Medium mit PET-Pulver (10 g/l) wurde mit einer Bodenprobe kultiviert. Nach drei Wochen wurden die Kulturen auf Vollmedium ausgestrichen und Reinkulturen auf ihre PET-Hydrolyse hin getestet. Es konnten 4 verschiedene bakterielle und 5 verschiedene eukaryotische Isolate identifiziert werden. Da das Wachstum mit PET sehr langsam erfolgte, wurde zusätzlich Cutin als Induktor getestet. Alle Pilze und 2 Bakterienisolate wuchsen mit Cutin als einzige C-Quelle und produzierten eine Esteraseaktivität, hingegen zeigten mit Adipinsäure-bishexylamid als Induktor alle bakteriellen Isolate extrazelluläre PET-Hydrolyseaktivität. Im Vollmedium mit Pepton, Hefeextrakt und Glucose besaßen alle Isolate nur eine schwache p-npa Aktivität (Fischer-Colbrie et al. 2004). Mit 3PET (BETEB, 1 g/l) als Modellsubstrat isolierten Liebminger et al. (2007) Mikroorganismen, die PET-abbauende Enzyme produzieren. Dabei wurde ein Penicillium citrinum Isolat identifiziert, welches eine Polyesterase von 14.1 kda zum PET Abbau produziert. Die höchsten Enzymausbeuten konnten unter Zusatz von Cutin (1.2 g/l) erreicht werden (Liebminger et al. 2007). Der Abbau von BHET/DET (in der Literatur wurde unter Zusatz von Diethylenglycolterephthalat angegeben, was eine andere Beschreibung für BHET ist; in den Abbildungen ist allerdings DET dargestellt, was sich durch die beiden endständigen Alkoholgruppen vom BHET unterscheidet; somit ist keine eindeutige Zuordnung möglich) und PET-Fasern durch Mikroorganismen und Lipasen wurde von Zhang et al untersucht. Die isolierten Mikroorganismen aus Belebtschlamm wurden auf ihre Fähigkeit hin, PET-Fasern oder BHET/DET zu hydrolysieren, getestet (Zhang et al. 2004, Zhang et al. 2006). Zusammenfassend ist aus den Tabellen 13 und 14 ersichtlich, dass bei den Bakterien und Pilzen je maximal zwei verschiedene Polyesterspaltende Enzyme produziert wurden und diese in einem Größenbereich von 14 bis 52 kda lagen. Bei den Bakterien wurden meist hochpolymere natürliche oder synthetische Verbindungen aus Zusatzstoffe eingesetzt, wohingegen deren Monomere oder Hydrolysate ebenso wie Glucose oder andere Zucker eher eine hemmende Wirkung auf die Enzymproduktion zeigten. Zusätzlich zu den Induktoren wurden noch weitere komplexe C-Quellen für die Bildung der Biokatalysatoren benötigt und die Kultivierungsdauer lag zwischen 1 bis 10 Tagen bis zum Erreichen der maximalen Enzymaktivität.

110 Aktivität 12,1 U/ml Tabelle 13: Bildung von PET-Hydrolasen bei Bakterien. Inkubation 7 Tage 2 Tage 8 Tage 10 Tage 2 Tage 50 Stunden 1-5 Tage 4 Tage 1 Tag Induktor Apfelcutin, Apfeltrester, Tomatenschalen, Kork, Suberin (4 g/l) BTA-Filme, -Pulver und - Nanopartikel (3,125 g/l) DET, PET-Fasern (2 g/l) Suberin (2 g/l) PET-Fasern (2 g/l) Suberin (2 g/l) Cutin (1 g/l) Apexa Copolyester Pulver (1 g/l) Cutin (4 g/l) Baumwollsamenmehl (60 g/l) C-Quelle Trypton, Hefeextrakt NH4Cl, Pektin Pepton Pepton Pepton, Hefeextrakt, Natriumacetat Hefeextrakt, Casein Hydrolysat Hefeextrakt Pepton, Hefe- und Fleischextrakt Hemmung Glucose Glucose, Saccharose, Stärke, BTA Monomere k. A. Glucose Glucose k. A. Cutinhydrolysat k. A. Referenz Fett et al Gouda et al Alisch et al Eigene Ergebnisse Du et al 2007 Hu et al Sebastian et al El-Bendary et al Ergebnisse und Diskussion 93 1,8 UPCL-Film/mg Herkunft T. fusca DSM T. fusca DSM T. fusca KW3 T. fusca KW3 T. fusca WSH04 T. alba AHK119 P. mendocina ATCC Bacillus sp. 5W Größe k. A. 30 kda k. A. 52 kda 29 kda k. A. 30 kda 30 kda k. A. 40 mu/ml 120 mu/ml 35 mu/ml 8,1 U/ml 19,8 U/ml k. A U/ml 130,7 U/ml

111 Herkunft F. solani f. pisi F. solani f. sp. pisi F. roseum culmorum, F. roseum sambucinum, U. consortiale, S. scabies, H. sativum F. solani pisi T-8 F. oxysporum LCH 1, F. solani f. sp. Pisi DSM A. oryzae CCUG P. citrinum unbekannte Isolate Größe 22 kda 52 kda k. A. ca. 25 kda 23 kda k. A. k. A. 14 kda k. A. k. A. Aktivität 7 ΔA405/min/ml k. A. k. A. k. A LU/ml 32 nkat/ml (p- NPB) k. A. Tabelle 14: Bildung von PET-Hydrolasen bei Pilzen. Inkubation 12 Tage 4 Tage 12 Tage 21 Tage einige Tage ca. 70 Stunden 10 Tage 7 Tage Induktor Cutin (5 g/l) Cutinhydrolysat (0,08 g/l) Cutin (5 g/l)) Suberin (5 g/l) PCL (0,5 g/l) BHET (0,025-0,5 g/l) BETEB (1 g/l), Cutin (1,2 g/l) BHET/DET (0,5-1,0 g/l) C-Quelle keine Weiteren Glucose keine Weiteren keine Weiteren keine Weiteren Maltose, Pepton, Zitronensäure, livenöl, Polyoxyethylenalkylether ohne (Screening); Pepton, Hefeextrakt, Glucose (Produktion) Hefeextrakt Hemmung k. A. Glucose k. A. k. A. k. A. k. A. k. A. k. A. Referenz Purdy und Kolattukudy 1975a Lin und Kolattukudy 1978 Lin und Kolattukudy 1980a Fernando et al Nimchua et al. 2007, Nimchua et al Wang et al Liebminger et al Zhang et al. 2004, Zhang et al Ergebnisse und Diskussion 94

112 Ergebnisse und Diskussion 95 Die verwendeten Induktoren bei den Pilzkultivierungen waren zum Teil Biopolyester, aber auch Monomere oder Hydrolysate. Einige Pilze konnten sogar nur mit diesen Induktoren als einzige C- Quelle wachsen. Dieser Unterschied macht deutlich sichtbar, dass die Bakterien nicht nur die Energie in Form einer C-Quelle benötigen, sondern auch weitere wichtige Bausteine, wie z. B. Vitamine, die sie selbst nicht synthetisieren können, Pilze hingegen sind dazu in der Lage. Die Hemmung der Enzymproduktion bei den Bakterien durch die Abbauprodukte der enzymatischen Katalyse stellt einen wichtigen Regulationsschritt im Stoffwechselweg dar und verhindert die Verschwendung von Energiereserven. Die Kultivierungsdauer bei den Pilzkulturen war mit 4 bis 21 Tagen deutlich höher als bei den Bakterien und begründet sich durch das langsamere Wachstum. Ein Vergleich der gebildeten Aktivitäten ist nicht sehr sinnvoll, da für die Aktivitätsbestimmungen verschiedene Substrate eingesetzt wurden. Interessanterweise bildete nicht nur T. fusca KW3 zusätzlich zu zwei isomeren Cutinasen eine 52 kda große Esterase, dieses Verhalten konnte ebenfalls bei F. solani f. pisi identifiziert werden. Leider erfolgte keine weitere Studie dieser gebildeten Esterase zu dem damaligen Zeitpunkt (Purdy und Kolattukudy 1975a, b). 3.2 Charakterisierung der PET-Hydrolasen aus T. fusca KW Aufreinigung Aufreinigung der TfCa Im Vergleich zu intrazellulären Enzymen, die durch Aufschluss mittels Ultraschall oder French Press in großen Mengen gewonnen werden können und daraus Enzyme von Interesse über verschiedene chromatographische Verfahren aufgereinigt werden, ist die Aufreinigung extrazellulärer Enzyme komplizierter. Die Enzymaufreinigung erfolgte bei Raumtemperatur. Nach Dialyse und Zentrifugation wurde die Enzympräparation mit 100 mm Phosphatpuffer ph 8 auf 20 mm eingestellt. Dann erfolgte der Auftrag der Enzymlösung auf eine selbstgepackte equilibrierte Phenylsepharose Säule. Unter den gewählten Bedingungen band die TfCa an die Säulenmatrix. Durch die Erhöhung der Isopropanol Konzentration von 0 auf 30% durch den in Abbildung 35 verzeichneten Stufengradienten erfolgte die Elution des gebundenen aktiven Proteins bei 15 bis 25% Elutionspuffer B (Aufreinigungsschritt 2). Aktive Fraktionen (p-npb Aktivität) wurden vereinigt. Das enthaltene Isopropanol in der Enzympräparation wurde mittels Rotationsverdampfers abgetrennt.

113 UV (280nm) Esteraseaktivität (U) UV (280 nm) Esteraseaktivität (U) Ergebnisse und Diskussion % % % Elutionsvolumen (ml) Abbildung 35: Elutionsprofil der Enzymlösung während des zweiten Aufreinigungsschritts (Phenylsepharose, Säulenvolumen 25 ml, Puffer A: 20 mm Phosphatpuffer ph 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mm Phosphatpuffer ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 0 Weitere Fremdproteine wurden durch eine Anionenaustauschchromatographie mit DEAE Sepharose abgetrennt (Aufreinigungsschritt 3). Die TfCa band an die Matrix und eluierte nach dem Anlegen des NaCl-Gradienten im Bereich von 20 bis 25% Puffer B (Abbildung 36). Aktive Fraktionen wurden gesammelt (DEAE-Sepharose Pool) und gegen 20 mm Phosphatpuffer ph 8 dialysiert. Dann erfolgte der Auftrag der Enzympräparation auf eine equilibrierte ctyl-sepharose Säule (Aufreinigungsschritt 4). Die gebundene TfCa eluierte nach Anlegen eines linearen Isopropanol-Gradienten bis 30% in 20 mm Phosphatpuffer (Abbildung 37). Die aktiven Fraktionen von 10 bis 50% Puffer B wurden vereinigt und das enthaltene Isopropanol durch Abdampfen entfernt % % % Elutionsvolumen (ml) Abbildung 36: Elutionsprofil der Enzymlösung während des dritten Aufreinigungsschritts (DEAE-Sepharose, Säulenvolumen 54 ml, Puffer A: 20 mm Phosphatpuffer ph 8, Puffer B: 1 M NaCl in 20 mm Phosphatpuffer ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 0

114 UV (280nm) Esteraseaktivität (U) UV (280nm) Esteraseaktivität (U) Ergebnisse und Diskussion % Elutionsvolumen (ml) Abbildung 37: Elutionsprofil der Enzymlösung während des vierten Aufreinigungsschritts (ctyl-sepharose, Säulenvolumen 1 ml, Puffer A: 20 mm Phosphatpuffer ph 8, Puffer B: 30% Isopropanol in 20 mm Phosphatpuffer ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die Esteraseaktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). 0 Als letzter chromatographischer Reinigungsschritt erfolgte der Auftrag auf eine selbstgepackte Sephadex 200 (Größenausschlusschromatographie) und die Elution der Proteine nach ihrer Größe mit einem 0,15 M NaCl in 20 mm Tris/HCl ph 8 Elutionspuffer (Abbildung 38). Die aktiven Fraktionen wurden im Bereich von ml identifiziert und vereinigt. Die Aufreinigung wurde mit einer SDS- PAGE mit Coomassie Färbung dokumentiert (Abbildung 39) Elutionsvolumen (ml) 0 Abbildung 38: Elutionsprofil der Enzymlösung während des fünften Aufreinigungsschritts (Sephadex 200, Säulenvolumen 110 ml, Puffer: 0,15 M NaCl in 20 mm Tris/HCl ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau) und die Esteraseaktivität (schwarz).

115 Ergebnisse und Diskussion kda 66 kda 45 kda 30 kda 20.1 kda 14.4 kda Abbildung 39: SDS-PAGE der Aufreinigung der TfCa aus T. fusca KW3. Spur 1: Enzymlösung nach der Dialyse; Spur 2: Enzymlösung nach der HIC 1; Spur 3: Enzymlösung nach der AIEX; Spur 4: Enzymlösung nach der HIC 2; Spur 5: Enzymlösung nach der SEC; Spur 6: Low Molecular Weight Längenstandard (Billig et al. 2010). Wie aus der Abbildung 39 ersichtlich ist, konnte mit den fünf Reinigungsschritten die TfCa bis zur elektrophoretischen Reinheit isoliert werden. Es erfolgte eine 7625 fache Aufreinigung der Esterase mit einer Ausbeute von 7% der Ausgangsenzymlösung mit einer Aktivität von 36,6 U und einer Proteinkonzentration von 0,012 mg (Tabelle 15). Die spezifische Aktivität konnte von 0,4 U/mg auf 3050 U/mg erhöht werden. Schritt Tabelle 15: Aufreinigungstabelle der TfCa aus T. fusca KW3 (Billig et al. 2010). Volumen Aktivität Protein Spezifische Aktivität Ausbeute (ml) (U) (mg) (U/mg) (%) Kulturüberstand ,7 0,4 100 Dialyse ,7 808,7 0,4 61,9 HIC ,2 11,6 49 AIEX ,6 0,24 781,7 35,7 HIC 2 4,4 83,2 0, ,9 15,8 SEC 3,6 36,6 0, Aufreinigungsprotokolle für einige PET-Hydrolasen wurden bereits in den letzten Jahren veröffentlicht. Die bereits erwähnte 29 kda Cutinase (BTA Hydrolase 1, TfH) aus T. fusca DSM konnte durch Gouda et al und Kleeberg et al aufgereinigt werden. Zunächst erfolgte die Konzentrierung und Aufreinigung mittels Ultrafiltration mit einer regenerierten Zellulosetriacetatmembran (Ausschlussgröße 10 kda). Dabei stieg die spezifische Aktivität 2,4 fach mit einer Ausbeute von 60,8%. Die Verwendung einer Membran mit der Ausschlussgröße von 20 kda

116 Ergebnisse und Diskussion 99 führte zu einem starken Verlust bei der Ausbeute. Bei der Verwendung einer Polysulfonmembran (Ausschlussgröße 10 kda) lag die Rückgewinnung des Proteins bei 99%, allerdings nur mit 34,5% Ausbeute und somit konnte nur eine geringe Aufreinigung (Faktor 1,2) erzielt werden. Es wurde spekuliert, dass das Enzym eine starke Hydrophobizität besitzt und somit an die Membran absorbiert hat (Gouda et al. 2002). Schritt Tabelle 16: Aufreinigungstabelle der TfH aus T. fusca DSM (Kleeberg et al. 2005). Volumen Aktivität Protein Spezifische Aktivität Ausbeute (ml) (U)* (mg) (U/mg) (%) Kulturüberstand (NH 4 ) 2 S 4 Fällung KIEX HIC 9, *Bestimmt mit Tributyrin als Substrat, 1 Unit entspricht der Aktivität, die 1 µmol Ester in einer Minute spaltet. Kleeberg et al. (2005) testeten weitere Konzentrierungsschritte. Mit einer 50% Ammoniumsulfatfällung konnte die gesamte Menge an BTA-Hydrolase ausgefällt werden, allerdings nur ein Bruchteil davon konnte durch Waschen mit 20 mm Citratpuffer (ph 4,4) oder 20 mm Tris/HCl Puffer (ph 9,1) wieder resuspendiert werden. Anschließend wurde die Enzymlösung auf eine S- Sepharose Säule (Uno, Kationenaustauschchromatographie, ph 4) aufgetragen und mit einem Salzgradienten von 0 bis 1 M NaCl eluiert. Die noch vorhandenen Verunreinigungen wurden mit einer Hydrophoben Interaktionschromatographie entfernt. Dazu wurde der aktive Enzympool auf eine Phenylsepharose Säule, equilibriert mit 0,5 M Ammoniumsulfat, aufgetragen und mit einem Gradienten von 0,5 auf 0 M Ammoniumsulfat und 0 auf 30% Isopropanol eluiert. Mit dieser 3-Schritt Aufreinigung konnte eine Steigerung der spezifischen Aktivität um den Faktor 110 mit einer Ausbeute von 14% der Ausgangsaktivität erreicht werden (Tabelle 16, Kleeberg et al. 2005). Bei Chen S et al. (2008) erfolgte ebenfalls die Aufreinigung einer mit Cutin induzierten p-npb Hydrolase aus T. fusca. Nach der Kultivierung wurden die Zellen entfernt und mit 70% (w/v) Ammoniumsulfat die Proteine aus der Lösung ausgefällt. Das Präzipitat, gewonnen durch Zentrifugation, wurde in Puffer gelöst und über Nacht bei 4 C dialysiert. Anschließend erfolgte eine erneute Ausfällung mit 20% (w/v) Ammoniumsulfat. Der Überstand wurde filtriert (0.22 µm) und auf eine Phenyl Sepharose Säule geladen. Durch die lineare Erniedrigung der Ammoniumsulfatkonzentration erfolgte die Elution der Proteine mit p-nbp Aktivität. Nach einer erneuten Dialyse erfolgte der Auftrag auf eine DEAE-Sepharose Säule, die Elution mit einem linearen Natriumchlorid Gradienten (0 bis 1 M) und eine weitere Dialyse. Die letztliche Enzympräparation wurde nochmals konzentriert (Tabelle 17, Chen S et al. 2008).

117 Ergebnisse und Diskussion 100 Tabelle 17: Aufreinigungstabelle der Cutin-induzierten p-npb Hydrolase aus T. fusca (Chen S et al. 2008). Schritt Protein Aktivität Spezifische Aktivität Aufreinigung Ausbeute (mg) (U) (U/mg) (fach) (%) Kulturüberstand 234, ,0 52,3 1,0 100 (NH 4 ) 2 S 4 Fällung 46,4 5205,2 112,2 2,1 42,3 HIC 4,7 1521,2 320,3 6,1 12,4 AIEX 2,9 1140,9 398,6 7,6 9,3 Die Aufreinigung der Cutinase aus P. mendocina ATCC erfolgte zuerst mittels einer fraktionellen Acetonfällung (75%), um die hochviskosen Verfärbungen vom Enzym abzutrennen. Die Rückgewinnung des Enzyms lag bei 80%, welche auf eine DEAE Säule aufgetragen wurden. Die Cutinase band bei diesem Reinigungsschritt nicht an die Säulenmatrix, die Verunreinigung hingegen schon. Als weiterer Aufreinigungsschritt folgte eine weitere Anionenaustauschchromatographie mit einer QAE-Sephadex Säule. Dabei konnte ein starker Verlust an hydrolytischer Aktivität während des Reinigungsschritts verzeichnet werden, eventuell durch die Abtrennung einer weiteren enthaltenen p-npb Hydrolase (von 50% Ausbeute auf 9% Ausbeute, Tabelle 17). Die Cutinase zeichnete sich weiterhin durch nicht vorhandene Bindungseigenschaften an SP-Sephadex, CM-Cellulose, Phenyl- Sepharose und ctyl-sepharose aus, womit keine HIC oder Kationische Ionenaustauschchromatographie durchgeführt werden konnte. Die letzten Verunreinigungen konnten mittels Größenausschlusschromatographie abgetrennt werden (Sepharose 6B und Sephadex G-100). Durch diese 5-Schritt Aufreinigung erfolgte eine 200 fache Aufreinigung der Cutinase mit einer Ausbeute von 3% verbleibender Enzymaktivität (Tabelle 18, Sebastian et al. 1988) Tabelle 18: Aufreinigungstabelle der Cutinase aus P. mendocina ATCC (Sebastian et al. 1988). Schritt Aktivität Protein Spezifische Aktivität Ausbeute (U) (mg) (U/mg) (%) Kulturüberstand Aceton Fällung AIEX AIEX SEC SEC , In einem Patent der Firma Genencore (Gray et al. 1995) wurde die Aufreinigung zweier 30 kda großer mit Cutin induzierter Hydrolasen beschrieben, produziert durch den Stamm P. mendocina ATCC Beide Hydrolasen unterschieden sich aufgrund ihrer Fähigkeiten zur Hydrolyse von

118 Ergebnisse und Diskussion 101 verschiedenen p-np-estern. Nach der Kultivierung mit 0,3% Apfelcutin für Stunden erfolgte die Filtration des Überstandes (0,22 µm). Verbleibende Enzymaktivitäten auf den Cutinresten wurden mittels Zentrifugation gewonnen und es ergab sich eine Ausbeute von 90%. Anschließend erfolgten die Konzentrierung der Lösung mittels Ultrafiltration und eine Dialyse, wobei eine 80%ige Ausbeute erreicht wurde. Es erfolgte der Auftrag der Lösung auf eine ctyl-sepharose Säule und eine Waschung mit einem Harnstoff enthaltenden Puffer. Die Elution erfolgte mit einem linearen Gradienten mit 50% Isopropanol und zwei aktive Fraktionen mit unterschiedlichen p-npb/p-npc Verhältnissen wurden identifiziert. In Fraktion 32 besaß die Lipase 1 (mit Cutinase Aktivität) ein p- NPB/p-NPC Verhältnis von 4,6 und in Fraktion 51 die Lipase 2 (mit Cutinase Aktivität) ein p-npb/p- NPC Verhältnis von 1,4. Für eine Sequenzierung erfolgte eine weitere Aufreinigung der getrennten Hydrolasen mittels Umkehrphasen Chromatographie, wobei Lipase 1 bei 35% des Elutionspuffers eluierte und Lipase 2 bei 39% (Gray et al. 1995). Die erste Aufreinigung von Polyesterasen aus Pilzen erfolgte 1975 durch die Gruppe von Purdy et al. (Purdy und Kolattukudy 1975a). Dabei wurde das extrazelluläre Protein einer 12 Tage alten Kultur von F. solani f. pisi, gewachsen mit Apfelcutin aus Golden Delicious als einzige C-Quelle, mit 40-50% Ammoniumsulfat ausgefällt. Im Gegensatz dazu erfolgte 1973 bereits eine Kultivierung von F. solani f. pisi mit Cutin, isoliert aus Red Delicious Äpfeln, als einzige C-Quelle und nach 12 Tagen erfolgte die Fällung der aktiven Proteine mit 30% Ammoniumsulfat (Purdy und Kolattukudy 1973). Das unterschiedliche Fällungsverhalten wurde mit den enthaltenen Phenol-Verunreinigungen beim Cutin aus dem Golden Delicious begründet, welche mit dem aktiven Protein interagierten. Dabei hatten die extrazellulären Überstände die gleiche Proteinzusammensetzung bei beiden Kultivierungen. Es erfolgte eine Größenausschlusschromatographie mit Sephadex G-100, wobei die p-npp Aktivität bei einem MG Bereich von kda eluierte. In diesem Bereich war auch eine Cutinaseaktivität vorhanden, die mit der p-npp Aktivität überlappte. Da die Aktivitäten zu diesem Zeitpunkt nicht sauber getrennt werden konnten, wurden sie vereinigt und auf eine QAE-Sephadex Säule aufgetragen. Bei dem ph Wert von 9 banden Fremdproteine und auch das p-npp aktive Enzym, die Cutinase konnte damit von den anderen abgetrennt werden. Die Elution der Fremdproteine erfolgte bei ph 8,3 und der p-npp Aktivität bei ph 7. Die 2. SEC mit Sephadex G-100 zeigte für den Cutinasepeak von der QAE-Sephadex ebenfalls nur einen Proteinpeak mit Cutinaseaktivität und eine Verschiebung des Molekulargewichts um kda zu 22 kda aufgrund der Abtrennung der phenolischen Verunreinigungen. Bei der 2. SEC des Proteinpeaks mit p-npp Aktiviät zeigten sich ein Hauptpeak mit Aktivität und zwei kleine Peaks ohne Aktivität. Das MG der p-npp Hydrolase war das gleiche, wie bereits bei der ersten SEC, was bedeutet, dass die Phenole keinen Einfluss auf die Elution der Hydrolase hatten. Bei der anschließenden Kontrolle der Reinheit der Proteine konnten bei der

119 Ergebnisse und Diskussion 102 Cutinase zwei sehr eng liegende, aber trennbare Banden identifiziert werden, welche nach dem Ausschneiden beide Cutinaseaktivität besaßen. Somit handelte es sich bei der Cutinase um zwei sehr ähnliche Isoenzyme, welche mittels Ionenaustauschchromatographie mit einer SE-Sephadex Säule und einem linearen NaCl Gradienten getrennt werden konnten (Cutinase I und Cutinase II). Die p-npp Hydrolase hatte während der 34fachen Aufreinigung die meiste Aktivität bei dem QAE- Sephadex Schritt verloren. Lediglich eine 6,5 fache Aufreinigung vom Überstand hatte die Homogenität der Cutinasen zur Folge, da sie die direkte Antwort auf das Wachstum des Pilzes mit Cutin als einzige C-Quelle in hoher Konzentration waren. Das Ausgangsmedium enthielt 33 g Cutin und produziert wurden 48 mg Cutinase I und 20 mg Cutinase II nach der Aufreinigung (Purdy und Kolattukudy 1975a). Analog dazu wurden aus F. roseum culmorum mit derselben Kultivierung und Aufreinigung eine Cutinase (MG 24,3 kda) und eine p-npp Hydrolase isoliert. Diese Cutinase ähnelte aufgrund ihrer Aminosäurezusammensetzung eher der Cutinase I aus F. solani f. pisi (Soliday und Kolattukudy 1976). Bei der Kultivierung der fünf Pilz- bzw. Bakterienkulturen F. roseum culmorum, F. roseum sambucinum, Ulocladium consortiale, S. scabies und Helminthosporium sativum war die spezifische Aktivität von F. roseum sambucinum 50fach höher im extrazellulären Überstand gegenüber den anderen Kulturen. Die zuvor von Purdy und Kolattukudy 1975 entwickelte Aufreinigungsmethode wurde erfolgreich auch für diese extrazellulären Enzyme angewandt. Nach der Ammoniumsulfat-Fällung und der SEC mit Sephadex G-100 konnten auch zwei Peaks identifiziert werden, wovon der vordere cutinolytische Aktivität besaß und der hintere p-npp Aktivität. Diese Beobachtungen wurden auch von Purdy und Kollatukudy 1975 und von Soliday und Kolattukudy 1976 gemacht. Tabelle 19: Aufreinigungstabelle der Cutinasen und p-npp Hydrolase aus F. solani f. pisi (Purdy und Kolattukudy 1975a). Aktivität (%) Aktivität (%) Schritt Cutinase p-npp Hydrolase Spezifische Aktivität Spezifische Aktivität (10 4 dpm/µg) (µmol/mg) Cutinase 1 p-npp Hydrolase 2 Kulturüberstand (NH 4 ) 2 S 4 Fällung SEC ,1 17 AIEX ,6 123 SEC AIEX 2 30(I) 13(II) 7,8 1 Bestimmt mit Cutin als Substrat. 2 Bestimmt mit p-npp als Substrat.

120 Ergebnisse und Diskussion 103 Die Mikroorganismen produzierten alle nur eine Cutinase mit einem Molekulargewicht von 24,3-26,3 kda im Vergleich zu F. solani f. pisi. Für die fünf Cutinasen ergab sich eine 6-16 fache Aufreinigung mit 16-28% Ausbeute (Tabelle 20, Lin und Kolattukudy 1980a). Schritt Tabelle 20: Aufreinigungstabelle der extrazellulären Cutinasen (Lin und Kolattukudy 1980a). F. roseum sambucinum U. consortiale H. sativum S. scabies Protein (mg) Spez. Aktivität (10 3 dpm/µg) Protein (mg) Spez. Aktivität (10 3 dpm/µg) Protein (mg) Spez. Aktivität (10 3 dpm/µg) Protein (mg) Spez. Aktivität (10 3 dpm/µg) Kulturüberstand , , ,1 (NH 4 ) 2 S 4 Fällung , , ,13 SEC ,3 46 0,4 60 0,35 AIEX , ,2 AIEX ,8 3 1,2 4 1,2 Die spezifische Aktivität wurde mit Cutin als Substrat bestimmt. Fernando et al. (1984) kultivierte einen F. solani pisi Stamm im Mineralmedium mit Suberin als einzige C-Quelle. Im Mediumüberstand konnte nur eine geringe Menge an p-npb Aktivität detektiert werden. Daraufhin wurde die Myzelmatte mit 0,4% Triton X-100 in 0,2 M Natriumphosphatpuffer gewaschen und es konnte eine 13 fach höhere Aktivität nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass nach der Kultivierung 93% der Gesamtaktivität am Myzel oder am Suberin gebunden vorlag. Beim Auftrag auf die QAE-Sepharose wurden die farblichen Verunreinigungen gebunden, das aktive Enzym jedoch eluierte direkt wieder. Bei ph 4,8 band das aktive Enzym anschließend an die SP-Sephadex C- 25 Säule, die vorhandenen Verunreinigungen wanderten durch die Säule durch. Die Elution mit einem NaCl Gradienten ergab einen Elutionspeak, der nach Auftrag auf eine SP-Sephadex Säule 2 getrennte Peaks mit p-npb und Cutinaseaktivität hervorbrachte. Dabei handelte es sich um 2 Isoenzyme mit einem Molekulargewicht von 23 kda. Der Vergleich der Aminosäurezusammensetzung der Suberin- und Cutin-induzierten Cutinasen (Purdy und Kolattukudy 1975a) zeigte, dass diese Isoenzyme sich lediglich aufgrund eines nicht detektierten Methionins unterschieden. Somit besteht die Möglichkeit, dass die Cutin- und Suberin-induzierten Isoenzyme die gleichen sind (Fernando et al. 1984). Die PET-Hydrolase aus P. citrinium wurde aufgrund ihrer Aktivität gegenüber 3PET (BETEB) aufgereinigt. Zunächst erfolgte eine fraktionelle Ultrafiltration mit den Ausschlussgrößen von 50 und 5 kda. Die PET-Hydrolase wurde 67,9 fach bis zur elektrophoretischen Reinheit aufgereinigt, die Ausbeute betrug 6% nach AIEX und SEC. Die spezifische Aktivität betrug am Ende 14,8 nkat/mg und das Molekulargewicht wurde auf 14,1 kda bestimmt. Somit ist diese PET-Hydrolase die kleinste bekannte PET abbauende Hydrolase (Tabelle 21, Liebminger et al. 2007).

121 Ergebnisse und Diskussion 104 Schritt Tabelle 21: Aufreinigungstabelle der PET-Hydrolase aus P. citrinum (Liebminger et al. 2007). Volumen Aktivität Protein Spezifische Aktivität Ausbeute (ml) (nkat) (mg) (nkat/mg) (%) Kulturüberstand 200,0 120,6 552,0 0,2 100 AIEX 40,0 22,4 19,8 1,1 18,6 Entsalzung 30,0 18,0 12,7 1,4 15,0 AIEX 9,0 9,1 2,2 4,1 7,5 SEC 2,0 7,3 0,49 14,8 6,0 Die Rohenzymlösungen mit den hydrolysierenden Enzymen von F. oxysporum LCH 1 und F. solani f. sp. pisi wurden mittels Zentrifugation und Ausfällung gewonnen und es erfolgte mit ihnen die Untersuchung der Hydrolyse von PET-Fasern (Nimchua et al. 2007). Die für die Aufreinigung der PET-Hydrolasen eingesetzten Methoden variierten bei der Aufkonzentrierung des extrazellulären Überstandes, es kamen Ultrafiltration, verschiedene Fällungen und die Gefriertrocknung zum Einsatz. Diese Schritte waren meist mit einem höheren Verlust an aktivem Enzym verbunden, allerdings von Nöten für die weitere Aufreinigung, da das extrazelluläre Enzym in einer zu hohen Verdünnung vorlag (Purdy und Kolattukudy 1973, Soliday und Kolattukudy 1976, Sebastian et al. 1988, Gouda et al. 2002, Kleeberg et al. 2005). Für die TfCa wurden auch verschiedene Aufkonzentrierungsmethoden getestet mit dem Ergebnis, dass die Aufreinigungsverluste mit der Gefriertrocknung am geringsten waren. Bei der anschließenden chromatographischen Aufreinigung kamen meistens eine IEX oder SEC zum Einsatz, seltener eine HIC aufgrund der stark hydrophoben Eigenschaften der PET-Hydrolasen und der daraus resultierenden schlechten Rückgewinnung des Enzyms vom Säulenmaterial. Die Aufreinigung der hydrolytischen Enzyme konnte mit einer 3 bis 5 Schritt Aufreinigungsmethode bis zur elektrophoretischen Reinheit bewerkstelligt werden. Dabei lagen die Ausbeuten bei 3-30%, im Vergleich dazu lag die Ausbeute der TfCa bei 7% (Billig et al. 2010). Eine interessante Besonderheit konnte bei der Aufreinigung der Cutin-induzierten Hydrolasen aus den Pilzen F. solani f. pisi, F. roseum culmorum, F. roseum sambucinum, U. consortiale und H. sativum, aber auch beim Actinomyceten S. scabies identifiziert werden. Parallel zur Cutinase produzierten diese Stämme mit Cutin als einzige C-Quelle ebenfalls eine Esterase, welche p-npb und p-npp spalten konnte (Purdy und Kolattukudy 1975a, Lin und Kolattukudy 1980a). Ebenfalls besaß diese p-npp Esterase ein MG von 52 kda (Purdy und Kolattukudy 1975a). Der Pilz F. solani f. pisi unterschied sich zusätzlich von den anderen Kulturen, indem er zwei Isoenzyme während des Wachstums mit Cutin bildete (Purdy und Kolattukudy 1975a). Bei allen weiteren Aufreinigungen von PET-Hydrolasen wurde auf die Produktion einer zusätzlichen p-npb oder p-npp Esterase nicht geachtet. Bei der Aufreinigung der Cutinase aus P. mendocina konnte beim ersten

122 Ergebnisse und Diskussion 105 Anionenaustauschschritt ein starker Verlust der p-npb Aktivität verzeichnet werden, was mit einer möglichen Abtrennung einer weiteren Esterase begründet wurde (Sebastian et al. 1988). Aufgrund der bisherigen Ergebnisse scheint diese Annahme als sehr wahrscheinlich. Die Aufreinigungen der TfH aus T. fusca DSM und der PET-Hydrolase aus P. citrinum erfolgte mit BTA bzw. 3PET induzierten Kulturen und deshalb könnte die Produktion einer mitinduzierten Esterase nicht stattgefunden haben oder in zu geringen Mengen für einen direkten Nachweis erfolgt sein (Kleeberg et al. 2005, Liebminger et al. 2007). Fernando et al. (1984) kultivierte den Pilz F. solani f. pisi mit Suberin als Induktor. Während der anschließenden Aufreinigung der Suberin-hydrolysierenden Enzyme wurde keine zusätzliche Esterase detektiert bzw. nicht nach ihr gesucht. Es wäre interessant, die beiden Esterasen TfCa und die eukaryotische Esterase in ihren Sequenzen und katalytischen Zentren zu vergleichen und herauszufinden, warum die eukaryotische Esterase unter Zusatz von Cutin produziert wird und ob die Produktion auch unter Zusatz eines synthetischen Polyesters nachweisbar wäre. Weiterhin ob und wie sich die beiden Esterasen hinsichtlich ihrer PET- Hydrolyseaktivität unterscheiden würden. Eine weitere Besonderheit war ebenfalls die beobachtete Hydrophobie der PET-Hydrolasen begründet durch ihre Affinität zu den abzubauenden hydrophoben Substraten. Diese Eigenschaft wurde bei der Aufreinigung der TfCa ausgenutzt Aufreinigung der rekombinanten PET-Hydrolasen Die TfCa und die Cutinasen TfCut1 und TfCut2 aus T. fusca KW3 wurden bereits erfolgreich kloniert und mit Hilfe verschiedener E. coli Stämme exprimiert (eser et al. 2010, Chen S et al. 2008). Die Hydrolaseproduktion erfolgte bei einer optimalen Kultivierungstemperatur von 18 C im 5 L Fermenter. Bei der niedrigeren Temperatur erfolgte eine geringere Bildung an Einschlusskörpern der produzierten Enzyme und somit stand mehr aktives Protein nach der Kultivierung für die Aufreinigung zur Verfügung. Mit den optimierten Bedingungen erfolgte die rekombinante Produktion der TfCa mit einer 4500fach höheren Aktivität gegenüber dem Wildtyp und die spezifische Aktivität (U/mg) stieg um mehr als das 30fache (eser et al. 2010). Die rekombinante TfCa, gewonnen aus dem löslichen Zellinhalt, wurde mittels Nickel-Affinitätschromatographie (Abbildung 40) und Größenausschlusschromatographie (Abbildung 41) aufgereinigt. Es erfolgte eine Aufreinigung um das 12fache (spezifische Aktivität 35 U/mg) (Tabelle 22, Abbildung 44A). Unter den gleichen Kultivierungsbedingungen wurden ebenfalls die beiden Cutinasen TfCut1 und TfCut2 aus T. fusca KW3 in E. coli produziert und mittels Affinitätschromatographie (Abbildung 42) und Größenausschlusschromatographie (Abbildung 43) aufgereinigt. Da es sich bei den beiden Cutinasen um Isoenzyme mit ähnlichen Eigenschaften handelte, sind hier nur die Aufreinigungdaten

123 Ergebnisse und Diskussion 106 für die Cutinase II exemplarisch dargestellt. Nach der 2-Schritt Aufreinigung der TfCut2 konnte eine 9fach höhere Reinheit nachgewiesen werden (spezifische Aktivität TfCut2 26 U/mg) (Tabelle 23, Abbildung 44B). Abbildung 40: Elutionsprofil der TfCa während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mm NaH 2 P 4, 300 mm NaCl; ph 8,0, Puffer B: 50 mm NaH 2 P 4, 300 mm NaCl, 250mM Imidazol, ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-npb Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). Abbildung 41: Elutionsprofil der TfCa während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mm Phosphatpuffer ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-npb Aktivität (schwarz).

124 Ergebnisse und Diskussion 107 Abbildung 42: Elutionsprofil der TfCut2 während des ersten Aufreinigungsschritts (HisTrap, Säulenvolumen 10 ml, Puffer A: 50 mm NaH 2 P 4, 300 mm NaCl; ph 8,0, Puffer B: 50 mm NaH 2 P 4, 300 mm NaCl, 250 mm Imidazol, ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-npb Aktivität (schwarz) und der Gradient der Elution (gestrichelt). Abbildung 43: Elutionsprofil der TfCut2 während des zweiten Aufreinigungsschritts (Sephadex 200 prep grade, Säulenvolumen 320 ml, Puffer: 0,15 M NaCl, 20 mm Phosphatpuffer ph 8). Dargestellt sind das Proteinprofil (grau), die p-npb Aktivität (schwarz).

125 Ergebnisse und Diskussion 108 Abbildung 44: SDS-PAGE der Aufreinigung der rekombinant produzierten TfCa in E. coli (A) und der rekombinant produzierten TfCut2 in E. coli (B). Spur M: Low Molecular Weight Längenstandard; Spur 1, 4: Rohenzymlösung nach Zellaufschluss; Spur 2, 5: Enzymlösung nach Ni-Affinitätschromatographie; Spur 3, 6: Enzymlösung nach SEC. Schritt Zellfreier Extrakt Volumen (ml) Tabelle 22: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCa. Aktivität Protein Spezifische Aktivität Ausbeute Aufreinigung (U) (mg) (U/mg) (%) (fach) HisTrap SEC Schritt Zellfreier Extrakt Volumen (ml) Tabelle 23: Aufreinigungstabelle der rekombinanten TfCut2. Aktivität Protein Spezifische Aktivität Ausbeute Aufreinigung (U) (mg) (U/mg) (%) (fach) HisTrap SEC Die TfH wurde durch Dresler et al auch bereits rekombinant in E. coli TG1 mit dem Plasmid pcytexp1-mpa-bta1-his 6 produziert, sekretiert und aufgereinigt. Im Vergleich mit der Wildtyp Produktion konnte rekombinant extrazellulär eine 1,5-2fach höhere volumetrische Aktivität in den Batch Kulturen und eine 20fach höhere in den Fed-Batch Kulturen erzielt werden (unter Glucose Limitation). Die volumetrische Aktivität intrazellulär konnte sogar um das 50fache gesteigert werden und somit stieg die Gesamtproduktion um mehr als das 100fache gegenüber dem Wildtyp. Aufgrund des angehängten His 6 -Tags erfolgte die einfache Aufreinigung des periplasmatischen und

126 Ergebnisse und Diskussion 109 zytoplasmatischen (Einschlusskörper) Proteins in zwei Schritten. 57% Ausbeute konnte erzielt werden und eine 30fache Aufreinigung mit einer spezifischen Aktivität von 445 U/mg wurde erreicht (Tabelle 24). Zum Vergleich beim Wildtyp konnte nur 14% Ausbeute nachgewiesen werden (Dresler et al. 2006). Tabelle 24: Aufreinigungstabelle der rekombinanten periplasmatischen (pp-rtfh) und zytoplasmatischen (zp-rtfh) TfH (Dresler et al. 2006). Schritt Aktivität (10 3 U/L) Protein (mg/l) Spezifische Aktivität (U/mg) Ausbeute (%) Aufreinigung (fach) pp-rtfh Extrakt 8, HisTrap 6, SEC 4, zp-rtfh Extrakt 26, , Hitzebehandlung 22, ,3 85 1,5 Ultraschall- und Hitzebehandlung 28, ,5 109* 2 * Rohextrakt nach Ultraschall und Zentrifugation. In weiterführenden Studien erfolgte nach einer Codon-ptimierung die erfolgreiche rekombinante Produktion der TfH mit B. megaterium WH323. Bei einer ph-kontrollierten Batchkultivierung konnte eine weitere Steigerung auf 16,1 mg/l rtfh erzielt werden. Nach der Induktion durch Xylose erfolgte ein starker Anstieg der rtfh Produktion für 4 Stunden. Beim Vergleich der produzierten Mengen an rtfh mittels B. megaterium und E. coli (Dresler et al. 2006) konnte für die Batchkultivierung mit LB Medium und Hochzelldichten-Kultivierung mit synthetischem Medium ähnliche Ergebnisse erzielt werden (Tabelle 25). Beide zeigten eine fach höhere Produktion gegenüber dem Wildtyp (Yang et al. 2007). Tabelle 25: Expression der rekombinanten TfH in E. coli und B. megaterium (Yang et al. 2007). B. megaterium WH323 E. coli TG 1 Kultivierung Medium U/g U/L U/g U/L Batch LB Batch Definiert Hochzelldichten- Definiert /227* 5500/12000* Kultivierung * abhängig von der Induktionsphase (Temperaturänderung)

127 Ergebnisse und Diskussion 110 Die Aufreinigung der rtfh erfolgte ebenfalls mittels Ni-Affinitätschromatographie. Die Protokolle einiger Proteinaufreinigungen verschiedener Kultivierungsansätze sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst (Yang et al. 2007). Tabelle 26: Übersicht zur Affinitätsaufreinigung der His6-Tag rtfh produziert durch B. megaterium WH323-pYYBm9 gewachsen in einer LB-Batch Kultivierung und Hochzelldichten-Kultivierung (HZDK) mit A5 Medium. I:ohne Vorhbehandlung; II: 50 C für 10 min; III: 18 Stunden Dialyse bei 4 C (Yang et al. 2007). LB-I LB-II LB-III HZDK-I HZDK-II Kultivierung HZDK-III Extrakt HisTrap Extrakt HisTrap Extrakt HisTrap Extrakt HisTrap Extrakt HisTrap Extrakt HisTrap Aktivität (U) Protein (µg) Spezifische Aktivität (U/mg) Ausbeute (%) Aufreinigung (fach) 1,0 3,2 1,0 2,9 1,0 1,9 1,0 1,3 1,0 1,7 1,0 1,2 Die gleichen Cutinasen wurden 2008 von Chen S et al als Cutinase 1 und Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 nach vorherigen Vermehrungs- und Modifikationsschritten in den pet20b(+) Vektor kloniert und anschließend in E. coli Rossetta (DE3) plyss einzeln transformiert (Chen J et al. 2008). Das Wachstum der transformierten Klone erfolgte unter Zusatz von Ampicillin und Chloramphenicol und bei einer Zelldichte von 1,5 (D 600 ) erfolgte die Induktion mit IPTG. Nach 16 Stunden Expression erfolgte die Zellernte, Konzentrierung des Kulturüberstand, Dialyse und Ni-Affinitätschromatographie (Chen S et al. 2008). Die p-npb Aktivität im Kulturüberstand der transformierten E. coli Zellen mit dem Plasmid pet20b- Cutinase 2 lag bei 180 U/ml, und damit um das 782fache höher als bei den untransformierten Zellen und um das 9,5fache höher als bei den Cutin-induzierten Zellen von T. fusca. Die p-npb Aktivität im Kulturüberstand der transformierten E. coli Zellen mit dem pet20b-cutinase 1 Vektor lag bei 69 U/ml, und damit um das 300fache höher als bei den untransformierten Zellen und um das 3,6fache höher als in den Cutin-induzierten T. fusca Zellen. Die rekombinanten Enzyme wurden bis zur homogenen Reinheit mit einem Schritt mittels Ni-Affinitätschromatographie aufgereinigt und

128 Ergebnisse und Diskussion 111 besaßen eine spezifische Aktivität von 458 U/mg (Cutinase 2) und 223 U/mg (Cutinase 1) (Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008). Sinsereekul et al. (2010) konstruierten einen transkonjuganten S. rimosus R7 mit dem Vektor pij-bta, der das Gen für eine Ecoflex Filme-abbauende Hydrolase enthielt. Das Gen wurde aus dem Isolat Thermobifida sp. BCC23166 gewonnen, isoliert aus einer Probe von einer Deponie. Es erfolgte die Ligation des Gens in den pij8600 Vektor und der Transfer in S. rimosus R7 mittels intergenetischer Konjugation. Dieses entwickelte Expressionssystem zeichnete sich durch die Produktion des gesamten nativen Proteins aus dem unmodifizierten Gen ohne Codon ptimierung und Modifikation durch Fusionsproteine aus. Allerdings war zum damaligen Zeitpunkt die anfängliche Ausbeute aus der Expression geringer (0,058 mg/l) verglichen mit den Expressionssystemen in E. coli oder B. megaterium. Das produzierte rekombinante Enzym (mit His 6 Tag) wurde anschließend bis zu einer 95% Reinheit mittels einer Ein-Schritt Aufreinigung durch eine Ni-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Dabei betrug das Kulturvolumen am Beginn 500 ml und die Ausbeute nach der Reinigung 82,5% (Sinsereekul et al. 2010). In neuesten Studien wurde eine thermoaktive Hydrolase Est119 aus Thermobifida alba AHK119 rekombinant ebenfalls in E. coli produziert. Dazu wurde das isolierte Gen der Hydrolase ohne die Signalsequenz in den Vektor pqe80l kloniert, mit den Vektor pqe80l-est119 als Produkt. Das rekombinante Protein mit einem N-terminalen His 6 Tag konnte erfolgreich mit dem E. coli Rosettagami B (DE3) nach der Zugabe von IPTG produziert werden. Die rekombinante 29 kda Cutinase konnte um das 2,3fache mittels einer Ein-Schritt Aufreinigung mit der Ni-Affinitätschromatographie Säule aus dem zellfreien E. coli Extrakt gewonnen werden (Spezifische Aktivität 1.37 U/mg, Hu et al. 2010). Die Cutinasen aus P. mendocina ATCC wurden nach der Identifikation der Gene einzeln in das Plasmid psntacii kloniert und rekombinant in E. coli JM101 exprimiert. 74% der Aktivität der Hydrolase 1 lagen nach der Kultivierung extrazellulär vor, 17% Aktivität in den Zellen, 2% im periplasmatischen Raum und 7% an der Cytoplasmamembran. Die Aufreinigung der Hydrolasen erfolgte mittels ctyl-sepharose analog zur bereits erläuterten Aufreinigung der Wildtyp Enzyme. Die Cutinase 1 zeigte eine p-npb Aktivität von 3750 U/mg Protein, bestand aus 259 Aminosäuren ohne Signalsequenz und zeigte ein p-npb/p-npc Verhältnis von 7 (Cutinase 2 besaß ein Verhältnis von 1) (Gray et al. 1995). Für die präparative Produktion der F. solani Cutinase erfolgte die Kultivierung von E. coli WK6 Zellen, welche das Plasmid pma/c5-cuf enthielten. Bei einer optischen Dichte von 410 erfolgte die Induktion mit IPTG über 6 bis 12 Stunden (Carvalho et al. 1999). Aufschlussmethoden der Cutinase waren kombinierte Methoden wie z.b. osmotischer Schock und Präzipitation der Verunreinigungen mit verdünnter Essigsäure. Anschließend erfolgte die Aufreinigung mittels Kationenaustauscher, wie

129 Ergebnisse und Diskussion 112 SP-Sephadex oder in zwei Anionenaustauschschritten, z.b. mit DEAE-Cellulose und MonoQ- oder Q- Sepharose HP. Die endgültige Ausbeute der Aufreinigung lag bei 51% und der Aufreinigungsfaktor bei 10. Die Aufreinigung der Cutinase, produziert durch Hefezellen, verlief ähnlich wie mit den Bakterienzellen, allerdings folgte am Schluss eine Affinitätschromatographie mit einer Con-A Sepharose-4B Säule zur Entfernung der glykosylierten Fraktionen (Carvalho et al. 1999). Neuere Aufreinigungsmethoden sind die Umkehrmyzellen Extraktion und das wässrige Zwei-Phasen System als Alternative für die Säurepräzipitation, Filtration, Zentrifugation oder Dialyse (Carvalho et al. 1999). Mit der Umkehrmyzellen Extraktion konnten Ausbeuten von 5-50% erreicht werden mit Aufreinigungsfaktoren von 1,2 bis 10,2. Bei der direkten Extraktion der Cutinase aus dem Zellextrakt mit Zellbruchstücken der E. coli Zellen lag die Ausbeute bei optimalen Bedingungen bei 54,4% (Carvalho et al. 1999). Beim wässrigen Zwei-Phasen System lagen die Ausbeuten immer sehr hoch, meist über 90%. Bei einer Ein-Schritt Aufreinigung der Cutinase aus E. coli Zelltrümmern lagen die Ausbeute bei 91% und der Aufreinigungsfaktor bei 4,1, bei einem Zeitaufwand von nur 20 min (Carvalho et al. 1999). Die Cutinase aus F. solani pisi wurde in B. subtilis Zellen mit dem Vektor pbsmul3 während des Wachstums im Medium mit Kanamycin produziert. Die Proteine des Kulturüberstands wurden mit Ammoniumsulfat ausgefällt, zentrifugiert, resuspendiert und dialysiert. Nach einer erneuten Präzipitation der verunreinigenden Proteine mit Ammoniumsulfat erfolgte die Filtration der Lösung und der Auftrag auf eine Phenyl HP-Sepharose Fast Flow Säule. Die Elution der Cutinase erfolgte mit einem linearen Gradienten von 20% auf 0% Ammoniumsulfat im Elutionspuffer. Die Fraktionen mit p-npb Aktivität wurden anschließend auf eine CM-Sepharose Säule aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M Natriumchlorid eluiert (Chen S et al. 2008). Die Cutinase aus T. insolens wurde in A. niger mit dem Vektor pa2l79 rekombinant produziert. Nach der Produktion erfolgte die Gewinnung der intrazellulären Cutinase mittels Zentrifugation und Ultrafiltration. Mit dem Überstand erfolgte eine Ammoniumsulfatfällung. Das Präzipitat mit der Cutinase wurde mittels Zentrifugation gewonnen, in Wasser gelöst und mit Essigsäure auf ph 6 eingestellt. Zur Entfernung der enthaltenen Proteasen passierte die Lösung eine Bacitracin-Agarose Säule und die eluierten aktiven Fraktionen wurden auf eine Kationenaustausch SP-Sepharose HP Säule aufgetragen. Die Cutinase wurde mit einem linearen Salzgradienten eluiert (Sandal et al. 1996). Bisher wurden verschiedenste bekannte Systeme für die rekombinante Expression von Hydrolasen und deren Aufreinigung zusammengefasst. Bei der Wahl des jeweiligen Expressionssystems besteht keine Möglichkeit zur Diskussion, da die Auswahl nach dem try and error Verfahren abläuft und jedes der Systeme seine spezifischen Vor- und Nachteile aufweist. Eines ist allerdings für alle rekombinanten Produktionen zu empfehlen, die Verwendung eines His 6 Tags für eine deutlich einfachere und spezifischere Aufreinigung des rekombinanten Proteins, wie es auch für die beiden in diesem Abschnitt beschriebenen Hydrolasen aus T. fusca KW3, produziert mittels E. coli, erfolgte.

130 Ergebnisse und Diskussion 113 Dadurch sind Ausbeuten von über 50% keine Seltenheit. In dieser Hinsicht sollte die Aufreinigung der beiden rekombinanten Hydrolasen aus T. fusca KW3 noch weiter optimiert werden, damit eine Steigerung der Ausbeute erfolgen kann pi der TfCa Der bestimmte pi der TfCa lag bei 4,8 (theoretischer Wert 4,79). St St Abbildung 45: PhastGel der Bestimmung des isoelektrischen Punktes der TfCa. (linkes Gel PhastGel IEF 3-9, rechtes Gel PhastGel IEF 4-6,5) Spur 1: 26,7 ng TfCa; Spur 2: 66,7 ng TfCa; Spur 3: 133 ng TfCa; Spur 4: 26,7 ng TfCa; Spur 5: 53,4 ng TfCa; Spur 6: Kalibrierungskit für die pi Bestimmung, Breiter pi Bereich (ph 3-10, GE Healthcare) Molare Masse der TfCa Die Molekulargewichtsbestimmung erfolgte mit einer SDS-PAGE mit der partiell aufgereinigten Enzymlösung und des Roti -Mark SDS Proteinstandards (Fa. Carl Roth GmbH).

131 lg MW Ergebnisse und Diskussion ,8 y = -0,089x + 2,037 R² = 0,993 1,6 1,4 1, Laufstrecke (cm) Abbildung 46: Laufstrecken der Proteine des Roti -Mark SDS Proteinstandards (Fa. Carl Roth GmbH) aufgetragen gegen den Logarithmus ihres Molekulargewichtes. Nach erfolgter elektrophoretischer Auftrennung wurden die Laufstrecken der Proteine des Standards bestimmt und gegen den Logarithmus ihres Molekulargewichts aufgetragen (Abbildung 46). Für die untersuchte TfCa ergab sich daraus ein exaktes Molekulargewicht von 52,4 kda, was mit dem theoretischen MG von 52,94 kda gut übereinstimmt Temperatur- und ph-stabilität der TfCa Für die Bestimmung der Stabilität der TfCa bei verschiedenen ph-werten wurde die Esterase in 100 mm Puffern mit ph-werten von 3 bis 11 für 7 Tage inkubiert und die Esteraseaktivitäten zu verschiedenen Zeiten mit p-npb als Substrat spektrophotometrisch bestimmt. Ein Citrat-Phosphat- Puffer wurde für ph 3 bis 7 verwendet, Phosphatpuffer für ph 8 und Glycin-NaH Puffer für ph 9 bis 11. Die Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur. Bei der Inkubation der TfCa bei verschiedenen ph-werten wurde festgestellt, dass die Esterase hohe Stabilität im alkalischen Bereich auch über einen längeren Zeitraum besitzt (Abbildung 47). Nach 7 Tagen Inkubation konnte bei ph 9 und 10 noch eine relative Aktivität von 85% nachgewiesen werden. Aber auch bei ph 5 und 11 zeigte die TfCa nach 7 Tagen Inkubation noch eine relative Aktivität von 22% und 16%. Das bedeutet, dass die Esterase bei kürzeren Inkubationen, wie zum Beispiel nach 24 Stunden (Abbildung 48), im ph-bereich von 5 bis 11 noch eine relative Aktivität von 40% bis 100% besitzt und somit einen breiten Einsatzbereich vorweisen kann.

132 Relative Aktivität (%) Relative Aktivität (%) Ergebnisse und Diskussion Inkubationszeit (d) ph 4 ph 5 ph 6 ph 7 ph 8 ph 9 ph 10 ph 11 Abbildung 47: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation in unterschiedlichen ph- Werten von 4 bis 11 bestimmt mit p-npb als Substrat ph Abbildung 48: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation in verschiedenen ph-werten von 3 bis 11 bestimmt mit p-npb als Substrat. Für die Stabilitätsuntersuchung der TfCa bei verschiedenen Temperaturen wurde die Esterase in 100 mm Phosphatpuffer ph 8 bei den Temperaturen 40 C, 50 C und 55 C für 7 Tage inkubiert. Die Esteraseaktivitäten wurden mit p-npb als Substrat spektrophotometrisch bestimmt.

133 Relative Aktivität (%) Relative Aktivität (%) Ergebnisse und Diskussion Inkubationszeit (d) 40 C 50 C 55 C Abbildung 49: Esteraseaktivitäten der TfCa über einen Zeitraum von 7 Tagen bei Inkubation bei 40 C, 50 C und 55 C bestimmt mit p-npb als Substrat (Billig et al. 2010) Temperatur ( C) Abbildung 50: Esteraseaktivitäten der TfCa nach 24 Stunden Inkubation bei 30 C, 40 C, 50 C und 55 C bestimmt mit p-npb als Substrat. Die TfCa besitzt ebenfalls eine hohe Stabilität bei Temperaturen von 40 bis 50 C, (Abbildung 49). Nach 7 Tagen Inkubation bei diesen Temperaturen war noch eine relative Aktivität zwischen 93 und 100% nachweisbar. Bei 40 C erfolgte über diesen Zeitraum keine Verminderung der Aktivität, die Aktivität blieb über den gesamten Zeitraum konstant. Bei 55 C hingegen konnte nach 24 Stunden

134 Ergebnisse und Diskussion 117 Inkubation lediglich 1% Restaktivität detektiert werden (Abbildung 50). Bei höheren Temperaturen erfolgte die Inaktivierung der Esterase in einem noch kürzeren Zeitraum Wirkung von Inhibitoren auf die TfCa Um eine Einordnung der TfCa in der Enzymgruppe der Hydrolasen durchzuführen, wurde die Stabilität des Enzyms gegenüber verschiedener spezifischer und unspezifischer Inhibitoren untersucht. Die Inhibitoren, welche eingesetzt wurden, waren EDTA, PMSF, TPCK und DTT. Sie wurden nach Anweisung in Puffer, Isopropanol oder Ethanol gelöst. Die eingesetzten Konzentrationen der Inhibitoren lagen bei 0,1 mm, 1 mm und 10 mm. Für die Untersuchung wurde die TfCa in 25 mm Phosphatpuffer ph 8 mit dem Inhibitor für 15 min bei 30 C inkubiert und die verbleibende Esteraseaktivität mit p-npb als Substrat spektrophotometrisch gemessen (Tabelle 27). Die Inhibitoren EDTA und DTT zeigten mit verschiedenen Konzentrationen keine Hemmung der Esteraseaktivität. Hingegen zeigte sich mit den spezifischen Esterasehemmern PMSF und TPCK eine deutliche Erniedrigung der Aktivität ab einer Konzentration des Inhibitors von 1 mm. Mit 10 mm Inhibitor war die verbleibende Esteraseaktivität mit PMSF 35% und mit TPCK konnte keine verbleibende Aktivität bestimmt werden. Tabelle 27: Übersicht über die verbleibenden Esteraseaktivitäten nach der Inkubation der TfCa mit verschiedenen Inhibitoren. Inhibitor Konzentration (mm) Aktivität (%) Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) 0, Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromethylketon (TPCK) 0, Dithiothreitol (DTT) 0,

135 Ergebnisse und Diskussion Kinetik der Hydrolyse von verschiedenen Esterasesubstraten durch die TfCa Für die Bestimmung der Substratspezifität der TfCa wurden verschiedene Modellsubstrate und die zyklischen PET-Trimere (CTR) eingesetzt, um die kinetischen Konstanten für den Umsatz der Substrate zu bestimmen. Bei den Modelsubstraten handelte es sich um die p-nitrophenylester der Essigsäure, der Buttersäure, der Caprylsäure und der Palmitinsäure. Dafür wurde die TfCa in Puffer mit den Substraten in unterschiedlichen Konzentrationen gegeben und die Umsatzgeschwindigkeit anhand des entstandenen Produktes, p-nitrophenol, bestimmt. Mit den Konzentrationen und den Umsatzgeschwindigkeiten konnten dann die kinetischen Konstanten K m und V max für die einzelnen Substrate per Lineweaver-Burk Darstellung berechnet werden. Diese Untersuchung wurde abschließend auch für die zyklischen Trimere des PET durchgeführt. Dazu wurde eine Stammlösung der Trimere in 1,4-Dioxan hergestellt. Für die Bestimmung der kinetischen Parameter wurden die zyklischen Trimere in verschiedenen Konzentrationen zu einer Pufferlösung mit der TfCa gegeben und bei 50 C für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert und per Umkehrphasen-HPLC mit 0,1% TFA (Puffer A) und Acetonitril (Puffer B) analysiert. Die entstandenen Abbauprodukte wurden bei 241 nm mit dem UV Detektor detektiert. Die kinetischen Konstanten K m und V max für die CTR wurden per Lineweaver-Burk Darstellung berechnet (Abbildung 51). Tabelle 28: Kinetische Parameter der Hydrolyse von p-np-estern und PET-Trimeren durch die TfCa aus T. fusca KW3. Substrat Acyl-Rest K m (mm) V max (µmol/min/mg) p-nitrophenylester p-nitrophenylacetat 2:0 0,27 ± 4% 46,1 ± 1% p-nitrophenylbutyrat 4:0 0,16 ± 4% 88,1 ± 1% p-nitrophenylcaprylat 8:0 0,20 ± 4% 64,0 ± 1% p-nitrophenylpalmitat 16:0 k. A. k. A. PET Trimere 0,47 ± 9% 9,3 ± 6% k. A.: keine Aktivität

136 Ergebnisse und Diskussion 119 Abbildung 51: Lineweaver-Burk Darstellung für die enzymkatalysierte Hydrolyse der CTR durch die TfCa. Mit Hilfe der doppeltreziproken graphischen Darstellung konnten die Geschwindigkeitskonstanten V max und K m bestimmt werden ptimale Temperatur und optimaler ph-wert der CTR-Hydrolyse durch die TfCa Für die Anwendung der Esterase zum Abbau von zyklischen PET-Trimeren wurde die optimale Temperatur und der optimale ph-wert der CTR Hydrolse bestimmt. Dazu erfolgte der Ansatz mehrerer Reaktionen mit verschiedenen ph-werten des Puffers und die Inkubation bei verschiedenen Temperaturen, um deren Einfluss auf die Abbaurate zu bestimmen. Die TfCa besitzt ein Temperaturoptimum für den Abbau von zyklischen PET-Trimeren bei 60 C und ein ph-ptimum bei ph 6 (Abbildung 52). Abbildung 52: ph und Temperaturoptimum der TfCa beim Abbau von zyklischen PET-Trimeren, bestimmt per RP HPLC (Billig et al. 2010).

137 Relative Abundanz Relative Abundanz Ergebnisse und Diskussion Cutinaseaktivität der TfCa Um zu testen, ob die aufgereinigte TfCa auch in der Lage ist, Cutin abzubauen, wurden je 1 U, 2 U und 4 U der TfCa mit Cutin inkubiert. Die nachfolgenden Chromatogramme zeigen die gaschromatographischen Analysen der verschiedenen Ansätze (Abbildung 53-56) Analysezeit (min) Abbildung 53: Gaschromatographische Analyse des Blindwerts (ohne Enzym) der Cutinhydrolyse Analysezeit (min) Abbildung 54: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 1 U TfCa der Cutinhydrolyse

138 Relative Abundanz Relative Abundanz Ergebnisse und Diskussion Analysezeit (min) Abbildung 55: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 2 U TfCa der Cutinhydrolyse Analysezeit (min) Abbildung 56: Gaschromatographische Analyse des Ansatzes mit 4 U TfCa der Cutinhydrolyse. Die Analysechromatogramme der enzymatischen Cutinhydrolyse zeigen, dass das partiell aufgereinigte Enzym nicht in der Lage war, das Biopolymer zu hydrolysieren. Damit gehört dieses Enzym nicht zur Gruppe der Cutinasen PCL-Abbau durch die TfCa Nach 24 Stunden zeigte die Platte mit der TfCa keine Hofbildung, die Platten mit den Enzymlösungen aus dem Suberin- und Cutin MSV-Medium jedoch eine deutliche Hofbildung (Abbildung 57). Das bedeutet, dass die TfCa keine Cutinase sondern eine Carboxylesterase ist, da sie weder Cutin noch

139 Ergebnisse und Diskussion 122 PCL hydrolysierte. Die mit den Cutin- und Suberinpräparationen inkubierten PCL-Platten zeigten eine deutliche Hofbildung, was bedeutet, dass diese Enzyme wahrscheinlich Cutinasen sind. Abbildung 57: PCL-Agarplatten nach 24 stündiger Inkubation mit TfCa (linkes Photo), mit dem Kulturüberstand des Suberin- MSV-Mediums (mittleres Photo) und mit Kulturüberstand des Cutin-MSV-Mediums (rechtes Photo) N-terminale Sequenz der TfCa Die eindeutige Identifizierung der Esterase erfolgte über die Bestimmung der Protein und DNA Sequenz. Hilfreich dabei war die Publikation von Lykidis et al. (2007), welche die komplett identifizierte genomische Sequenz von T. fusca XY enthält. Es wurden die ersten 10 Aminosäure-Reste der TfCa ansequenziert. In Tabelle 29 ist die detektierte N-terminale Sequenz dargestellt. An Position 3 und 5 können entweder Lysin oder Isoleucin stehen. Tabelle 29: Identifizierte N-terminale Sequenz der TfCa aus T. fusca KW3. Aminosäure-Rest Aminosäure M E I/K V I/K R T G S G Das zu dieser N-terminalen Sequenz mittels Datenbank-Recherche ermittelte identische Protein ist eine Carboxylesterase (EC ) mit der Bezeichnung Tfu_2427. Es besitzt eine berechnete Größe von 52,8 kda und eine für Hydrolasen typische katalytische Triade aus den Aminosäuren Serin, Glutamat und Histidin. Ebenfalls ist die Region des Serins hochkonserviert und besitzt das Sequenzmotiv GESAG. Die Lokalisation des Gens im Genom und die Sequenz einschließlich der katalytischen Triade sind in den Abbildungen 58 und 59 dargestellt. Abbildung 58: Lokalisation des Tfu_2427 Gens im Genom von T. fusca YX (Quelle:

140 Ergebnisse und Diskussion meivirtgsg dvrgskengi avfrgipyae ppvgahrfta prpprpwdgv rdatefsata 61 prppypeaig allierfipg ddyltlnvwt pdpnavglpv mvwihggaft ngsgsepvyd 121 gaafardgvv fvsfnyrlgi igfadlpdap snrglldqia alewvrdnia rfggdpgnvt 181 vfgesagams vctlmatpra rglfrrailq sgagnmavaa edattiaavi ahrlgvepta 241 aalahvpvaq lldvqqqvaq eiqgapdpav wgeriaggsv llpfapvidg ellsqrpaea 301 iaggaghdvd llfgtttdey rlflaptgll pfitgdyvtt hlaksgldad aakaytaegr 361 geepgdilas iitdqvfrip alriaesrvd apartfgyef awrtpqldgi lgachavelp 421 fvfrtldraa slvgtnppee laetvhnawv rfatsgdpgw pawnpetrsv mrfdhpvsem 481 vtdpypatra lwdgvpl Abbildung 59: Proteinsequenz von Tfu_2427 aus T. fusca YX, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv sind gelb markiert. Die ersten 10 Aminosäuren am N-Terminus, anhand derer die Identifikation erfolgte, sind unterstrichen (Billig et al. 2010) MALDI-TF Sequenzierung der TfCa Die durch die N-terminale Sequenzierung erhaltene Sequenz stammt von dem Actinomyceten T. fusca YX, einem sehr nahen Verwandten des T. fusca KW3. Da es aber auch bei rganismen der gleichen Spezies kleine Unterschiede in einer Proteinsequenz geben kann, wurde mit der isolierten TfCa eine MALDI-TF Analyse durchgeführt, um die genaue Proteinsequenz zu bestimmen. Das Ergebnis war eine 93,5% Übereinstimmung mit der bereits bekannten Sequenz und dem aufgereinigten Protein. Bis auf zwei Bruchstücke konnte die gesamte Enzymsequenz der TfCa identifiziert werden. Das bedeutet, dass es sich bei dem aufgereinigten Protein definitiv um eine Carboxylesterase handelt, welche mindestens zu 93,5% mit der Sequenz des Proteins Tfu_2427 aus T. fusca YX übereinstimmt. Für eine vollständige Sequenzidentifikation erfolgte parallel eine Sequenzierung des TfCa Gens mittels abgeleiteter Primer (eser et al. 2010). Bei dieser Sequenzierung konnte die gesamte Sequenz des TfCa Gens identifiziert werden und somit die gesamte Proteinsequenz abgeleitet werden. Beim Vergleich der Sequenz der TfCa mit der Tfu_2427 wurde festgestellt, dass die Proteine bis auf 2 Aminosäuren übereinstimmen. Diese beiden unterschiedlichen Aminosäuren wurden zuvor mit der MALDI TF/TF Analyse nicht identifiziert, da beide Unterschiede sich im gleichen Proteinfragment befanden und sich somit die Differenzen der Massen ausglichen. An Position 335 bei der TfCa steht anstelle eines Glycins ein Serin und an Position 340 steht ein Alanin anstelle eines Threonins (Abbildung 60). Somit ergibt sich eine 99,6% Übereinstimmung zwischen den beiden Carboxylesterasen.

141 Ergebnisse und Diskussion meivirtgsg dvrgskengi avfrgipyae ppvgahrfta prpprpwdgv rdatefsata 61 prppypeaig allierfipg ddyltlnvwt pdpnavglpv mvwihggaft ngsgsepvyd 121 gaafardgvv fvsfnyrlgi igfadlpdap snrglldqia alewvrdnia rfggdpgnvt 181 vfgesagams vctlmatpra rglfrrailq sgagnmavaa edattiaavi ahrlgvepta 241 aalahvpvaq lldvqqqvaq eiqgapdpav wgeriaggsv llpfapvidg ellsqrpaea 301 iaggaghdvd llfgtttdey rlflaptgll pfitsdyvta hlaksgldad aakaytaegr 361 geepgdilas iitdqvfrip alriaesrvd apartfgyef awrtpqldgi lgachavelp 421 fvfrtldraa slvgtnppee laetvhnawv rfatsgdpgw pawnpetrsv mrfdhpvsem 481 vtdpypatra lwdgvpl Abbildung 60: Proteinsequenz der TfCa aus T. fusca KW3, die Aminosäuren des aktiven Zentrums und das GXSXG Motiv sind gelb markiert, die identifizierten Unterschiede zu Tfu_2427 aus T. fusca YX sind rot markiert (Billig et al. 2010). Mit der Sequenz der Carboxylesterase TfCa wurde ein Alignment mit den vier ähnlichsten Enzymen aus einer Enzymdatenbank (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) protein database; erstellt. Es sind alles ebenfalls Hydrolasen mit ähnlichen Sequenzen. Die Enzyme stammen aus Arthrobacter FB24 (art), Streptomyces coelicolor (sco), Frankia alni (fal) und Saccharopolyspora erythraea (sen). Es ist ersichtlich, dass besonders um die Bereiche der Aminosäuren der katalytischen Triade die Enzyme viele Übereinstimmungen besitzen. In der nachfolgenden Abbildung ist das Alignment der 5 Hydrolasen dargestellt. Die grau unterlegten Sequenzen treten bei mindestens drei der fünf Enzyme auf. Die Aminosäuren der katalytischen Triade sind fett gedruckt.

142 Ergebnisse und Diskussion M tfu 1 M art 1 MRS GQT sco 1 MRPAASPVLSRLGQALAALVCLDAPVSFNPWHALVAVLWWSRRQGTVNGWRAFPVLRDDS fal 1 M sen EIVIRTGSGDVRGSKENGIAVFRGI tfu DTVVKTTHGQLRGSLADGVHCFLGI art NPVVRTVHGAVGGRYEHDVAVFRGI sco 61 AVRVRVRDRDRGRVRSVRVGGAMTTVGAVPASAGSRPGARVAGGALCGSRESGVAVFRGI fal DVIVRTGSGRVRGFSAGDVSVFKGI sen 27 PYAEPPVGAHRFTAPRPPRPWDGVRDATEFSATAPRPPYPEAIGALLIERFIPGD--DYL tfu 27 PFAASTAGVNRLRPPQPVQPWSGVRDAMKYGDSPFQLAPPESAGTEW-DTALAGE--DCL art 32 PYAAPPFGPGRFRPPLPPEPWDGVRDAGSFGPTAPKPPYSEAFARYLSDPAIPGD--DCL sco 121 PYAAPPVGGLRFAAPRPAASWDGVRSALSYGPPPPQ---SDVLGRGPSAEGTPGD--DWL fal 27 PYAAPLDGPARFQAPLPAPSWEGVRDSTAFSASVPQ---EAAPMPGQVSPWKPGDSTECL sen 85 TLNVWTPDPNAVG-LPVMVWIHGGAFTNGSGSEPVYDGAAFARD-GVVFVSFNYRLGIIG tfu 84 NLNVWTPDPGNGG-LPVMVWIQGGAFEIGSTAS--YNGRTFARD-GVICVVINWRVGADG art 90 NLNVWTPEPGPGARLPVLVWLHGGALTRGSSAVPVYDGSTFARD-GVVCVSVNYRLGVEG sco 176 TVNVWSPEPDPAAKLPVMVWIYGGAYAIGASSRPEYDGAHLARDGGVVVVTFDYRLGMEG fal 84 TVNVWSPDVGARG-LPVLVWIHGGMFMHGSSASPAYDGAALARE-GVVFVSLNYRVGYEG sen 143 FADLPDAPSNRGLLDQIAALEWVRDNIARFGGDPGNVTVFGESAGAMSVCTLMATPRARG tfu 140 FLDLGDGQANIGLLDQVAALEWVRGNIAAFGEDPANVTVFGQSAGAMSIGVLLSMPRAEG art 149 YGLFPDAPANAGLRDQIAALQWVRDNIAAFGGDPDRVTVAGQSAGAISTGALLAAPRARG sco 236 FAQITGAPPNRGLLDQVAALEWVRDNIAAFGGDPDEVTVFGESAGGGSVAALLAMPRAAG fal 142 FGWVADAPANRGLLDQIAALRWVRDNIAGFGGDPGNVTVAGQSAGGSSVVALVSSPAARG sen 203 LFRRAILQSGAGNMAVAAEDATTIAAVIAHRLGVEPTAAALAHVPVAQLLDVQQQVAQEI tfu 200 LFRRAILQSGAAHHVLPTETAQRIGGFLSEKLGVSPTREAMAAVPVQRFLAAQTELKADL art 209 LFRRAVLQSGAPE-AADRDKVRRMVRRMASRLKIPATAEAFAAADRDQLLRAQAEV---- sco 296 LFRRAIAQSVPGT-FLSPQLAADIAADCADELGLRPTVADLATVDPALLTVAADTVATDT fal 202 LLRRGIAQSVGGL-FVPEAEARAVAEMVTDQLGVSPTAAELGSLPSEAIHGAQSAPSAAM sen 263 QGA---PDPAVWGERIAGGSVLLPFAPVIDGELLSQRPAEAIAGG-AGHDVDLLFGTTTD tfu 260 AAR---PDPARWGPEVVASSML--WQPSVDGDVIPRRPIERIAAG-AGSTVDVMIGSNAE art GRFSSPVLGGPG---FGLVVDGDVLPRDPLEALVDGDAAPGVDLMMGWTRD sco 355 VAATMATRARRWGQAALRSIL---FAPVVDGEVLPATPWQALAAG-AGRDVDLLAGHTRD fal 261 TA-----DPSAWTNSHTP------YAPMFGDDVLERRPWEALRAG-AGREIDLIAGFTRD sen 319 EYRLFLAPTGLLPFITS DYVTAHLAKSGLDAD-AAKAYTAEGRGEEPGDILA tfu 314 DWKLFLAITGVIAKVTERDLAESRSVDGFPPIGVYGLPAETALREYRSHYPASSPGELLA art 312 EYRLWLVPGGLVERVDR-----LGAVALAGARARCHCGNE-VVRGYRAARPGAGTAEIVG sco 411 EQRLFTALTGLLGQVTP DQAATALQDFAPGRD-GARRYRDAYPDAGPEQLYE fal 309 ECRVFAAGLDLSG SDPVAVARGMRLAPE-ALPRYRAAHPGISDAGLHE sen 370 SIITDQVFRIPALRIAESRVD----APARTFGYEFAWRTPQLDGILGACHAVELPFVFRT tfu 374 AVETDWWVRIPALRLADAHAKALSTASARTYMYEFAWPAPGL----GAVHAMEVPFVFDT art 366 QLVTDHLLRIPMHRVADAR PGSSHVYEFAWPSNLPD--LGACHALELGFVFDS sco 462 LVHSDWLFRMPTLHLAQAQVA----GGGRVHLYELTWPAPGMGGALGACHGLDVPLVFGN fal 356 LMLTDSLFRMPTLWCAEGHAE----AGGKTYLYEFAWPAPVLDGAYGACHSIDVPFLFGV sen 426 LDRAAS----LVGTNPP---EELAETVHNAWVRFATSGDPGWPAWNPETRSVMRFDHPVS tfu 430 LDTSSRLFGPLLGTDPP---QELADAMHAAWISFASTGDPGWPGYDLERRATMLFNTG-A art 417 GDGPDA--RRLAGEGAP---QELADAMHGAWVRFAETGDPGWQAWDAA-HPVRVFGDGAP sco 518 LTSGQP--ALLIGDSPTPEATALSARMRSAWTTFATRSDPGWPAYDCDHRLTQIFDTS-P fal 412 LDDEIG--RPLLGDPAPAGFEVLSAQLRRAWTSFAASGDPGWPEFGTDWRLARSWNVP-L sen 479 EMVTDPYPATRALWD-GVPL tfu 486 GVVYDPRSWERDLWE-GVR art 471 HTAYGPLDPEYDLWKADVTVPRGTRPRRLVRR sco 575 VVTAYPEERSRLIWQ-DHSFP----PLLLHAP fal 469 EVVSDPAGESRRIWR-EHA sen Abbildung 61: Alignment der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (tfu), der Carboxylesterase Arth_3983 aus Arthrobacter FB24 (art), der Carboxylesterase SC6127 aus Streptomyces coelicolor (sco), der putativen Carboxylesterase FRAAL0556 aus Frankia alni (fal) und der putativen p-nitrobenzylesterase SACE_2933 aus Saccharopolyspora erythraea (sen) (Billig et al. 2010).

143 Ergebnisse und Diskussion Homologie-Modeling der TfCa und Vergleich der Struktur mit anderen Hydrolasen Mit der Proteinsequenz der TfCa wurde mit dem Programm PyML eine Modellierung der Proteinstruktur, unter der Nutzung der thermostabilen Carboxylesterase aus Geobacillus stearothermophilus (PDB Code 2GS resp. 2GT) als Template, vorgenommen (Abbildung 62, 63) (Liu et al. 2007, Bennett-Lovsey et al 2008). Das aktive Zentrum der Carboxylesterase mit der katalytischen Triade wurde blau gekennzeichnet. Abbildung 62: Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-helices gekennzeichnet und gelb die β-faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade (Billig et al. 2010). Abbildung 63: Ausschnitt aus der Tertiärstruktur der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3. Rot sind die α-helices gekennzeichnet und gelb die β-faltblattstrukturen. Die grünen Bereiche sind Sequenzen ohne eine spezielle Sekundärstruktur. Die drei blau gekennzeichneten Aminosäuren sind die katalytische Triade. Zum Vergleich wurden weitere PET-Hydrolasen modelliert. Die modellierte Struktur der Cutinasen Tfu_0882 aus T. fusca YX,basierend auf der Lipase von S. exfoliates (SeL), wurde mit dem SWISS- Model Homologie Modeling Web Server konstruiert (Abbildung 64d) und Tfu_0883, basierend auf der Lipase von S. exfoliates (SeL, PDB-ID: 1JFR), wurde mit PHYRE erstellt (Abbildung 64e) (Lykidis et al. 2007, Chen S et al 2008). Von den Sequenzen der Cutinasen von F. solani sp. pisi und P. mendocina aus der NCBI Protein Data Base und der Sequenz der Cutinase von H. insolens, modelliert mit dem Wurst Protein Threading Server, wurde mittels PyML ein Strukturbild erstellt (Abbildung 64c, f, b). Die katalytischen Aminosäure-Reste sind blau dargestellt.

144 Ergebnisse und Diskussion 127 Abbildung 64: Homologie-Modelle der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (a) verglichen mit verschiedenen PET- Cutinasen. Die Strukturen der Cutinasen aus H. insolens (b), F. solani sp. pisi (c), der Cutinasen Tfu_0882 (d) und Tfu_0883 (e) aus T. fusca KW3 und der Cutinase aus P. mendocina (f) sind dargestellt (Billig et al. 2010).

145 Ergebnisse und Diskussion Vergleich der TfCa mit bekannten PET-Hydrolasen Die TfCa unterscheidet sich deutlich von allen anderen bisher bekannten und bereits näher charakterisierten PET-Hydrolasen nicht nur durch Ihre höhere Größe, sondern auch durch die Tatsache, dass es sich um eine Carboxylesterase und nicht um eine Cutinase handelt. In der nachstehenden Tabelle sind die Eigenschaften der TfCa aus T. fusca KW3 verglichen mit den Cutinasen aus T. fusca DSM und einem weiteren T. fusca Isolat dargestellt (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008). Diese beiden Cutinasen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Produktion, die Erstere wurde als Wildtypenzym durch T. fusca DSM produziert, die Zweite hingegen rekombinant in E. coli. Molekulargewicht (ermittelt per Gelelektrophorese) Tabelle 30: Vergleich der Eigenschaften der TfCa mit Cutinasen aus T. fusca. TfCa aus T. fusca KW3 Cutinase aus T. fusca DSM (Kleeberg et al. 2005) 52,4 kda 27,4 kda 29 kda pi 4,8 6,43 n. b. ph Stabilität ph 5 11 n. b. n. b. Temperaturstabilität C n. b C Cutinase aus einem T. fusca Isolat (Chen S et al. 2008) ph ptimum ph 6 (CTR Hydrolyse) ph 6,5 7 (BTA Hydrolyse) ph 8 (Triolein, p-npb Hydrolyse) Temperatur ptimum 60 C (CTR Hydrolyse) C (BTA Hydrolyse) 60 C (Triolein, p-npb Hydrolyse) Inhibitoren PMSF TPCK n. b. PMSF Hydrolysierte Substrate p-nitrophenylacetat p-nitrophenylbutyrat p-nitrophenylcaprylat CTR Triglyceride Aliphatische Polyester Aliphatisch-aromatische Copolyester PET-Filme Cutin p-nitrophenylbutyrat Triolein Cutin Aminosäuren der katalytischen Triade n. b.: nicht bestimmt Ser185, Glu319, His415 G-E-S-A-G Motiv Ser132, Asp176, His210 G-H-S-M-G Motiv Ser132, Asp176, His210 G-H-S-M-G Motiv Die optimale Temperatur für die CTR Hydrolyse durch die TfCa lag bei 60 C und der optimale ph Wert bei 60 C war ph 6. Nach 24 Stunden Inkubation lagen die Restaktivitäten bei ph 5 bis 11 bei % und somit stabil in einem breiten ph Bereich. Bei einem Inkubationszeitraum von 7 Tagen bei ph 9

146 Ergebnisse und Diskussion 129 und 10 lag die Restaktivität bei 85%, bei den ph Werten 5 und 11 lag sie bei 22% und 16%. Bei erhöhten Temperaturen (40-50 C) war nach 7 Tagen Inkubation noch % Restaktivität nachweisbar. Mit 55 C konnte nach 24 Stunden Inkubation nur noch 1% Restaktivität detektiert werden. Bei der Ermittlung der Substratspezifität mit p-npestern zeigte sich, dass die TfCa Aktivität gegenüber kurz- und mittelkettigen Substraten (C 2 bis C 8 ) besaß, hingegen nicht gegenüber langkettigen (C 16 ) Substraten. Die Inhibitoren PMSF und TPCK reduzierten die hydrolytische Aktivität der TfCa, was bedeutet, dass ein Serin und ein Histidin Bestandteil der katalytischen Triade sind. Durch DTT und EDTA erfolgte keine Inhibition der Esterase, somit sind keine essentiellen Disulfidbrücken im Enzym enthalten und es benötigt auch keine Metallionen als Cofaktoren. Somit handelt es sich bei dem aufgereinigten Enzym um eine Serin Hydrolase, welche allerdings kein Cutin oder PCL hydrolysieren kann und somit nicht zur Gruppe der Cutinasen zählt, wie die meisten PET- Hydrolasen. Bei der Sequenzbestimmung der Esterase stellte sich heraus, dass es sich um eine Carboxylesterase mit 42% Übereinstimmung mit der Carboxylesterase Arth_3983 aus Arthrobacter FB24, 42% Übereinstimmung mit der Carboxylesterase SC6127 aus S. coelicolor, 43% Übereinstimmung mit der putativen Carboxylesterase FRAAL0556 aus F. alni und 42% Übereinstimmung mit der putativen p-nitrobenzylesterase SACE_2933 aus S. erythraea handelt. Das katalytische Zentrum der TfCa besteht aus Ser185, Glu319, His415, wobei das Serin in das für Hydrolasen typische G-E-S-A-G Motiv eingebettet ist. Durch eine Codon ptimierung, der Klonierung in den pet-20b(+) Vektor mit einer N-terminalen pelb Signalsequenz und einem C-terminalen His 6 -Tag und einer anschließenden Transformation in E. coli BL21(DE3) erfolgte die Erstellung eines rekombinanten Wirtes für die Überexpression der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (eser et al. 2010). Die rekombinant produzierte TfCa war in der Lage PET-Nanopartikel mit einer Rate von 7 nmol/ml freigesetzte TPA bei 24 Stunden Inkubation bei 50 C und 0,01 mg TfCa zu hydrolysieren. Bei der TfH Cutinase aus T. fusca DSM lag das Temperaturoptimum C über der maximalen Wachstumstemperatur des Mikroorganismus, was untypisch für extrazelluläre Enzyme ist, hingegen für Lipasen, Xylanasen oder PHB-Depolymerasen schon beschrieben wurde. Anscheinend gibt es laut Kleeberg et al. (2005) einen Überlagerungseffekt bezüglich der Enzymaktivität und dem zu hydrolysierenden Substrat. Mit höher molekularen Substraten, wie BTA, welches erst bei höheren Temperaturen aufgrund der höheren Beweglichkeit der Polymerketten besser abbaubar ist, konnte ein höheres Temperaturmaximum bestimmt werden als mit niedermolekularen Substraten, wie Ölen oder Fetten. Der schnelle Verlust an Aktivität bei 70 C ist auf die Denaturierung der Hydrolase zurückzuführen. Das aufgereinigte Enzym verlor nach 30 min bei 70 C 85% seiner Aktivität, wohingegen die Hydrolase in der Enzymrohlösung 60% Restaktivität nach

147 Ergebnisse und Diskussion 130 einer Woche Lagerung bei Raumtemperatur aufwies und bei 70 C nach einer Stunde fast die gesamte hydrolytische Aktivität verloren ging. Das ph Maximum lag bei ph 6-6,5, verlagerte sich aber bei geringeren Ionenstärken in Richtung der neutralen ph Werte. Die BTA Hydrolase spaltete Triacetin, Tributyrin und Tricaproin mit einer ähnlichen Aktivität, hingegen mit den längerkettigen Substraten Tricaprylin, Tricaprin, Trilaurin und Triolein sank die hydrolytische Aktivität mit zunehmender Kettenlänge. Des Weiteren konnte die TfH auch eine Vielzahl an Polyestern (PCL, Poly(trimethylenbrassylat) (SP3/13), Bionolle, Polyesteramid Bayer TIR 1874) hydrolysieren, jedoch nicht das natürliche Polymer Poly(3-hydroxybutyrat) (PHB). Das Enzym besteht aus 261 Aminosäuren und wurde als Serin Hydrolase klassifiziert, welche Esterasen, Lipasen und Cutinasen beinhaltet. Sie besaß eine 65% Ähnlichkeit zu einer Triacylglycerin Lipase aus Streptomyces albus G26 und eine 62% Ähnlichkeit zu einer Triacylglycerin Acylhydrolase aus Streptomyces sp. M1127. Das Serin des katalytischen Zentrums war in dem hochkonservierten Motiv G-H-S-M-G, an der Position 132 im Enzym, eingebettet. Der Anteil an hydrophoben Aminosäuren (Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp) war mit 42% hoch im Vergleich zu anderen Serin Hydrolasen, worauf die Probleme bei der Aufreinigung zurück zu führen waren. bwohl die TfH aufgrund der Sequenzübereinstimmungen und der Substratspezifität zu den Lipasen eingeordnet werden könnten, zeigten sie aber auch deutliche Unterschiede im Vergleich zur Pseudomonas sp. Lipase (PsL) und Aspergillus oryzae Lipase (AoL) bei der Film und Nanopartikel Hydrolyse. Die Lipasen hydrolysierten nur 40% der Esterbindungen, da sie nur die berfläche des unlöslichen Substrates angreifen. Auch bei weiterer Enzymzugabe gab es keine weitere Hydrolyse, was bedeutete, dass das Enzym nicht inaktiviert war. Die Hydrolyse stoppte, als das Substrat komplett in wasserlösliche Zwischenprodukte umgesetzt war und somit die Lipasen keine hydrophoben berflächen für ihre Konformationsänderung zur Verfügung hatten. Somit wurden die verbleibenden Esterbindungen der Intermediate nicht hydrolysiert. Die TfH hingegen hydrolysierte 100% der Esterbindungen des Polymerfilms und der Nanopartikeln und zeigte somit keine Grenzflächenaktivierung. Aufgrund der hydrolytischen Aktivität der TfH gegenüber Apfelcutin und PCL konnte sie zur Gruppe der Cutinasen gezählt werden (Gouda et al. 2002, Kleeberg et al. 2005). Die TfH wurde durch Dresler et al rekombinant in E. coli TG1 mit dem Plasmid pcytexp1- mpa-bta1-his6 produziert, sekretiert und aufgrereinigt. Dabei erfolgte allerdings keine weitere Charakterisierung der Cutinase (Dresler et al. 2006). Nach einer Codon ptimierung wurde das tfh Gen in einen offenen Leserahmen mit der DNA Sequenz für das N-terminale Signalpeptid der Bacillus megaterium Lipase A und einem C-terminalen His 6 -Tag kloniert und unter einem Xylose induzierbaren Promotor rekombinant in Bacillus megaterium WH323 produziert. Auch hier erfolgte keine weitere Charakterisierung der rekombinanten Hydrolase (Yang et al. 2007).

148 Ergebnisse und Diskussion 131 Die BTA-Hydrolase aus Thermobifida sp. BCC23166, isoliert aus Proben einer Deponie, wurde durch Transkonjugation in den Produktionsstamm Streptomyces rimosus R7 mit pij-bta verfügbar (Sinsereekul et al. 2010). Diese aufgereinigte Hydrolase zeigte einen optimalen Temperaturbereich von C und einen optimalen ph im milden bis basischen Bereich, bestimmt mittels p-npp als Substrat. Die rtfh besaß die höchste Aktivität mit kurzkettigen p-nitrophenylestern, aber auch mit lankettigen Substraten konnten hydrolytische Aktivitäten nachgewiesen werden, was mit den bereits referierten Aktivitäten übereinstimmt (Kleeberg et al. 2005). Unter Anwendung der berflächenplasmonresonanztechnik zur Untersuchung der Hydrolyse von Polyestern zeigte sich, dass die rtfh eine unterschiedliche Bevorzugung von aliphatischen und aliphatisch-aromatischen Polyestern besitzt und zwar in der Reihenfolge PCL>Ecoflex >PHB. Diese Unterschiede kommen laut Sinsereekul et al. (2010) aufgrund unterschiedlicher Bindungseigenschaften der Polyester an das Enzym und aufgrund verschiedener physikalischer Eigenschaften (Kristallinität) zustande. Aufgrund unterschiedlicher Filmherstellung und Analysetechniken war in diesem Fall auch ein Abbau von PHB durch die rtfh nachweisbar. Im Vergleich zur Lipase aus T. lanuginosus zeigte die Hydrolase höhere Spezifität und Abbauraten gegenüber aliphatisch-aromatischen Copolyestern, analog zu den Studien von Eberl et al. (2008) (Sinsereekul et al. 2010). Die 29 kda Cutinase aus T. fusca WSH03-11 (Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008) zeigte deutliche Übereinstimmungen mit 2 Enzymen, Tfu_0883 und Tfu_0882, identifiziert im T. fusca YX (Lykidis et al. 2007). Die Enzyme wurden als Triacylglycerin Lipasen in der genomischen Datenbank bezeichnet, enthalten eine hochkonservierte Sequenz (GXSXG) und gehören der α/β Hydrolase Familie an. Für eine weitere Charakterisierung erfolgte die rekombinante Expression der beiden Gene in E. coli BL21 Rossetta (DE3) PlysS mit dem Vektor pet-20b(+) mit einem C-terminalen His 6 -Tag und dem PelB Signalpeptid. Die Cutinasen 1 und 2 hydrolysierten Triolein und p-npb bei einer optimalen Temperatur von 60 C und einem optimalen ph von 8. Bei den Thermostabilitätsuntersuchungen zeigten die beiden Hydrolasen Restaktivitäten von 80% nach 160 Stunden bei 40 C und 50% nach 40 Stunden bei 60 C. Die beiden Isoenzyme waren auch in der Lage, Cutin zu hydrolysieren, womit sie der Gruppe der Cutinasen zuzuordnen sind. Durch den Inhibitor PMSF, der an das aktive Serin der katalytischen Triade bindet, erfolgte eine Verminderung der katalytischen Aktivität der Cutinasen. Zusätzliche Mutationstudien bestätigten, dass die beiden Cutinasen Serin Hydrolasen sind, da beim Austausch des Serins an der Posititon 188 (Cutinase 1) und 170 (Cutinase 2) keine katalytische Aktivität mehr zu verzeichnen war (Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008). Die molaren Massen der Isoenzyme, bestimmt mit der SDS-PAGE, waren 29 kda, die berechneten Werte lagen bei 29,220 kda (Cutinase 1) und 28,997 kda (Cutinase 2). Das native Molekulargewicht lag bei 32 kda, bestimmt per Größenausschlusschromatographie, und bestätigte, dass die Cutinasen in Lösung monomere Enzyme sind. Bei der Studie der Substratspezifität der Cutinasen zeigten beide

149 Ergebnisse und Diskussion 132 eine höhere Aktivität mit kurzkettigen p-npestern, hydrolysieren aber auch langkettige Ester (C 16 - C 18 ). Dabei zeichnete sich Cutinase 2 durch eine höhere Hydrolyserate gegenüber Cutinase 1 aus, was allerdings bei der Hydrolyse von Triolein nicht bestätigt wurde. Somit zeigten sich der 7%- Sequenzunterschied auch in der hydrolytischen Aktivität der Isoenzyme. Diese Beobachtungen bestätigten sich auch bei der Untersuchung der CTR-Hydrolyse, bei der die Cutinase 2 deutlich mehr zyklische Trimere hydrolysierte. Das lässt die Annahme zu, dass die Sequenzunterschiede im Bereich des aktiven Zentrums oder dessen Umgebung die katalytischen Aktivitäten beeinflussen. Beide Cutinasen zeigten keine Grenzflächenaktivierung und besitzen keinen Deckel. Ebenfalls benötigen sie keine Metallionen als Cofaktoren für ihre hydrolytische Aktivität, nachgewiesen mit dem Inhibitor EDTA. Bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener Lösungsvermittler wurde festgestellt, dass Triton X-100, Tween 20 und TDC (in Konzentrationen von 1 mm und 10 mm) keine Aktivitätsänderungen zur Folge hatten, SDS hingegen inhibierte die Cutinasen. In den organischen Lösungsmitteln Methanol, Ethanol, Aceton, n-hexan und Dimethylsulfoxid (DMS) sind die Isoenzyme stabil, weniger hingegen in Isopropanol und Butanol, was eine breite Anwendung in der organischen Synthese eröffnet (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008). Bei der Suche nach Polymer-abbauenden Isolaten wurde eine thermostabile Hydrolase aus Thermobifida alba AHK119 identifiziert, deren Gensequenz mit spezifischen Primern kompatibel zur G-X-S-X-G Consensussequenz (903 bp) amplifiziert wurde (Hu et al. 2010). Die Aminosäuresequenz bestehend aus 300 AS wurde Est119 benannt und gehört zur Familie der Serin Hydrolasen. Est119 besaß 84% Übereinstimmung mit der Triacylglycerin Lipase (TfH) aus T. fusca DSM (Kleeberg et al. 2005), 63% Übereinstimmung mit der Lipase aus S. coelicolor A3(2) M145 (Valdez et al. 1999), 62% Übereinstimmung mit der Lipase aus S. albus G (Cruz et al. 1994) und 61% Übereinstimmung mit der Lipase aus S. exfoliatus M11 (Wei et al. 1988). Die hoch konservierte Sequenz mit dem aktiven Serin wurde mit G-H-S-M-G in der Hydrolase identifiziert, die katalytischen Aminosäuren sind Ser129, His207 und Asp175. Eine N-terminale Signalsequenz von 34 Aminosäuren konnte ebenfalls identifiziert werden, welche zwischen den Aminosäuren 34 und 35 posttranslational abgeschnitten wird. Somit besaß das aktive verbleibende Enzym 266 Aminosäuren, eine Größe von 30 kda (rechnerisch 29,76 kda) und lag in Suspension als monomeres Enzym vor. Die optimale Temperatur für die Hydrolyse von p-npb lag bei 50 C und der optimale ph Wert bei 6. Bei 50 C und ph 6 erfolgte die Untersuchung der Substratspezifität der Hydrolase mit p-np Estern. Mit der steigenden Kettenlänge von C 2 -C 6 stieg auch die Hydrolyserate an, fiel aber ab C 8 stark ab. Aufgrund der Sequenzübereinstimmungen der Est119 mit der Lipase aus S. exfoliatus M11 ordneten Hu et al. (2010) sie ebenfalls in die Gruppe III der lipolytischen Enzyme ein.

150 Ergebnisse und Diskussion 133 Tabelle 31: Vergleich der PET-Hydrolasen aus F. solani FsC (Carvalho et al. 1998, Carvalho et al. 1999, Ronkvist et al. 2009), T. insolens HiC (Sandal et al. 1996, Ronkvist et al. 2009), P. mendocina PmC (Bott et al. 2003, Ronkvist et al. 2009), T. fusca TfH/Cutinase 2 (Kleeberg et al. 2005, Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008) und TfCa (Zimmermann und Billig 2011). FsC HiC PmC TfH/Cutinase 1 TfCa Anzahl der Aminosäuren Molekulargewicht 22 kda kda 30 kda 28 kda 52,4 kda Isoelektrischer 7,2 8 n. b. 6,43 4,8 Punkt ph ptimum 6,5-8,5 8,5-9,5 9,0-9,5 6,5-8,0 6,0 Temperatur ptimum 50 C C 50 C C 60 C Katalytische Triade Ser120 Asp175 His188 Ser140 Asp195 His208 Ser126 Asp176 His206 Ser132 Asp176 His210 Ser185 Glu319 His415 GXSXG Motiv G-Y-S-Q-G G-Y-S-Q-G G-H-S-Q-G G-H-S-M-G G-E-S-A-G Gruppierung Fungale Cutinase Fungale Cutinase Bakterielle Cutinase Bakterielle Cutinase Bakterielle Carboxylesterase n. b.: nicht bestimmt Die Cutinase aus P. mendocina hydrolysierte p-npb am Besten, hingegen aber keine Triglyceride, was bedeutete, dass das Enzym mit Cutinaseaktivität keine unspezifische Lipase ist. Die Cutinase zeigte ein breites ph ptimum zwischen 8,0 und 10,5 mit Apfelcutin als Substrat. Diisopropylfluorophosphat (DFP, phosphoryliert Serin) inhibierte das Enzym, was bedeutet, dass ein aktives Serin bei der katalytischen Hydrolyse beteiligt ist. Die Cutinase war stabil bei 60 C für 1 Stunde und behielt 85% ihrer Aktivität nach 1 Stunde bei 70 C (Sebastian et al. 1987). Das Molekulargewicht des Proteinmonomers betrug 30 kda bestimmt mit SDS-PAGE und Größenausschlusschromatographie. Mit steigender Kettenlänge sank die hydrolytische Aktivität der Cutinase gegenüber p-np Estern. Das Enzym wurde nicht durch Thiol-nachweisende Agenzien inhibiert, womit keine katalytisch aktive -SH Gruppe vorhanden ist, ebenso benötigt die Cutinase keine Metallionen als Cofaktoren, nachgewiesen mit EDTA (Sebastian et al. 1988). Nach der Identifikation des PmC-Gens und dessen rekombinanter Expression in E. coli erfolgten spezifische und unspezifische Mutagenesen zu Steigerung der Thermostabilität und der spezifischen Aktivität der Cutinase (Boston et al. 1997, Bott et al. 2003). Bei der Hydrolyse von PET-Filmen zeigte die modifizierte PmC die maximale Aktivität bei 50 C und ph 9,5 und somit eine gute Stabilität im alkalischen Bereich (Ronkvist et al 2009). Die mit P. menocina ATCC gewonnene Rohenzymlösung wurde zunächst auf ihre hydrolytischen Eigenschaften mittels p-np Ester getestet (Tabelle 32). Nach der Aufreinigung und der damit verbundenen Identifikation der beiden Hydrolasen Lipase 1 und 2 mit cutinolytischen Aktivitäten, erfolgte die Bestimmung der hydrolytischen Verhältnisse von p-npb/p-npc. Lipase 1

151 Ergebnisse und Diskussion 134 zeigte ein Verhältnis von 4,6 und Lipase 2 1,4. Beide Enzyme besaßen ein Molekulargewicht von 30 kda (Gray et al. 1995). Die Enzympräparation der Fusarium solani Cutinasen hydrolysierte ebenfalls verschiedene Modellestersubstrate, allerdings nicht Triglyceride und enthielt somit keine unspezifische Lipase. Bei der Hydrolyse von p-nitrophenylpalmitat zeigte die Präparation ein deutliches ph ptimum bei 8,5 und mit Triton X-100 erfolgte eine Steigerung der hydrolytischen Aktivität (maximale Aktivität wurde mit 3,7 mg/ml des Detergenz erreicht). Mit p-nitrophenylester von C 2 -C 18 ergaben sich vergleichbare Werte für K m und V max, was auf keine vorhandene Spezifität schließen lässt. DFP inhibierte die Enzympräparation, hingegen Jodacetamid und p-chlormercuribenzoesäure (reagieren beide mit SH- Gruppen, Cystein) hatten keinen Einfluss auf die Enzymaktivität, was bedeutet, dass es sich bei den Fusarium Depolymerasen um Serin Hydrolasen handelt (Purdy und Kolattukudy 1973). Das Molekulargewicht der Cutinase-Isoenzyme lag bei 22 kda und das der Esterase bei 52 kda (Purdy und Kolattukudy 1975a). Die Cutinasen zeigten unter dem ph-wert 7 geringe Aktivität, oberhalb von 7 stieg die Aktivität an bis ph 10. berhalb von ph 10 fiel die Hydrolyserate wieder ab. Die beiden Cutinasen zeigten eine sinkende Hydrolyserate mit steigender Kettenlänge der Acylketten der p-np Esterer. Nur die berechneten Hydrolysegeschwindigkeiten V für p-nitrophenyl-acetat und Butyrat waren für beide Cutinasen ähnlich, im weiteren Verlauf der Hydrolyse mit längeren p- NPEstern zeigte die Cutinase I deutlich höhere Werte als die Cutinase II. Somit unterschieden sich die beiden Cutinasen in ihren Fähigkeiten bei der Hydrolyse von löslichen Substraten, hingegen nicht bei der Hydrolyse von Cutin. Die unspezifische Esterase hingegen zeigte mit den p-np Estern deutlich höhere Hydrolyseraten als die beiden Cutinasen und mit steigender Kettenlänge fiel die Hydrolyseaktivität der Esterase nicht so stark ab wie bei den Cutinasen. Somit sind die Cutinasen spezifischer für kurzkettige Ester im Gegensatz zur Esterase mit einem breiteren Hydrolysespektrum. Bei den Studien zur Identifikation der Aminosäuren am aktiven Zentrum zeigte sich, dass die beiden Cutinasen durch Dip-F, Paraoxon und Parathion inhibiert wurden, jedoch nicht durch N- Ethylmaleimid, Jodoacetamid und p-chloromercuribenzoat (Purdy und Kolattukudy 1975b). Somit konnte nachgewiesen werden, dass die Cutinasen Serin Hydrolasen sind, jedoch keine Sulfhydryl- Hydrolasen, wobei auch hier die Cutinase I stärker inhibiert wurde als die Cutinase II. Die unspezifische Esterase wurde ebenfalls durch Dip-F und Paraoxon inhibiert, wobei Paraoxon das Enzym stärker inhibierte. Bei den Cutinasen war es genau umgekehrt. Somit ist die unspezifische Esterase ebenfalls eine Serin Hydrolase. Bei weiteren Untersuchungen stellte sich heraus, dass die beiden Cutinasen nur ein aktives Serin besitzen. Eine genauere Studie zum Hydrolysemechanismus der Cutinasen und der unspezifischen Esterase beim Cutinabbau sollte klären, ob diese Enzyme eventuell parallel als Endo- und Exoenzyme agieren. Zunächst zeigte sich, dass die beiden Cutinasen keine Unterschiede in ihren Spezifitäten und Art der Hydrolyse besaßen. Die Esterase hydrolysierte

152 Ergebnisse und Diskussion 135 kein Cutin und nur geringe Mengen an ligomer im Vergleich zu den Cutinasen. Das bedeutet, dass die Esterase für den Cutinabbau nicht essentiell ist und somit eine noch unbekannte Funktion besitzt. Eventuell ist sie beteiligt an der Hydrolyse von cutikulären Wachsestern und wird deshalb mit den Cutinasen coinduziert (Purdy und Kolattukudy 1975b). Die 3-dimensionale Struktur einer Cutinase aus F. solani sp. pisi wurde nach der Klonierung und Expression in E. coli mit einer Auflösung von 1,6 Å und 1,0 Å untersucht. Die Cutinase besteht aus 197 Aminosäuren und ist ein kompaktes Monomer von einer Größe von 45x30x30 Å. Der isoelekrische Punkt lag bei 7,8. Das aktive Serin 120 ist in die Konsensus Sequenz Gly-Tyr-Ser-Gln-Gly eingebettet und die beiden weiteren aktiven Aminosäuren sind Asp175 und His188. Das aktive Zentrum ist sehr gut zugänglich auf der berfläche des ellipsoiden Proteins und ist umgeben von den Aminosäureschleifen und , welche sehr hydrophob sind (Carvalho et al. 1998). Die Cutinase besaß vier nichtvariable Cysteine, welche zwei Disulfidbrücken ausbilden und somit eine wichtige Rolle bei der Strukturbildung besitzen. Das aktive Zentrum zeichnete sich durch eine hohe Flexibilität aus, was die Anpassung an verschiedene Substrate ermöglicht. Trotz dass die Cutinasen lipolytische Aktivitäten besaßen, unterscheiden sie sich von den klassischen Lipasen aufgrund der fehlenden Grenzflächenaktivierung. Bei der Cutinase besitzen die das aktive Zentrum umgebende Proteinschleifen und hydrophobe Aminosäuren (Leu81, Gly82, Ala85, Leu86, Pro87, Leu182, Ileu183 und Val184) welche die Interaktion zwischen Substrat und Bindungstasche fördern. Abgesehen von zwei Seitenkettenbindungen von Aminosäuren, Leu81 und Val184 bzw. Leu182 und Asn84, ist das katalytische Serin nicht verdeckt durch Proteinschlaufen, sondern frei zugänglich für Lösungsmittel und Substrat. Somit ist keine Grenzflächenaktivierung nötig für die Ausbildung der lipolytischen Aktivität, lediglich eine Neuorientierung einiger lipophiler Seitenketten, z.b. Leu81 und Leu182, was als ein Mini-Deckel bezeichnet werden kann, erfolgt vor der Hydrolyse. Mit Hilfe der zeitbezogenen Fluoreszenz Analytik konnte die Bildung von Enzym-Lipid Ansammlungen nachgewiesen werden, was bedeutet, dass sich die Cutinasen eher wie Lipasen ohne Deckel als wie Esterasen verhalten (Carvalho et al. 1999) Eine rekombinant produzierte F. solani pisi Cutinase zeigte eine optimale Temperatur von 30 C für die Triolein Hydrolyse und 40 C für die Hydrolyse von p-npb, wobei der optimale ph für beide bei 8 lag. Die Thermostabilität betrug mit 50% Restaktivität 85 Stunden bei 40 C bzw. 5 min bei 60 C (Chen S et al. 2008). Bei der Hydrolyse von PET-Filmen zeigte die rekombinante FsC bei 50 C ihre maximale Aktivität von 1,8 µmol/ml/h. Bei 60 C hingegen verlor sie ihre gesamte Aktivität. Der Einfluss des ph- Wertes auf die PET Hydrolyse bei 50 C wurde ebenfalls untersucht und zeigte, dass die FsC Aktivität sich im Bereich von ph 6,5 bis 8,5 nur gering ändert (1,9-1,6 µmol/ml/h), allerdings bei ph 9 auf 0,2 µmol/ml/h absank. Sie besaß somit eine geringe Stabilität im alkalischen Bereich. Die maximal erreichte Abbaurate lag bei 0,9 µmol/ml/h für die FsC bei 40 C (Ronkvist et al 2009).

153 Ergebnisse und Diskussion 136 Die aufgereinigte Humicola (Thermomyces) insolens Cutinase HiC zeigte ein Molekulargewicht von kda und einen pi von 8. Das hydrolytische Enzym wurde durch PMSF inhibiert, somit ist ein Serin Bestandteil des aktiven Zentrums. Das ph ptimum für die Hydrolyse von Tributyrat wurde mittels ph-stat bestimmt und lag bei 8. Die Cutinase zeigte aber auch bei ph 9 und 10 noch hohe Aktivitäten (Sandal et al. 1996). Nachdem verschiedene Substitutionen an dieser Cutinase durch molekularbiologische Methoden erfolgten, wurden von der rekombinant produzierten Hydrolase weitere Eigenschaften bestimmt. Bei einem ph Wert von 8 stieg die Hydrolyserate eines PET-Films mit steigender Temperatur von 30 bis 80 C um das 30fache auf 10,6 µmol/ml/h. Bei 90 C sank die Aktivität steil ab auf Null, wahrscheinlich aufgrund von Denaturierung. Weitere Temperatur-abhängige Filmhydrolyse-Studien zeigten, dass ein drastischer Anstieg der Hydrolyseaktivität oberhalb von 65 C erfolgte, da diese Temperaturen nahe der Glasübergangstemperatur des PETs lag (75 C). Die maximale initiale Aktivität der HiC lag bei 13,6 µmol/ml/h bei 80 C und ph 8,5. Die maximale Hydrolyserate bei 70 C lag bei 6,1 µmol/ml/h (Ronkvist et al. 2009). Beim Vergleich dieser fünf verschiedenen PET-Hydrolasen wird zunächst deutlich, dass sie aufgrund der Herkunft, Größe und Klasse in drei verschiedene Gruppen eingeteilt werden können, was in Tabelle 30 auch schon erfolgt ist. Allerdings gibt es auch deutliche Unterschiede zwischen den Enzymen, z.b. die optimalen Temperaturen und ph Werte oder die Fähigkeit zur Hydrolyse von Triglyceriden (FsC und PmC hydrolysieren keine TAGs, HiC und TfH hydrolysieren TAGs). Da diese Eigenschaften aber aufgrund von enzymatischen Assays bestimmt wurden, sind eine Vielzahl von möglichen Einflüssen (z.b. verwendetes Substrat, Analytik, Puffer, Enzymmenge u.ä.) vorhanden, welche zur Verschiebung der Ergebnisse beitragen können. Somit würde eine genauere Untersuchung der Enzyme unter gleichen katalytischen Bedingungen mehr Klarheit über ihre Einordnung bringen. Interessanterweise zeigten sich zwischen dem Pilz F. solani f. pisi und dem Bakterium T. fusca einige Parallelen in Bezug auf die Enzymproduktion. Beide bilden zwei Cutinase- Isoenzyme, welche sich hinsichtlich spezifischer Hydrolyseeigenschaften unterscheiden. Bei beiden rganismen besitzen die Isoenzyme die gleiche Anzahl an Aminosäuren, unterscheiden sich allerdings hinsichtlich der Sequenz im geringen Maße (T. fusca 7%, bei F. solani keine Angabe). Von deutlich höherem Interesse für die vorliegende Studie war allerdings, dass der Pilz ebenfalls eine Esterase von 52 kda produzierte. Da zum damaligen Zeitpunkt, als die Studien zu diesen eukaryotischen Enzymen erfolgten, die beiden Cutinasen von deutlich höherem Interesse waren, erfolgten keine weiterführenden Untersuchungen, wie z.b. eine Sequenzierung der Esterase. Die F. solani f. pisi Esterase unterscheidet sich von der TfCa dadurch, dass diese p-npb und p-npp hydrolysiert, die TfCa hingegen nicht (Purdy und Kolattukudy 1975b, Billig et al. 2010).

154 Ergebnisse und Diskussion 137 Tabelle 32: Kinetische Parameter K m und V max bestimmt für verschiedene p-np Ester für die Hydrolasen TfCa, TfH 1/2 (Chen et al. 2010), PmC a (Sebastian et al. 1988), PmC b (Gray et al. 1995), FsC (Purdy und Kolattukudy 1973), FsC 1, FsC 2 und FsE (Purdy und Kolattukudy 1975b). Die geringsten K m Werte je Enzym sind hervorgehoben, ebenso die höchsten V max Werte. p- TfCa TfH 1/2 PmC a PmC b FsC FsC 1 FsC 2 FsE NPEster K m 1 V max 3 K m 1 K m 1 V max 2 K m 1 V max 3 K m 1 V max 3 K m 1 V max 3 K m 1 V max 3 C 2 0, , ,0 1,5 97 2,3 K m 1 V max 3 C 4 0, ,67/0,51 2,7 77 3,5 1,0 7,5 1,2 5,2 2,0 C 6 2,1 18 1, ,9 0,46 8,6 0,2 1,7 0,89 C 8 0, ,6 35 0, , ,8 0,17 5,9 0,06 2,2 0,66 C 10 39,8 16 1, ,8 0,04 3,6 0,01 1,4 0,4 C 12 35,5 14 0, , ,6 0,01 4,5 0,002 2,1 0,52 C 14 22,7 8 1, ,3 0,36 C 16 45,4 9 0, ,0 0,31 C 18 2, ,0 0,29 1 M x µmol/min/ml 3 nmol/min/mg Für eine bessere Übersicht über die katalytischen Eigenschaften der PET hydrolysierenden Enzyme und der Esterase aus F. solani f. pisi (FsE) erfolgte die Gegenüberstellung ihrer kinetischen Parameter bei der p-np Ester Hydrolyse in Tabelle 32. Es ist ersichtlich, dass die höchste Reaktionsgeschwindigkeit die P. mendocina Cutinase mit p-np- Caprylat aufwies (Gray et al. 1995). Desweiteren zeigten die TfCa und die Cutinase von F. solani (Purdy und Kolattukudy 1973) ähnliche maximale Geschwindigkeiten gegenüber p-np-butyrat bzw. p- NP-Caproat. Die niedrigsten Geschwindigkeiten wurden mit den drei hydrolytischen Enzymen aus F. solani durch Purdy und Kolattukudy (1975b) bestimmt. Die beiden Cutinasen zeigten ihre maximalen Geschwindigkeiten mit p-np-acetat als Substrat und die unspezifische Esterase mit p-np- Butyrat, analog zur TfCa, aber 4000fach geringer. Die geringsten K m Werte je Enzym sind hervorgehoben, ebenso die höchsten V max Werte. Die geringsten K m Werte zeigten die TfCa mit p-np- Butyrat und die Pseudomonas mendocina Cutinase mit p-np-laurat. Dabei wird deutlich, dass die PET-Hydrolasen ihre höchste Affinität gegenüber kurz- und mittelkettigen Estern (C 4 -C 10 ) besitzen, die FsE hingegen im langkettigen Bereich. Des Weiteren ist ersichtlich, dass die TfCa die höchste Affinität gegenüber den p-np Estern besaß. Da es aber keinen direkten Zusammenhang zwischen der Hydrolyse von p-np Estern und PET gibt, ist die Tabelle 32 nicht aussagekräftig beim Vergleich der PET-Hydrolasen in Bezug auf die PET- Hydrolyse. Um die kinetischen Daten für die PET-Hydrolyse, auch verschiedener Substrattypen, vergleichen zu können, müssten die Enzyme unter gleichen Bedingungen bzw. optimalen Hydrolysetemperaturen und ph-werten eingesetzt werden. Für die FsC, PmC und HiC erfolgte das

155 Ergebnisse und Diskussion 138 bereits durch Ronkvist et al. (2009), mit der TfCa und den beiden Cutinasen aus T. fusca KW3 wurden verschiedene Hydrolysestudien durchgeführt, welche im nächsten Kapitel zusammengefasst sind. 3.3 Hydrolyse von PET Substraten durch prokaryotische und eukaryotische Hydrolasen Es erfolgte die Untersuchung der Hydrolyse von zyklischen PET-Trimeren, unbehandelten PET-Fasern und einer APET-Folie durch die PET-Hydrolasen aus T. fusca KW3 und weiteren PET-Hydrolasen. Bei den Enzymen handelte es sich um die rekombinant produzierten Cutinasen 1 und 2 aus T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008), die Cutinasen aus F. solani sp. pisi (Chen et al. 2010, Vertommen et al. 2005) und eine Cutinasepräparation von Novozymes (NS-29061, LN05012). Bis zu diesem Zeitpunkt wurden die meisten Hydrolysestudien mit der Cutinase aus F. solani sp. pisi durchgeführt, welche deshalb bei den folgenden Untersuchungen als Vergleich eingesetzt wurde. Zur Abschätzung der Reinheit der Enzympräparationen wurden Aliquote auf ein SDS Gel aufgetrennt. St St St St kda 135 kda 95 kda 72 kda 52 kda 42 kda 34 kda 250 kda 130 kda 95 kda 72 kda 55 kda 36 kda 26 kda 28 kda 17 kda 10 kda 17 kda 11 kda Abbildung 65: SDS-PAGE der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen, linkes Gel mit Aktivitätsfärbung, rechtes Gel Aktivitäts- und Coomassie-Färbung. Spur 1: Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3; Spur 2: rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 3: rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); Spur 4: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (Chen et al. 2010); Spur 5: Cutinase aus Fusarium solani sp. pisi (Vertommen et al. 2005); Spur 6: Cutinase von Novozymes. Zum Vergleich die Kulturüberstände verschiedener MSV-Medien, Spur 7: Cutin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; Spur 8: Suberin-induzierte Hydrolase aus T. fusca KW3; St 1 : Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas); St 2 : PageRuler TM Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas). Die Hydrolasen aus T. fusca (Billig et al. 2010, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008) (Spuren 1-3) sind aufgrund der Aktivitätsfärbung eindeutig im Gel identifizierbar und die Enzympräparationen zeichnen sich durch eine hohe Reinheit aus. Die rekombinante Cutinase von F. solani pisi (Chen et al 2010) (Spur 4) zeigte keine Aktivität und auch keine Proteinbande auf dem Gel. Wahrscheinlich wurde zu wenig Protein aufgetragen bzw. die Cutinase war nicht aktiv gegenüber dem Substrat der Aktivitätsfärbung. Die Cutinase aus F. solani sp. pisi (Vertommen et al. 2005) zeigte ebenfalls keine Aktivität, aber eine Proteinbande (Spur 5), was ebenfalls auf ein Inaktivität des Cutinase gegenüber

156 Ergebnisse und Diskussion Naphthylacetat hinweist. Beide Enzyme wiesen aber deutliche Aktivitäten mit p-npb auf. Die Cutinasepräparation von Novozymes wies eine deutliche Esteraseaktivität im Gel auf (Spur 6). Aufgrund der detektierten Größe im Gel (ca. 20 kda) handelt es sich vermutlich um eine Cutinase aus T. insolens oder F. solani pisi. Zum Vergleich wurden ebenfalls die zellfreien Überstände aus Kulturen mit Cutin-MSV und Suberin-MSV in Spur 7 und 8 aufgetragen, welche eine Esterase im Bereich von 28 kda aufweisen, aber ebenfalls noch weitere Proteine. Nach Auftrag der verschiedenen Enzympräparationen auf PCL Agarplatten wurde die bereits erfolgte Einordung der PET-Hydrolasen in Cutinasen und Carboxylesterase bestätigt. Die Cutinasen waren in der Lage, das Biopolymer Cutin abzubauen und ebenfalls PCL, wohingegen die Carboxylesterase diese beiden Polymere nicht hydrolysierte. Alle Cutinasen zeigten eine Hofbildung auf den PLC- Agarplatten, hingegen wies die TfCa, eine Carboxylesterase, keinen PCL-Abbau auf (Abbildung 66). Die rekombinant produzierten TfCa, TfCut1 und TfCut2 aus T. fusca KW3 zeigten dasselbe Abbauverhalten (Abbildung 66). Abbildung 66: PCL Abbautest der für die Abbauuntersuchungen eingesetzten Hydrolasen (obere Reihe: Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 (links), rekombinante Cutinase 1 von T. fusca WSH03-11 (Mitte, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008), rekombinante Cutinase 2 von T. fusca WSH03-11 (rechts, Chen et al. 2010, Chen J et al. 2008); mittlere Reihe: rekombinante Cutinase von F. solani pisi (links, Chen et al 2010), Cutinase aus F. solani sp. pisi (Mitte, Vertommen et al. 2005), Cutinase von Novozymes (rechts); untere Reihe : rekombinant produzierten Hydrolasen aus T. fusca KW3: Carboxylesterase TfCa (links), Cutinase TfCut1 (Mitte), Cutinase TfCut2 (rechts).

157 lösliche Hydrolyseprodukte (µm/g Substrat) lösliche Hydrolyseprodukte (µm/g Substrat) Ergebnisse und Diskussion Partielle Hydrolyse von APET-Filmen durch die PET-Hydrolasen In den nachfolgenden Diagrammen ist die Bildung von Hydrolyseprodukten aus APET-Film durch die PET-Hydrolasen dargestellt Inkubationszeit (h) TPA MHET BHET EMT EBT Summe Abbildung 67: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit TfCa aus T. fusca KW Inkubationszeit (h) TPA MHET BHET EMT EBT Summe Abbildung 68: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 von Chen et al und Chen J et al

158 lösliche Hydrolyseprodukte (µm/g Substrat) lösliche Hydrolyseprodukte (µm/g Substrat) Ergebnisse und Diskussion Inkubationszeit (h) TPA MHET BHET EMT EBT Summe Abbildung 69: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von Vertommen et al Inkubationszeit (h) TPA MHET BHET EMT EBT Summe Abbildung 70: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinase aus F. solani pisi von Chen et al

159 lösliche Hydrolyseprodukte (µm/g Substrat) Ergebnisse und Diskussion Inkubationszeit (h) TPA MHET BHET EMT EBT Summe Abbildung 71: Detektierte Hydrolyseprodukte nach Inkubation des APET-Films mit der Cutinasepräparation von Novozymes. Während der drei Tage Inkubation setzte die Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 die höchste Menge an löslichen Hydrolyseprodukten vom APET-Film frei (Abbildung 69). Gegenüber der Carboxylesterase TfCa aus T. fusca KW3 war dies das 475fache an löslichen Hydrolyseprodukten, gegenüber den F. solani pisi Cutinasen FsC und FspC waren es das 24fache und 40fache und gegenüber der eukaryotischen Cutinase-Präparation war es das 114fache an löslichen Hydrolyseprodukten. Alle PET-Hydrolasen wurden mit der Aktivität von 4 U/ml eingesetzt. Tabelle 33: Vergleich der freigesetzten Abbauprodukte der PET-Hydrolasen mit APET-Film. Enzym Temperatur Hydrolyseprodukte (%) TPA MHET BHET EMT EBT TfCa 50 C , T. fusca Cutinase C ,5 0,01 0 FsC 1 30 C FspC 2 30 C ,4 0,4 0 Novozymes Cutinase Präparation 30 C Vertommen et al Chen et al Mit 45% waren Terephthalsäure (TPA) und 1,2-Ethylen-bis-terephthalat (EBT) die Haupthydrolyseprodukte der Carboxylesterase TfCa, bei der Cutinase FsC waren es mit 53% Mono(2- Hydroxyethyl)Terephthalat (MHET) und 37% EBT. Die Cutinase setzte als einziges Enzym kein TPA frei, hingegen aber die höchste Menge an 1,2-Ethylen-mono-terephthalat-mono(2- hydroxyethylterephthalat) (EMT, 8%) verglichen mit den anderen PET-Hydrolasen. Die

160 Ergebnisse und Diskussion 143 Haupthydrolyseprodukte der Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 waren mit 57% und 42% TPA und MHET, ebenso bei FspC mit 78% MHET und 21% TPA. Es wurden nur geringste Mengen an Bis(2- Hydroxyethylterephthalat) (BHET) freigesetzt. Die Hauptabbauprodukte der Cutinase-Präparation von Novozymes war MHET mit 82% und TPA mit 18%. Es wurden keine weiteren Produkte detektiert (Tabelle 33). Die Freisetzung der Hydrolyseprodukte erfolgte über den gesamten Inkubationszeitraum. Beim Vergleich der verschiedenen F. solani pisi Cutinase-Präparationen (Abbildung 68, 70), bei denen jeweils 4 U/ml Esteraseaktivität zum APET-Filmabbau eingesetzt wurden, zeigte sich ein ähnliches Abbauverhalten in Bezug auf Menge und Verteilung der Hauptabbauprodukte. MHET als Hauptprodukt wurde mit 53% (Vertommen et al. 2005) und 57% (Chen et al. 2010) für die eukaryotischen Cutinasen identifiziert. Alle weiteren Hydrolyseprodukte unterschieden sich allerdings in der freigesetzten Menge bei den beiden Cutinasen. Diese Unterschiede könnten durch Modifikationen bei der rekombinanten Expression entstanden sein, wie zum Beispiel bei der Codon- ptimierung, beim Entfernen und Anfügen von Signalpeptiden, durch eine fehlende posttranslationale Modifikation oder durch eine andere Faltung im Expressionswirt (Vertommen et al. 2005, Chen et al. 2010, Chen S et al. 2008, Chen J et al. 2008). Von den zuvor für den Abbau von APET-Film eingesetzten Hydrolasen zeigte die Cutinase 2 aus T. fusca WSH03-11 die höchste Aktivität. Dies könnte auf die höhere Inkubationstemperatur von 60 C und der damit verbundenen höheren Beweglichkeit der PET-Ketten auf der Filmoberfläche zurückgeführt werden (Marten et al. 2005). Die gleichen Beobachtungen machten auch Ronkvist et al. 2009, die eine modifizierte Humicola (Thermomyces) insolens Cutinase bei 70 C mit PET-Filmen inkubierten und dabei die höchste Aktivität verzeichneten im Vergleich zu einer Pseudomonas mendocina Cutinase bei 50 C und einer Fusarium solani Cutinase bei 40 C (Ronkvist et al. 2009). Des Weiteren begünstigte die Lage des aktiven Zentrums der Cutinase direkt an der berfläche des Enzyms ebenfalls die Hydrolyseaktivität mit PET-Filmen (Abbildung 64d). Das aktive Zentrum der Carboxylesterase TfCa liegt hingegen in einer Bindungstasche und ist somit schwerer zugänglich, besonders für größere Substrate, wie den APET-Film (Abbildung 64a). Des Weiteren lag die Inkubationstemperatur der TfCa mit APET-Film bei 50 C und somit 10 C geringer gegenüber der Cutinase, was eine niedrigere Aktivität der Polymerketten zur Folge hat und somit die Hydrolyseaktivität des Enzyms beeinträchtigt (Marten et al. 2005). Die eukaryotischen Cutinasen wurden aufgrund ihrer geringeren Thermostabilität bei 30 C inkubiert, wobei die PET-Ketten des APET-Films noch weniger beweglich waren und dadurch geringer mit dem aktiven Zentrum wechselwirken konnten. Nach der Hydrolyse der APET-Filme durch die TfCa und die Cutinase FsC wurde die berfläche der Filme rasterelektronenmikroskopisch analysiert (Abbildung 72). Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (A) wies die mit der Carboxylesterase behandelte berfläche kleine Löcher auf (B). Der

161 Ergebnisse und Diskussion 144 APET-Film, welcher von der eukaryotischen Cutinase angegriffen wurde, zeigte hingegen einen großflächigen Abbau (C). A B C Abbildung 72: Rasterelektronenmikroskopische Analyse der enzymatisch behandelten APET-Film berflächen: Unbehandelte Kontrolle (A), Inkubation mit TfCa bei 50 C 74 h (B) und Inkubation mit Cutinase FsC bei 30 C 74 h (C). Alle bisherigen Studien zur berflächenmodifikation durch Mikroorganismen oder Enzyme verglichen die berflächenstrukturen nur mit einer Kontrolle bzw. einer alkalische berflächenhydrolyse der Fasern oder Filme. Diese Hydrolysebehandlungen erfolgten hingegen mit zwei verschiedenen Enzymen, deren Veränderungen auf der berfläche miteinander verglichen werden konnten und deutliche Unterschiede untereinander, aber auch zu einer alkalischen Hydrolyse aufwiesen (Abbildung 72, Yoon et al. 2002). Die Ausbildung verschiedener berflächenstrukturen, abhängig von der Behandlung (enzymatisch oder chemisch), wurde bereits in anderen Studien dargelegt. Yoon et al. wiesen als Erste nach, dass nach der Behandlung von PET-Fasern mit einer PET-Hydrolase die Faseroberfläche signifikante berflächenmodifikationen aufwiesen, welche sich von denen bei einer NaH Behandlung deutlich unterschieden (Yoon et al. 2002). Auch Zhang et al. behandelten PET- Fasern mit Mikroorganismen und einer Lipase und konnten mittels SEM eine deutliche berflächenerosion im Vergleich zu unbehandelten Fasern nachweisen (Zhang et al. 2004). Ähnliche Ergebnisse wurden auch von Kim und Song 2006 veröffentlicht, die die berflächenhydrolyse von PET-Fasern mit einer Lipase und NaH verglichen und unterschiedliche berflächenstrukturen nachwiesen. Im Gegensatz dazu konnten bei weiteren Untersuchungen mit PET-Fasern beim Vergleich der enzymatischen und basischen Hydrolyse bei der enzymatischen Behandlung keine Veränderung der berflächenstruktur im Vergleich zur Kontrolle nachgewiesen werden (Eberl et al. 2008, Brueckner et al 2008). Diese Beobachtungen wurden auf eine besonders faserschonende und minimale berflächenmodifikation zurückgeführt. Es könnte allerdings auch auf eine zu geringe Inkubationszeit oder Enzymmenge hinweisen, womit die möglichen Auswirkungen der enzymatischen Behandlung noch nicht für die berflächenanalyse sichtbar waren. Feuerhack et al. wiesen, ähnlich zu allen anderen Autoren, ebenfalls eine leichte berflächenveränderung nach der enzymatischen Hydrolyse der PET-Fasern durch eine Enzympräparation von T. fusca KW3 nach (Feuerhack et al 2008).