Vorbemerkung: In den Abbildungen weiter unten werden Chromatogramm-Ausschnitte aus längeren Läufen gezeigt.
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- Annegret Beck
- vor 6 Jahren
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1 Der HPLC-Tipp im Mai Die Vorsäule nicht nur als Vorsäule zu nutzen von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken Der Fall Mit einigen Anwendern habe ich vor Ort ein Paar einfache Optimierungsexperimente durchgeführt. Wir haben einiges ausprobiert, nachfolgend werden 1-2 Ergebnisse vorgestellt. Uns ging es vor allem um die Frage: Was ist mit einfachen Mitteln möglich und was bringt wann, was? Die Lösung Vorbemerkung: In den Abbildungen weiter unten werden Chromatogramm-Ausschnitte aus längeren Läufen gezeigt. Man betrachte Abb. 1. Es handelt sich um die Injektion von 50 µl einer recht komplexen Probe (Linearer Puffer/ACN-Gradient, Fluss: 1,6 ml/min, Kromasil C18, 5µm) Abb. 1 Injektion einer 50 µl Probe bei F=1,6 ml/min, Details, s. Text
2 Im vorliegenden Fall interessiert am meisten der Bereich nach der Totzeit sowie die Abtrennung einer Nebenkomponente vom Hauptpeak bei ca. 10 min: Die polare Verunreinigung direkt nach dem Totzeitpeak wird hier einigermaßen abgetrennt, die Nebenkomponente jedoch lediglich angetrennt. Wie bereits öfters an dieser Stelle erwähnt, besteht bei größeren Injektionsvolumina stets die Gefahr einer lokalen Überladung der Säule. Jene geht mit einer schlechten Auflösung vor allem im vorderen Bereich des Chromatogramms einher (Elution polarer Analyte). In Abb. 2 wird die Injektion von 10 µl gezeigt. Abb. 2 Wie bei Abb. 1, jedoch 10 µl injiziert Wie erwartet, werden vorne mehr Peaks, besser abgetrennt. Der kleine Peak an der Flanke des großen Peaks bei ca. 10 min wird zwar besser, aber immer noch nicht genügend gut abgetrennt. Eine weitere, einfache Maßnahme neben der Reduktion des Injektionsvolumens ist die Abnahme des Flusses, s. Abb. 3.
3 Abb. 3 Reduktion des Flusses auf F=0,8 ml/min Bei einem Fluss von 0,8 ml/min wird die Nebenkomponente schon abgetrennt dies allerdings erst nach ca. 25 min... Es wurde nun wieder der ursprüngliche Fluss von 1,6 ml/min eingestellt und eine Vorsäule eingebaut, diese war mit Hilfe einer Verbindungskapillare mit der Hauptsäule verbunden, s. Abb. 4.
4 Abb. 4 Unteres Chromatogramm, Trennung ohne Vorsäule, oberes Chromatogramm Trennung nach Einbau einer Vorsäule Ergebnis: Die resultierende Bandenverbreiterung bedingt durch das zusätzliche Totvolumen wg. der Verbindungskapillare und evtl. einer dürftigen Packungsqualität der Vorsäule führen zu einer etwas schlechteren Trennung im Vorderteil des Chromatogramms. Andererseits wird die Nebenkomponente gut abgetrennt und dies bereits nach ca. 12 min.
5 Das Fazit Abnahme des Injektionsvolumens aber auch verdünnen der Probenlösung kann zu einer merklichen Verbesserung der Auflösung vor allem im vorderen Bereich des Chromatogramms (Trennung polarer Analyte) führen. Die Verringerung des Flusses kann eine Verbesserung der Trennung bedingen - allerdings logischerweise auf Kosten der Retentionszeit. Vorteil dabei: Die Peakfläche nimmt bei niedrigen Flüssen im Falle von konzentrationsempfindlichen Detektoren wie dem UV zu. Eine Vorsäule als Adapter (geringes zusätzliche Totvolumen) kann nicht nur bei kontaminierten Proben/komplexen Matrices die Lebensdauer der Hauptsäule verlängern, sie kann bei einer geringen Zunahme der Retentionszeit auch zu einer ausreichenden Verbesserung der Trennung führen. Eine u. U. sich ergebende Bandenverbreiterung macht sich evtl. im vorderen Chromatogramm-Bereich negativ bemerkbar, bei den späteren Peaks fällt jene kaum ins Gewicht. Interessante Variante: Man verwende zu einer C18 Hauptsäule eine polare Vorsäule (CN, NH2, Diol aber auch Kieselgel), wenn das Chromatogramm an für sich gut aussieht und man sich eine etwas bessere Trennung im Bereich nach der Totzeit wünscht. Oder aber, wenn man beim Gradienten mit einem hohen Wasser/Puffer-Anteil starten muss. In diesem Fall ist die Oberfläche eines hydrophoben C18-Materials womöglich nicht benetzt, die vorderen Peaks können Probleme bereiten: Sie eluieren an/direkt nach der Totzeit und/oder sie tailen. Eine polare Vorsäule könnte hier Abhilfe schaffen.
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