BIOCHEMIE-TUTORIUM: MOLEKULARBIOLOGIE I

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1 BIOCHEMIE-TUTORIUM: MOLEKULARBIOLOGIE I GLIEDERUNG: Grundlagen, wichtige Definitionen DNA: Aufbau, Struktur Replikation: Ablauf DNA: Topologie DNA: Veränderungen und Reparaturmechanismen RNA: Aufbau, Klassifikation Transkription: Ablauf RNA: Posttranskriptionale Modifikationen Regulation der Genexpression Fragen sind nicht nur erlaubt, sondern auch erwünscht!

2 Zellteilung Repli- kation Biochemie Tutorium by Mathias Lutz & Jonas Feldheim Molekularbiologie I ZENTRALES DOGMA DER MOLEKULARBIOLOGIE Transkription Proteinbiosynthese Trans- DNA RNA Protein lation Reverse Transkriptase DNA Reverse Transkriptase: Ein Enzym, das die Synthese von DNA aus RNA katalysiert Retroviren: Vermehrung des Virus (z. B. HIV) Eukaryonten: Telomerase Enzym für die DNA-Topologie

3 GENOM: WICHTIGE GRUNDBEGRIFFE Gesamtmenge der DNA einer Zelle, die in Chromosomen (als kondensiertes Chromatin) angeordnet ist GEN: Diploider Satz: Somatische Zellen (46 Chromosomen) Haploider Satz: Keimzellen = Gameten (23 Chromosomen) Abschnitt auf der DNA, der für ein Produkt (RNA-Molekül/Protein) codiert NUCLEOSID: Eine Purin- oder Pyrimidinbase, die über eine N-glykosidische Bindung mit einer Ribose oder Desoxyribose verbunden ist

4 Zellteilung Biochemie Tutorium by Mathias Lutz & Jonas Feldheim Molekularbiologie I NUCLEOTID: WICHTIGE GRUNDBEGRIFFE Ein Nucleosid, das über eine Esterbindung am C-Atom 5 der Ribose oder Desoxyribose mit einer Phosphatgruppe verknüpft ist DNA Phosphatgruppe Zucker (Desoxy -ribose) Base (hier: Adenin) RNA Nucleosid (hier: Desoxyadenosin) Nucleotid (hier: Desoxyadenosinmonophosphat) DNA

5 AUFBAU DER DNA DNA = DNS = DESOXYRIBONUKLEINSÄURE: ca Gene ca. 3,2 x 10 9 Basenpaare Länge: ca. 1,8 Meter! Centromer Kurzer Arm (p-arm) Langer Arm (q-arm) Telomer Chromatid Chromosom

6 STRUKTUREN: AUFBAU DER DNA Primärstruktur Sekundärstruktur Tertiärstruktur Quartärstruktur Sequenz eines Einzelstranges (Phosphodiesterbrücken) Doppelstrangbildung (Wasserstoffbrücken) Doppelhelix (Stapelwechselwirkungen) Superhelix = Supercoil (Histone)

7 AUFBAU DER DNA PRIMÄRSTRUKTUR EINZELSTRANG: Desoxyribonucleotide, die durch Phosphodiesterbrücken zwischen C3 und C5 verknüpft sind: Phosphodiesterbindung Nach Konvention werden die C-Atome der (Desoxy-)Ribose immer mit einem Strich ( ) markiert C1, C2, C3, C4 und C5

8 AUFBAU DER DNA SEKUNDÄRSTRUKTUR DOPPELSTRANG: Wasserstoffbrückenbindungen verknüpfen zwei Einzelstränge zu einem Doppelstrang Bindung: Purin-Base Pyrimidin-Base Wasserstoffbrücken Adenin Thymin 2 Guanin Cytosin 3 C-G ist stabiler als A-T: Dieser Effekt wird bei der TATA-Box ausgenutzt: In einem Bereich mit vielen A-T-Abfolgen kann die DNA leichter eröffnet werden

9 AUFBAU DER DNA SEKUNDÄRSTRUKTUR Doppelstrangbildung erfolgt antiparallel: Die Einzelstränge sind in entgegengesetzter Richtung aneinandergelagert: An jedem Ende des Doppelstranges hat einer der beiden Einzelstränge sein 3 -Ende, der andere sein 5 -Ende: Wasserstoffbrücke 5 Adenin Thymin 3 2-Desoxy-β-D-Ribose 3 Guanin Cytosin 5 Phosphat Desoxyribose und Phosphat: AUSSEN negatives Rückgrat Hydrophobe Basen: INNEN

10 DOPPELHELIX: AUFBAU DER DNA TERTIÄRSTRUKTUR Schraubenförmige Windung des Doppelstranges, die durch Stapelwechselwirkungen zwischen den Basen stabilisiert wird Kleine Furche (minor groove) Große Furche (major groove) Eine Windung (turn): 10 Basenpaare (bei B-DNA) Länge: ca. 3,4 nm Interaktion mit Transkriptionsfaktoren Breite: ca. 2 nm

11 HISTONE: AUFBAU DER DNA QUARTÄRSTRUKTUR Hochkonservierte Proteine basales Element zur Regulation der DNA- Struktur und Genexpression KLASSIFIKATION: Fünf verschiedene basische Proteine: H1 H2A H2B H3 H4 SUPERHELIX: H2A und H2B sowie H3 und H4 bilden jeweils zunächst ein Dimer und zwei solcher Dimere wiederum ein Tetramer Vier solche Dimere bilden ein Octamer Bildung einer Scheibe, um die sich die DNA wickelt Nucleosom (ca. 150 Basenpaare als Superhelix mit 1,8 Windungen) Nucleosomenfaser: Ausbildung eines Münzstapels DNA zwischen zwei Nucleosomen: Linker-DNA mit H1 assoziiert, ca. 50 Basenpaare lang

12 AUFBAU DER DNA QUARTÄRSTRUKTUR AUSBILDUNG DER HISTONE:

13 AUFBAU DER DNA QUARTÄRSTRUKTUR BINDUNG DER HISTONE AN DIE DNA: Histone enthalten viel Arginin und Lysin basische, positive Ladung gute Bindung an die negativ geladene Desoxyribonukleinsäure LÖSUNG DER HISTONE VON DER DNA: Acetylierung, Phosphorylierung (z.b. durch Enhancer): Ladung der Histone wird negativer DNA dissoziiert leichter N-Terminus Acetylierung Acetylierter N-Terminus

14 ZELLZYKLUS: MITOSE-PHASE (ca. 1 Stunde) DNA REPLIKATION INTERPHASE o G 1 -PHASE: Überprüfung der DNA auf Fehler (ca. 8 Stunden) o S-PHASE: DNA-Verdopplung = Replikation (ca. 6 Stunden) o G 2 -PHASE: Überprüfung der DNA auf Fehler (ca. 4,5 Stunden)» Restriktionspunkt: Zwischen G 1 - und S-Phase entscheidet sich, ob die Zelle den Zyklus erneut durchläuft oder ob sie in ein Ruhestadium (G 0 -Phase) eintritt Regulation z.b. durch Wachstumsfaktoren Die Replikation erfolgt in drei Teilschritten: INITIATION ELONGATION TERMINATION INITIATION:» Startpunkt: Bakterien: Origin Menschen: Mehrere Tausend Replikationsursprünge pro Chromosom, weil es sonst zeitlich unmöglich wäre, die 3,2 x 10 9 Basenpaare zu replizieren Replikationsblasen» Helikase: Enzym, das ATP-abhängig die H-Brückenbindungen auftrennt Einzelstränge» Einzelstrangbindeproteine (Single-strand binding proteins = SSBPs): Proteine, die an die Einzelstränge binden, diese stabilisieren und so getrennt halten

15 ELONGATION: DNA REPLIKATION Die Replikation erfolgt durch das katalysierte Anknüpfen von Desoxyribonucleosidtriphosphaten (datp, dgtp, dctp, dttp), von denen ein Pyrophosphatrest abgespalten wird Die Replikation erfolgt ausschließlich in 5-3 -Richtung! Das freie OH-Ende am 3 -C-Atom greift das Desoxyribonucleosidtriphosphat an der Pyrophosphatbindung zwischen α- und β-phosphat nukleophil an DNA-Polymerasen benötigen ein freies 3 -OH-Ende» Leading strand (Führungsstrang): DNA-Polymerase ε Synthese durch die Polymerase ε in 5-3 -Richtung ohne Probleme» Lagging strand (Verzögerungsstrang): DNA-Polymerase δ Primase (Teil der DNA-Polymerase α) setzt einen RNA-Primer ein; DNA-Polymerase α synthetisiert den Anfang des Strangs; von dort erfolgt die Synthese in 5-3 -Richtung bis zum letzten synthetisierten Teil (DNA-Polymerase δ) Okazaki-Fragmente Nucleasen bauen dann die Primer ab Polymerase α füllt die entstandenen Lücken DNA-Ligase verknüpft die einzelnen Okazaki-Fragmente

16 DNA-POLYMERASEN: DNA REPLIKATION Enzyme, welche die DNA-Synthese aus Desoxyribonukleotiden an einer DNA-Matrize katalysieren (sie ermöglichen den notwendigen nukleophilen Angriff der 3 -OH-Gruppe) DNA-Polymerase α DNA-Polymerase β DNA-Polymerase γ DNA-Polymerase δ DNA-Polymerase ε Synthese von Primer und Anfang von Leit- und Verzögerungsstrang (auch Primaseaktivität) Reparaturaufgaben NICHT im Kern, sondern in Mitochondrien Synthese der mtdna (mitochondriale DNA) Synthese des Verzögerungsstranges Synthese des Leitstranges

17 DNA TOPOLOGIE: TELOMERASE Am Verzögerungsstrang werden die zunächst notwendigen RNA-Primer schließlich durch eine Nucleaseaktivität entfernt Problem: Die Lücke, die am Ort des letzten Primers am 5 -Ende entsteht, kann durch die DNA-Polymerase nicht mehr gefüllt werden (es fehlt das freie 3 -OH!) Chromosom würde immer kürzer werden: RNA-Primer 3 5 DNA-Polymerase Replikationsrichtung Fehlendes Stück!

18 TELOMERE: DNA TOPOLOGIE: TELOMERASE Künstliches DNA-Ende mit einer repetitiven, nicht-codierenden Sequenz, das bei jeder Zellteilung um etwa 100 Nucleotide gekürzt wird nach etwa 50 Zellteilungen sind auch die Telomere aufgebraucht und die Zelle teilt sich nicht mehr weiter Hayflick-Grenze: Alterung der Zelle TELOMERASE: Reverse Transkriptase: Ein Enzym mit einer RNA-Komponente, die als Matrize für Hexobasen dient Auffüllung des fehlenden Stücks am 5 -Ende der DNA mit hochrepetitiven Hexobasen-Abschnitten (TTAGGG) Telomerase ist überall vorhanden: stark aktiv: v.a. in teilungsaktiven Zellen (Keimzellen) teilaktiv: z.b. in Haarfollikeln und Darmzotten Krebszellen: Reaktivierte Telomerase! EXKURS: Telomere haben weitere Funktionen: Stabilität der Chromosomen (Schutz vor Abbau) Struktur in der Mitose (Telomere binden an Kernlamina) Markierung der Enden (Korrekte Verknüpfung nach Doppelstrangbrüchen)

19 DNA TOPOLOGIE: TOPOISOMERASEN Bei der Replikation (und auch Transkription): Entspiralisierung der DNA Positive supercoiling : Starke Verwindung der DNA Spannung

20 DNA TOPOLOGIE: TOPOISOMERASEN TOPOISOMERASE I Einzelstrangbruch: Phosphodiesterbindung geöffnet Einzelstrangbruch anderer Strang kann sich herum winden Beseitigung der Spannung energieunabhängig TOPOISOMERASE II (bei Prokaryonten: Gyrase) Doppelstrangbruch: Einführung eines Doppelstrangbruches, wobei die Enden fixiert sind anliegende Doppelhelix kann die gebildete Lücke passieren Beseitigung der Spannung ATP-abhängig

21 DNA REPARATURMECHANISMEN BASENEXZISIONSREPARATUR Schäden, die nur eine Base betreffen, z.b.: Cytosin-Desaminierung (spontan: Cytosin ist chemisch instabil) Thermische Depurinisierung (tritt auch bei normaler Körpertemperatur auf) Reparatur-Enzyme erkennen fehlerhafte Stelle daran, dass die Spiralstruktur der DNA von der Norm abweicht DNA-Glykosylase: Endonuklease: DNA-Polymerase: DNA-Ligase: Entfernung der fehlerhaften Base Entfernung der unbesetzten Desoxyribose Einbau des passenden Nukleotids Verankerung der neuen Base im DNA-Strang NUKLEOTIDEXZISIONSREPARATUR Schäden, die mehrere Basen betreffen, z.b.: Thymin-Dimerisierung (UV-Strahlung) Helikase: Endonukleasen: DNA-Polymerase: DNA-Ligase: Entwindung der DNA Entfernung eines Oligonucleotids (Länge: ca. 20 Basen), in dem sich der Fehler befindet Einbau der passenden Nukleotide Verankerung des neuen Stücks im DNA-Strang PROOF-READING DNA-Polymerase besitzt eine Korrekturaktivität für Fehler während der Replikation Fehlerhaft eingebaute Base: Nucleotid wird entfernt und neu synthetisiert (Polymerase δ und Polymerase ε) MISSMATCH REPAIR EXKURS: Xeroderma pigmentosum: Genetischer Defekt der Nukleotidexzisionsreparatur UV-bedingte Thymindimerisierung wird nicht mehr korrigiert Hautkrebs Mondscheinkinder (in Deutschland selten; in Japan häufiger)

22 RNA = RNS = RIBONUKLEINSÄURE VERGLEICH ZWISCHEN RNA UND DNA: RNA DNA Organisation Einzelstrang (i.d.r.) Doppelstrang 3 5 Ribose Desoxyribose Zucker Purine Pyrimidine Adenin Guanin Uracil Cytosin Adenin Guanin Thymin Cytosin Cytosin kann spontan zu Uracil desaminieren, deswegen wird im Gegensatz zur kurzlebigen RNA, in die DNA Thymin eingebaut. Uracil in der DNA wird klar als Fehler erkannt!

23 VERSCHIEDENE RNA-TYPEN: RNA KLASSIFIZIERUNG RNA Typ Organisation Funktion hnrna = prä-mrna (heterogene nukleäre RNA) mrna (messenger RNA) trna (transfer RNA) rrna (ribosomale RNA) snrna (small nuclear RNA) scrna (small cytoplasmic RNA) Einzelstrang Einzelstrang Einzelstrang (mit Basenpaarungen) Einzelstrang (mit Basenpaarungen) an Proteine assoziiert an Proteine assoziiert primäres Produkt der Transkription Matrize für Proteine (aus hnrna entstanden) bindet Aminosäuren für die Proteinsynthese Ribosom Bestandteil des Spleißosom Bestandteil des SRP (signal recognition particle) RIBOZYME: Katalytisch aktive RNA-Moleküle wie z.b. das Spleißosom Katalyse von chemischen Vorgängen (wie Enzyme)

24 TRANSKRIPTION Synthese der Kopie eines Gens als einzelsträngiges RNA-Molekül RNA-POLYMERASEN Katalyse der Transkription: Reaktionsmechanismus entspricht dem der DNA-Polymerasen (3 -OH-Ende der RNA greift Phosphorsäureanhydridbindung zwischen α- und β Phosphat des nächsten Ribonucleosidtriphosphats an) Unterschied zur DNA-Polymerase: RNA-Polymerasen benötigen KEINEN Primer RNA-Molekül besitzt am 5 -Ende ein Triphosphat» Klassifikation: Typ Produkt Vorkommen RNA-Polymerase I rrna Nucleolus RNA-Polymerase II hnrna mrna Nucleus RNA-Polymerase III trna Nucleus Differenzierung durch Hemmbarkeit mit α-amanitin (Gift des Knollenblätterpilzes)

25 TRANSKRIPTION ABLAUF Die Transkription erfolgt in drei Teilschritten (vgl. Replikation): INITIATION ELONGATION TERMINATION INITIATION RNA-Polymerasen können nicht selbstständig an DNA binden Initiationskomplex notwendig: Mehrere allgemeine Transkriptionsfaktoren bilden diesen Komplex» Promotor: Region, welche die für die Bindung des Initiationskomplexes notwendigen Basensequenzen enthält Lokalisation etwas oberhalb des eigentlichen codierenden Abschnitts der DNA Proximaler Promotor (z. B. CRE = camp responsive elements) Entscheidung, ob ein Gen abgelesen wird Distaler Promotor (z. B. HRE = hormone responsive elements) Entscheidung, wann ein Gen abgelesen wird» TATA-Box: Adenin-Thymin-reiche Sequenz in der Promotorregion Lokalisation etwa 20 Basen oberhalb des Transkriptionsstartpunktes NICHT JEDER Promotor enthält eine TATA-Box! Funktion: Trennung der beiden DNA-Einzelstränge

26 TRANSKRIPTION INITIATIONSKOMPLEX An die TATA-Box lagern sich verschiedene Transkriptionsfaktoren an, bis an diese schließlich die jeweilige RNA-Polymerase binden kann: Für jede RNA-Polymerase gibt es verschiedene Transkriptionsfaktoren!

27 ELONGATION TRANSKRIPTION ABLAUF Der Initiationskomplex ist für die Transkription nicht mehr notwendig Proteine dissoziieren RNA-Polymerase führt Transkription durch TERMINATION Terminationssequenz der DNA: Hochrepetitive Basensequenz hnrna paart sich mit sich selbst Bildung einer Loopstruktur Ende der Transkription

28 POSTTRANSKRIPTIONALE MODIFIKATIONEN SPLICING (SPLEIßEN) Spleißosom = Proteinkomponente + snrna Spleißosom erkennt Introns an ihrer Loop-Struktur Loop wird zweimal umgeestert Ringbildung Intron fällt raus ( herausgespleißt ) + Exons Introns WICHTIG: Introns werden herausgespleißt, nicht herausgeschnitten!

29 POSTTRANSKRIPTIONALE MODIFIKATIONEN CAPPING (AM 5 -ENDE) Anbau einer Kappe aus 7-Methylguanosintriphosphat Adressaufkleber : Transport durch Kernporen; Ribosomenanheftung Schutz vor enzymatischem Abbau (Nukleasen) POLY-ADENYLIERUNG (AM 3 -ENDE) Poly-A-Polymerase: Anbau einer Poly-Adenin-Sequenz Poly-A-Schwanz (Poly-A-Schwanz ist NICHT auf der DNA codiert!) nach etwa 250 Adenin-Basen entsteht ein Ring Schwanzende Signal für die Vollständigkeit der mrna Schutz vor enzymatischem Abbau (Nukleasen) 5 -Cap Exons Poly-A-Schwanz Introns

30 EDITING POSTTRANSKRIPTIONALE MODIFIKATIONEN Austausch von einzelnen oder mehreren Nukleobasen (von Zelle zu Zelle unterschiedlich)» Beispiel: Einbau eines neuen Stoppcodons Translation bricht früher ab Synthese eines völlig neuen Proteins» Paradebeispiel: Apolipoprotein B48 (Darm) Apolipoprotein B100 (Leber) Apo B100 Apo B48 ApoB48 mit 48% der Sequenz von ApoB100 ( 100% ) (aber z. B. auch einige Ionenkanäle im Gehirn)

31 REGULATION DER GENEXPRESSION REGULIERBARE TRANSKRIPTIONSFAKTOREN Enhancer: Verstärker der Transkription Silencer: Hemmer der Transkription (selten)» Lokalisation: Regulierbare Transkriptionsfaktoren liegen teilweise tausende Basenpaare vor oder hinter dem Promotor: DNA ist sehr flexibel: Enhancer/Silencer kommt leicht in die Nähe des Promotors Chromatin remodeling complex (CRC): Enhancer/Silencer kann durch Acetylierung die DNA von den Histonen wickeln» Enhancer Aufbau: DNA-Bindungsdomäne: Bindung des Enhancers an die DNA o Zinkfingerstruktur o Leucin-Zipper o Helix-Loop-Helix-Strukturen Transaktivierungsdomäne: Aktivierung der Transkription Liganden-Bindungsdomäne: Bindung von aktivierenden Liganden

32 METHYLIERUNG: REGULATION DER GENEXPRESSION Methylierung von DNA-Abschnitten: Dauerhafte Abschaltung eines Gens Methylierungen finden bevorzugt in CpG-Inseln (Guanin-Cytosin-reiche Abschnitte der DNA) statt Genomic imprinting: Regulation der Expression bestimmter Proteine: Methylierung einer die Expression hemmenden Isolatorregion sorgt dafür, dass das Gen in der Folge abgelesen wird Beispiel: IGF-2 (nur väterliche Gene werden abgelesen)