Die Geschichte mit dem rostigen Nagel und der Blutvergiftung

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Erika Neumann
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Forschungszentrum Borstel, Leibniz- Zentrum für

1 Forschungszentrum Borstel, Leibniz- Zentrum für Medizin und Biowissenschaften Biophysik Martin-Luther-Universität Halle/Wittenberg Physikalische Chemie Die Geschichte mit dem rostigen Nagel und der Blutvergiftung Lipopolysaccharide und das endotoxische Prinzip Patrick Garidel und Klaus Brandenburg

Von links: Pseudomonas aeroginosa, ein Gram-negatives Bakterium;

2 Erregerspektrum bei Sepsis Bakterien: gram + und gram - Pilze Viren Protozoen Drei gefürchtete Sepsis-Erreger. Von links: Pseudomonas aeroginosa, ein Gram-negatives Bakterium; Streptococcus pneumoniae, ein Gram-positives Bakterium; Aspergillus fumigatus, ein Pilz

3 Bakterielle Endotoxine und LPS Gram-negativ Bakterien

4 Bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) Endotoxische Prinzip In der äusseren Zellwand von Gram-negativen Bakterien (Enterobacteriaceae und Pseudomonadaceae)

5 LPS: Salmonella minnesota H H H H + NH 3 H H H H H - P - - H NH H H NH P - - P + NH

6 LPS: Salmonella minnesota H H H H NH 3 H Polar = Wasserliebend + H H H H - P - - H NH H H NH P - - P + NH Apolar = Wasserabweisend

7 Aggregatbildung

8 Beziehung zwischen Molekülgeometrie und Supramolekularer Struktur I lamellar (L) I cubic (Q) I hexagonal (H II ) Packungskonzept nach Israelachvili

9 LPS S-form / wild-type P P Glc Kdo Hep Hep Gal Glc C GlcN GlcN LPS Ra / R60 Kdo Hep Gal GlcNac C P Zusätzliche Variationen: - Anzahl an KW-ketten - Länge der KW-ketten - Sättigungsgrad - Verknüpfung - Ladung (Phosphatgruppen) LPS Rd2 / R4 LPS Re / R595 Lipid A

10 Beziehung Struktur versus Bioaktivität Biophysikalische Untersuchungen Biologische Assays (TNF-a, IL, Hämolyse, LAL etc)

11 Aggregatbildung und biologische Aktivität Untersuchungen an synthetischen Lipid A Analoga Biophysikalsiche Charakterisierung Beziehung zwischen Molekülgeometrie und Bio-Aktivität

12 Biophysikalische Untersuchungen an LPS Spektroskopie (FTIR, CD, Fluoreszenz) Morphologie (AFM, FF-EM) Filmwaagetechniken (FW, BAMS, Patch-Clamp) Ladung (Zeta-Potential) Kalorimetrie (DSC, ITC) Streuung (RALS, PCS) MALDI-TF X-ray (SAXS, WAXS)

13 Untersuchungen an synthetischen Lipid A Analoga Verschiedene Spacerlänge Verschiedene Stereochemie Brandenburg, Hawkins, Garidel, Andrä et al. (2004) Biochem 43: 4039

14 X-Ray (SAXS) und Supramolekulare Struktur I Verhältnisse der Reflexpositionen lamellar (L) I s 1, 2, 3, 4, 5, cubic (Q) I s 1, 2, 3, 2, 5 hexagonal (H II ) s 1, 3, 2, 7, 3

15 Untersuchungen an synthetischen Lipid A Analoga SAXS 5.55 nm 4.98 nm 3.20 nm 4.39 nm 6.91 nm ER C 50 C 4.59 nm ER C 50 C 5.99 nm 4.27 nm 8.70 nm nm nm ER nm 3.76 nm 2.76 nm 2.76 nm 2.29 nm 1.14 nm s / nm s / nm s / nm s / nm nm ER ER nm 20 C 70 C 3.95 nm 3.75 nm 1.95 nm 2.08 nm 1.39 nm 1.87 nm 1.03 nm s / nm s / nm -1

16 TNF-a production (pg/ml) Untersuchungen an synthetischen Lipid A Analoga ELISA 700 n=0 R,R,R,R Concentration in ng/ml n=0 R,R,S,S n=0 S,S,S,S 100 n=0 R,S,S,R n=4 R,R,R,R n=8 R,R,R,R 0 ER ER ER ER ER ER EISAI compounds Brandenburg, Hawkins, Garidel, Andrä et al. (2004) Biochem 43: 4039

17 Endotoxin: Signalerkennung und -transduktion TLR4 = Toll-Like-Rezeptor 4 NF B = Transkriptionsfaktor LBP = LPS BindeProtein Cohen, 2002

18 Endotoxin: Signalerkennung und -transduktion TLR4 = Toll-Like-Rezeptor 4 NF B = Transkriptionsfaktor LBP = LPS BindeProtein Cohen, 2002

19 TLR-4 & LPS Dr. med A. Koch

20 Endotoxin: Signalerkennung und -transduktion TLR4 = Toll-Like-Rezeptor 4 NF B = Transkriptionsfaktor LBP = LPS BindeProtein Cohen, 2002

21 Korrelation zwischen der supramolekularen Struktur und der Bio-Aktivität Lipid A Rb. capsulatus Rs. fulvum C. violaceum Rp. viridis C. jejuni S. minnesota Monophosphoryl E. coli S. minnesota Bisphosphoryl Rc. gelatinosus Supramolekulare Struktur Lamellar Invertiert L L / Q Q H II Molekulare Konformation Endotoxizität Inaktiv Nicht-toxisch keine Zytokininduktion Moderat toxisch Zytokinindukction Aktiv Hochtoxisch Starke Zytokin- Induktion

22 Peptid Wechselwirkung mit Endotoxinen Bindungseigenschaften von Polypetid-Antibiotika an Endotoxinen Bindungsmechanismus Peptid ptimierungsstrategien abzuleiten

23 Polymyxin B / Nonapeptide Polymyxine (5+): Wichtigste Vertreter der Polypeptid-Antibiotika, deren charakterist. Bausteine L-2,4-Diaminobuttersäure (DAB), L-Threonin (Thr), D- Phenylalanin (Phe) sowie L- u. D-Leucin (Leu) sind. PMB/PMBN: Neutralisierungsagentien Bei höheren Konzentrationen: toxisch Brandenburg, David, Howe, Koch, Andrä, Garidel (2005) Biophys. J. 88: 1845

24 Isothermal Titration Calorimetry Garidel, Hildebrand, Blume (2004) MicroCal Application Note

25 PMB:LPS Re - Bindung ITC T = 20 C PMB LPS Re LPS Re + PMB PMB: 5+ LPS Re: 4- Heat Flow / µj s Sättigung Ladungskompensation Time / s Brandenburg, David, Howe, Koch, Andrä, Garidel (2005) Biophys. J. 88: 1845

26 LPS

27 Polymyxin B Lösungs-struktur und Sequenz von PMB David (2001) J Mol Recog 14: 370 Bhattacharjya et al. (1997) Biopolymers 41: 251

28 Polymyxin B - Lipid A Bindung David (2001) J Mol Recog 14: 370 Bindungsaffinität mm

29 PMP/PMBN Bindung an Endotoxine Bindungsmechanismus: Schritt 1: Elektrostatische Wechselwirkung zwischen Peptid und Endotoxin Schritt 2: Peptid Penetration/Einbau (hydrophobe KW-kette) in die Endotoxin Membran PMB > PMBN Neue Strategieansätze zur Entwicklung von Therapeutischen Wirkstoffen zwecks Reduktion der Sepsis Peptide von Interesse: BPI (Bactericidal/Permeability Increasing protein), CAP37 (Cationic Antimicrobial Protein), LALF (Limulus Anti-LPS Factor), lactoferrin/lactoferricin, NK (Natural Killer),.

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