Molekulare Biophysik. NMR-Spektroskopie (Teil 2)
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- Sarah Hauer
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Transkript
1 Molekulare Biophysik NMR-Spektroskopie (Teil 2)
2 NMR-Parameter
3 NMR-Parameter 3/88 Folgenden NMR-Parameter sind von Interesse chemische Verschiebung skalare Kopplung Relaxation / NOE-Effekt
4 NMR-Parameter 4/88 Chemische Verschiebung ppm Die Position der Signale im Spektrum wird als die chemische Verschiebung bezeichnet, sie wird relativ zu einem willkürlichen Standard angegeben
5 NMR-Parameter 5/88 Chemische Verschiebung B eff = (1 - ) B 0 = (1 - ) B 0 = ( ref ) / 0 x 10 6 = ( ref ) x 10 6 Die Elektronen um den Atomkern schirmen das äußere Magnetfeld ab, je mehr Elektronen desto Stärker die Abschirmung
6 NMR-Parameter 6/88 typische 1 H Verschiebungen ArOH -CHO olefinic ROH RNH 2 aromatic CH -O n acetylenic CH nch -N CH 2 CH 3 -C n -CO CH -Ar 3 CH -C=C 3 TMS 1 ( H)/ppm
7 NMR-Parameter 7/88 typische Bereiche für 1 H und 13 C 1 H, 600 MHz, 14.7 Tesla 6000 Hz 10 ppm 3000 Hz 5 ppm 0 Hz 0 ppm 13 C, 150 MHz, 14.7 Tesla Hz 200 ppm Hz 100 ppm 0 Hz 0 ppm
8 NMR-Parameter 8/88 Eine Zuordnung kann über empirische Tabellen erfolgen...
9 NMR-Parameter 9/88... oder über Inkrementsysteme.
10 NMR-Parameter 10/88 Bei 13 C funktionieren Inkrementsysteme noch besser als bei 1 H...
11 NMR-Parameter 11/88... und viele z.b. Formelzeichenprogramme sind zu einer Vorhersage in der Lage.
12 NMR-Parameter 12/88 Ein wichtiger Faktor für die chemische Verschiebung sind Anisotropieeffekte, sie treten im Prinzip bei jedem Kern auf, werden aber meist durch Molekülbewegung gemittelt.
13 NMR-Parameter 13/88 Skalare oder J- Kopplung Die Signale zeigen neben der Position im Spektrum auch noch eine Feinaufspaltung: die skalare Kopplung ppm
14 NMR-Parameter 14/88 skalare oder J- Kopplung Die Elektronen um die Atomkerne vermitteln eine indirekte Spin-Spin Wechselwirkung.
15 NMR-Parameter 15/88 RCH - CH 2 3 Skalare J = 8 Hz Kopplungen sind meist viel kleiner als chemische Verschiebungen.
16 NMR-Parameter 16/88 Man unterscheidet Kopplung zwischen gleichartigen Kernen (homonukleare Kopplung) und zwischen unterschiedlichen Kernen (heteronukleare Kopplung) und zwischen direkten und Weitbereichskopplungen.
17 NMR-Parameter 17/88 Direkte Kopplungen sind im allgemeinen eine Größenordnung größer als solche über mehrere Bindungen. 1 J HH = 276 Hz 2 J HH = Hz 3 J HH = Hz 4 J HH = Hz 1 J HC = Hz 2 J HC = Hz 3 J HC = Hz 4 J HC = Hz 1 J HN = Hz 2 J HN = Hz 3 J HN = Hz 4 J HN = Hz
18 NMR-Parameter 18/88 Im Spektrum zeigt sich Kopplung in Form unterschiedlicher Multiplizitäten. 2 Spins, eine Kopplung J 12 3 Spins, zwei Kopplungen J 12 und J 13
19 NMR-Parameter 19/88 In heteronuklearen Fall sind die Kopplungen jeweils gleich, die Muster ganz eindeutig ppm
20 NMR-Parameter 20/88 Im heteronuklearen Fall kann die Kopplung während der Aufnahme leicht aus dem Spektrum entfernt werden, man spricht von Entkopplung. Entkopplungssequenz 1 H 13 C 90 x
21 NMR-Parameter 21/88 Man hat dann nur noch einzelne Linien im Spektrum ppm
22 NMR-Parameter 22/88 Karplus-Kurven 3 J H NH H N CO J-Kopplung 3 J H NH =6.4 cos cos H R CO -Winkel IUPAC!! = - 300
23 NMR-Parameter 23/88 Starke vs. schwache Kopplung Schwache Kopplung liegt vor wenn J < /10. Nur bei schwacher Kopplung ist die Kopplung von der chemischen Verschiebung unabhängig. Simulation für ein 2-Spin System mit J = 10 Hz
24 NMR-Parameter 24/ ppm ppm Man kann die Effekte zur Zuordnung nutzen, denn beim Dacheffekt neigen sich die Dächer zueinander.
25 NMR-Parameter 25/88 Ein gutes Beispiel für starke Kopplung ist die Methylgruppe. Die Kopplung zwischen den Protonen ist sicher nicht 0 aber es ist im Spektrum keine Aufspaltung zu sehen.
26 NMR-Parameter 26/88 Skalare oder J- Kopplung Simulation für 3 Kerne, deren Abstand sich verringert
27 NMR-Parameter 27/88 dipolare Kopplung Die Atomkerne selber wechselwirken direkt durch den Raum als Dipol-Dipol Interaktion.
28 NMR-Parameter 28/88 Die Größe ist vom Winkel zwischen Spin-Spin- Verbindungslinie und dem Magnetfeld abhängig mit der Gleichung: D ~ (3 cos 2 jk 1)
29 NMR-Parameter 29/88 0 π dθjk sinθ jk (3 cos 2 θ jk -1) = 0 In Lösung wird durch die isotrope Bewegung über alle Winkel gemittelt und die dipolare Kopplung verschwindet. Sie taucht aber bei der Relaxation wieder auf.
30 NMR-Parameter 30/88 Relaxationszeiten Relaxation ist der Vorgang, in dem die Kerne die durch die RF-Pulse in das System eingebrachte Energie wieder abgeben. Im Gegensatz zu vielen anderen Spektroskopie-Arten gibt es dazu nicht viele Möglichkeiten außer fluktuierenden Magnetfeldern, die das Molekül selbst erzeugt. Daher sind NMR-Zustände sehr langlebig!
31 NMR-Parameter 31/88 Die fluktuierenden Magnetfelder werden durch die Bewegung der Moleküle erzeugt.
32 NMR-Parameter 32/88 Größere Moleküle bewegen sich anders als kleine Moleküle, sie haben andere Korrelationszeiten c. Dadurch werden sie auch andere Relaxationseigenschaften haben.
33 NMR-Parameter 33/88 Die zwei wichtigsten Relaxationsmechanismen sind die Dipol-Dipol-Wechselwirkung (DD) und die chemical-shiftanisotropie (CSA). Beide Mechanismen können sich gegenseitig beeinflussen. DD CSA
34 NMR-Parameter 34/88 Wir haben ja schon gesehen, dass die Kerne im Gleichgewicht in einer Bolzmannverteilung vorliegen.
35 NMR-Parameter 35/88 Pulse stören dieses Gleichgewicht und ermöglichen damit die Messung.
36 NMR-Parameter 36/88 Relaxation ist die Rückkehr des Systems in den Gleichgewichtszustand. Man beschreibt die Relaxation phänomenologisch durch zwei Zeitkonstanten, die longitudinale Relaxationszeit T 1 und die transversale Relaxationszeit T 2.
37 NMR-Parameter 37/88 Longitudinal beschreibt die Rückkehr der Magnetisierung in z-richtung in die Gleichverteilung nach Bolzmann, transversal beschreibt eine Gleichverteilung der Magnetisierungsvektoren auf dem Einheitskreis in der x,y- Ebene, was auch zum Verschwinden des Signals führt. Es gibt auch die verwirrenden Bezeichnungen Spin-Gitter und Spin-Spin Relaxation, die man aber besser nicht verwendet.
38 NMR-Parameter 38/88 longitudinale Relaxation
39 NMR-Parameter 39/88 Longitudinale Relaxation (T 1 ) M z (t) = M z (t 0 ) [ 1 2 exp(-t/t 1 )]
40 NMR-Parameter 40/88 Transversale Relaxation (T 2 ) Nach einem 90 Puls sind die Spins synchron, lokal unterschiedliche und fluktuierende Felder bringen sie aus dem Takt, die Summe ergibt irgendwann 0.
41 NMR-Parameter 41/88 Transversale Relaxation (T 2 ) M x (t) = M x (t 0 ) exp(-t/t 2 ) T 2 hat immer T 1 als Obergrenze, ist aber im allgemeinen kürzer, es bestimmt die Form der Einhüllenden.
42 NMR-Parameter 42/88 Den Weg der Vektoren kann man dann so beschreiben: T 2 ist lang, das Signal klingt langsam ab und ergibt eine scharfe Linie. T 2 ist kurz, das Signal klingt schnell ab und ergibt eine breite Linie.
43 NMR-Parameter 43/88 Der NOE-Effekt Neben der Relaxation durch Wechselwirkung der Spins mit ihrer Umgebung gibt es auch direkte Wechselwirkungen einzelner Spins untereinander, d.h. zwei Spins relaxieren sich gegenseitig und tauschen dadurch direkt Magnetisierung aus. Ein prominentes Beispiel dafür ist der Kern-Overhauser-Effekt, der NOE-Effekt (Nuclear Overhauser Enhancement). Man spricht deshalb auch von Kreuz-Relaxation.
44 NMR-Parameter 44/88 Der NOE-Effekt ist vor allem wegen der Möglichkeit Abstände zu bestimmen von großer Bedeutung, vor allem für Raumstrukturen. I (NOE) 1/r 6 Wegen des schnelle Abfalls mit r 6 können nur Abstände bis 400 pm, manchmal 500 pm bestimmt werden. r
45 NMR-Parameter 45/88 Experimente zur Bestimmung der Abstände aus dem NOE-Effekt unterscheiden sich je nach Molekülgröße. Bei kleinen Molekülen wählt man das eindimensionale NOE-Differenz-Experiment. Bei großen (Bio-) Molekülen bedient man sich des mehrdimensionalen NOESY Experimentes, das wir später noch genau kennen lernen werden.
46 Das Vektormodel
47 Das Vektormodel 47/88 Das Vektormodell ist eine semi-klassische Beschreibung von NMR-Experimenten und funktioniert gut für isolierte Spins, d.h. Spins zwischen denen keine skalare Kopplung wirkt. Mathematischer Formalismus sind die Blochgleichungen. F. Bloch Phys. Rev. 70, (1946)
48 Das Vektormodel 48/88 Im Falle von Kopplung kann es nur noch in bestimmten Grenzen verwendet werden. Da viele mehrdimensionale Experimente auf Kopplung basieren stößt man schnell an diese Grenzen und es sollte nicht mehr verwendet werden. Es eignet sich aber gut zur Beschreibung von Relaxation und der Berechnung von einfachen, meist eindimensionalen Pulssequenzen und selektiven Pulsen.
49 Das Vektormodel 49/88 Man betrachtet die Magnetisierung als Vektor, der sich nach den Regeln der Vektormanipulation verhält, wenn er Magnetfelder ausgesetzt ist
50 Das Vektormodel 50/88 Die erste Art von Magnetfeldern sind die RF-Pulse, sie sind im allgemeinen recht kurz
51 Das Vektormodel 51/88 90 Puls aus x: Der Vektor dreht sich um die x- Achse nach (-y) 180 Puls aus x: Der Vektor dreht sich um die x- Achse nach (-z)
52 Das Vektormodel 52/88 Die zweite Art von Magnetfeld ist das Hauptfeld oder B 0 -Feld, das sich als chemische Verschiebung und skalare Kopplung zeigt
53 Das Vektormodel 53/88 chemische Verschiebung wirkt nur auf x,y-magnetisierung und bewirkt eine Drehung um die z-achse mit einer Frequenz 0 (der chemischen Verschiebung)
54 Das Vektormodel 54/88 0 -J/2 0 +J/2 kennzeichnet den Spinzustand des Nachbarkerns skalare Kopplung wirkt ebenfalls nur auf x,y-magnetisierung und bewirkt eine Drehung um die z-achse. Dabei bewegen sich die Vektoren um J/2 schneller oder langsamer als 0
55 Das Vektormodel 55/88 Mit den Werkzeugen kann man nun einfache NMR- 90 x Sequenzen beschreiben, H1z 90 H x viele sind building blocks für komplizietere Experimente
56 Das Vektormodel 56/88 Kerne mit unterschiedlichen chemischen Verschiebungen laufen hier unterschiedlich weit, man hat zu Beginn der Datenaufnahmen unterschiedliche Phasen und kann nicht mehr korrigieren
57 Das Vektormodel 57/88 90 x 180 y Eine einfache Pulssequenz die als building block in vielen anderen NMR-Experimenten eine Rolle spielt ist das spin echo
58 Das Vektormodel 58/88 90 x 180 y H 1z 90 H x
59 Das Vektormodel 59/88 90 x 180 y H 1z 90 H x Zunächst betrachten wir in den Wartezeiten nur chemische Verschiebung, Kopplung kommt später
60 Das Vektormodel 60/88 90 x 180 y H 1z 90 H x
61 Das Vektormodel 61/88 90 x 180 y H 1z 90 H x
62 Das Vektormodel 62/88 90 x 180 y H 1z 90 H x Der Effekt der chemischen Verschiebung ist verschwunden!!
63 Das Vektormodel 63/88 Jetzt betrachten wir homonukleare Kopplung im Vektormodell, ein Kern sieht den Zustand seines Nachbarn ( oder ), der Nachbar wird von den Pulsen auch getroffen J HH H H C C
64 Das Vektormodel 64/88 90 x 180 y H 1z 90 H x
65 Das Vektormodel 65/88 90 x 180 y H 1z 90 H x /2
66 Das Vektormodel 66/88 90 x 180 y H 1z 90 H x tauschen auch
67 Das Vektormodel 67/88 90 x 180 y H 1z 90 H x /2 Der Effekt der chemischen Verschiebung ist verschwunden, die Kopplung nicht
68 Das Vektormodel 68/88 Im Falle von heteronukleare Kopplung wird der Nachbar von den Pulsen nicht getroffen H H J HC C C
69 Das Vektormodel 69/88 90 x 180 y H 1z 90 H x Der Effekt der chemischen Verschiebung und auch der Kopplung ist verschwunden!!
70 Das Vektormodel 70/88 Mit dem Vektormodell lassen sich Experimente zur Bestimmung von Relaxationszeiten gut verstehen. Das Experiment zur Bestimmung der longitudinalen T 1 -Zeiten wir als inversion recovery Experiment bezeichnet 180 x 90 x
71 Das Vektormodel 71/88 Den Effekt des 180 Pulses haben wir uns schon angeschaut, er dreht die z-magnetisierung herum
72 Das Vektormodel 72/88 Danach warten wir einfach eine Zeit ( ) und dabei kehrt z nach z zurück
73 Das Vektormodel 73/88 Was nach vorliegt, fragen wir mit einem 90 Puls ab der z-magnetisierung in detektierbare Magnetisierung verwandelt
74 Das Vektormodel 74/88 Man nimmt eine Serie von Experimenten mit unterschiedlichen Werten für auf und kann die Relaxationszeit durch Fitten der theoretischen Kurve ermitteln
75 Das Vektormodel 75/88 90 x 180 y t exp(t/t 2 ) Ein Spin-Echo-Sequenz wird für die Messung der Relaxationszeit T 2 verwendet. Man nimmt mehrere Experimente mit unterschiedlichen Werten für auf und trägt die Intensität gegen die Zeit auf. Chemische Verschiebung würde aber zu unterscheidlichen Phasen im Spektrum führen, daher der 180 Puls
76 Gradienten
77 Gradienten 77/88 Wir haben jetzt gesehen das Pulse eine Art Handwerkszeug sind um Magnetisierung zu manipulieren. Richtig zusammengefügt mit Wartezeiten zwischen den Pulsen entstehen Pulssequenzen, mit denen wertvolle Information über eine Molekül erhalten werden kann. Neben Pulsen und Wartezeiten gibt es noch eine weiteres Werkzeug, die sogenannten (Feld-) Gradienten
78 Gradienten 78/88 Gradienten Probe Spule Hauptfeld z Gradienten stellen kontrollierte Störungen der Homogenität des Hauptmagnetfeldes dar. Die Stärke des Magnetfeldes und damit die Resonanzfrequenz wird damit von der Position des Moleküls in der Spule abhängig Gradient B = (1 + z) B 0 = - B = - (1 + z) B 0
79 Gradienten 79/88 1 H Normalerweise ist die chemische Verschiebung eines speziellen Kerns in allen Molekülen in der Probe gleich, alle Signale addieren sich auf, weil die Homogenität der Probe durch den sogenannten Shim sicher gestellt wird.
80 Gradienten 80/88 Wenn wir eine Spulenlänge von 2 cm und einen typischen Gradienten von 50 Gs/cm annehmen dann haben wir einen Unterschied von B = 10 mt ( 1 Gs = 0.1 mt) zwischen oberem und unterem Ende der Probe. Das gyromagnetische Verhältnis für Wasserstoff ( 1 H) z Hauptfeld ist =26.75 * 10 7 rad/st. In einem Magnetfeld von 14.1 T haben wir also eine Frequenz von = /2 = B/2 = 600 MHz = 700 ppm Mit B = 10 mt ergibt sich = 425 khz, was ~700 ppm entspricht. Feldgradient
81 Gradienten 81/88 1 H G z z Somit ist die chemische Verschiebung vom Ort abhängig, alle Signale in der Probe ergeben in der Summe 0
82 Gradienten 82/88 Wie kann man Gradienten konstruktiv einsetzen? 1 H /2 /2 G z 1 : 1 Wir wissen, dass ein 180 Puls die chemische Verschiebung refokussiert, er beseitigt also auch den Effekt von zwei gleichen Gradienten
83 Gradienten 83/88 Wir bemühen wieder unsere drei Linien, nur diesmal gehören sie zum gleichen Kern in unterschiedlichen Positionen der Probe und haben dadurch unterschiedliche Frequenzen y z x Wir schauen uns das mit dem Vektormodel an
84 Gradienten 84/88 /2 /2 y x Die unterschiedlichen Positionen in der Probe ergeben am Ende doch wieder die gleiche Position der Magnetisierung und die Signale addieren sich auf.
85 Gradienten 85/88 1 H /2 /2 G z 1 : -1 In der hier gezeigten Anordnung addieren sich die Gradienten für die Magnetisierung auf, das Signal wird zerstört, die Störung des Gesamtmagnetfeldes bleibt aber gering.
86 Gradienten 86/88 Im Vektormodel sieht das so aus: Die Positionen sind unterschiedlich, es kommt zur Auslöschung
87 Gradienten 87/88 1 H /2 /2 G z 1 : 1 Verwendet man nun eine Puls der nicht alle Signale triff (einen selektiven Puls), dann werden nur die Signale erhalten bleiben, für die der Puls die Wirkung der Gradienten aufhebt. Das wird z.b. für Messungen in Wasser genutzt, um das Lösungsmittelsignal zu entfernen
88 That s it Fragen: schmieder@fmp-berlin.de Scripte: schmieder.fmp-berlin.info/teaching/vorlesung_mbph.htm
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