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1 Jürgen Henrich (Autor) Erstellung segmentspezifischer molekularer Marker mittels Mikrodissektion und physikalische Kartierung der Resistenz gegen Schadinsekten (Diatraea spp.) bei tropischem Mais (Zea mays L.) Copyright: Cuvillier Verlag, Inhaberin Annette Jentzsch-Cuvillier, Nonnenstieg 8, Göttingen, Germany Telefon: +49 (0) , Website:

2 i...i Abkürzungsverzeichnis... v 1. Einleitung Material Pflanzenmaterial Bakterienstämme Chemikalien Nukleinsäuren Enzyme Reaktionssysteme Verbrauchsmaterial Geräte Fotomaterial Methoden Pflanzenanzucht Fixierung von Ausgangsmaterial zur Chromosomenpräparation Antherenfixierung Wurzelfixierung Präparation von Chromosomen Pachytänchromosomen Mitotische Metaphasechromosomen Mikrodissektion Vorbereitung von Glasnadeln und Objektträgern Isolierung von Chromosomensegmenten Mikroamplifikation dissektierter Chromosomensegmente Mikroamplifikation mittels Linkeradapter-PCR (LA-PCR) Proteinase K-Behandlung Restriktionsverdau und Linkeradapter-Ligation Linkeradapter-PCR (LA-PCR) Mikroamplifikation mittels degenerate-oligonucleotide-primed-pcr. 18

3 ii Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationen bei der PCR-Amplifikation Standardtechniken Restriktionsverdau Agarosegelelektrophorese DNA-Transfer nach SOUTHERN Koloniefilter Dot-Blot Filter Markierung von DNA Nicktranslation PCR-Markierung DNA-DNA Hybridisierung, nichtradioaktiv DNA-DNA-Hybridisierung, radioaktiv Aufreinigung von DNA-Fragmenten Klonierung von LA-PCR-Produkten Linearisierung und Dephosphorylierung von Plasmidvektoren Ligation Transformation Herstellung von Linkeradaptern DNA-Isolierung Isolierung von Plasmid- und Cosmid-DNA Isolierung genomischer Mais-DNA Southern-Hybridisierung und genetische Kartierung von Klonen aus der Mikroamplifikation Physikalische Kartierung molekularer Sonden Analyse einer Cosmidbibliothek aus genomischer Mais-DNA Sondenvorbereitung Isolierung spezifischer Cosmidklone Herstellung von Kompetitor-DNA für die CISS-Hybridisierung DNaseI-Behandlung genomischer DNA Herstellung von C 0 t-1 DNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Vorbereitung der Chromosomenpräparate...30

4 iii Vorbereitung der Sonden Hybridisierung Signaldetektion Ergebnisse Präparation und Identifikation von Chromosomen Pachytänchromosomen Ausgangsmaterial Präparation Identifikation Mitotische Metaphasechromosomen Ausgangsmaterial Präparation Identifikation Optimierung der Mikroamplifikation dissektierter Chromosomensegmente Bestimmung der Herkunft von DNA-Kontaminationen in der LA-PCR Mikrodissektion und -amplifikation mittels LA-PCR Klonierung des LA-PCR Produktes Analyse der Amplifikationsprodukte und der rekombinanten Klone Verminderung der Amplifikation von DNA-Kontaminationen Modifizierung der Mikroamplifikation mittels LA-PCR Mikroamplifikation mittels degenerate-oligonucleotideprimed-pcr Mikroamplifikation mit optimiertem LA-PCR Protokoll Analyse und Klonierung der Mikroamplifikationsprodukte Relokalisation mittels CISS-Hybridisierung Klonierung von LA-PCR Produkten Transformation der LA-PCR Produkte zu segmentspezifischen DNA-Bibliotheken Analyse der segmentspezifischen DNA-Bibliotheken Bestimmung des Anteils B-chromosomenspezifischer Sequenzen in den Bibliotheken Southern-Hybridisierungen vorselektierter Klone Physikalische Kartierung molekularer Marker... 59

5 iv Isolierung spezifischer Cosmidklone CISS-Hybridisierung von Cosmidklonen Vergleich zwischen genetischer Distanz und physikalischer Position molekularer Marker auf Chromosomen Diskussion Präparation, Mikrodissektion und -amplifikation von Chromosomen Chromosomenmikrodissektion Mikroamplifikation dissektierter Chromosomensegmente Analyse und Klonierung der Mikroamplifikationsprodukte Relokalisation mittels CISS-Hybridisierung Erzeugung und Analyse segmentspezifischer DNA-Bibliotheken Physikalische Kartierung molekularer Marker CISS-Hybridisierung von Cosmidklonen zur physikalischen Kartierung Vergleich zwischen genetischer und physikalischer Distanz molekularer Marker Erstellung segmentspezifischer molekularer Marker mittels Mikrodissektion und physikalische Kartierung durch CISS-Hybridisierung? Zusammenfassung Literatur...88 Curriculum vitae...99

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