Ein neuer Ansatz der Probenvorbereitung

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1 Ein neuer Ansatz der Probenvorbereitung Michael Vogeser und Uwe Kobold Institut für Klinische Chemie, Klinikum der Universität München und Roche Diagnostics, Penzberg

2 Die Probenvorbereitung bestimmt wesentlich Praktikabilität, Robustheit und analytische Zuverlässigkeit einer LC-MS/MS-Methode. Vollständige Automation des Analysenprozesses Voraussetzung für eine umfangreiche Anwendung LC-MS/MS-Technologie in der medizinischen Diagnostik

3 Reinheit der Extrakte Automatisierung Flüssigphasen-Extraktion gut, konzentr. möglich sehr schwierig Proteinfällung schlecht schwierig Proteinfiltration schlecht schwierig Festphasenextraktion gut, konzentr. möglich nicht einfach

4 Reinheit der Extrakte Automatisierung Flüssigphasen-Extraktion gut, konzentr. möglich sehr schwierig Proteinfällung schlecht schwierig Proteinfiltration mäßig schwierig Festphasenextraktion gut, konzentr. möglich nicht einfach Probleme bei der vollständigen Automation der Festphasen-Extraktion: Großes Volumen von festen und flüssigen Verbrauchsmaterialien Mechanisches Handling von Extraktions-Kartuschen, Vakuum oder Überdruck, technisch anspruchsvoll

5 Automatisation von Immunoassays:

6 Automatisation von Immunoassays: Antikörper-beschichtete, ferromagnetische Mikropartikel dominierende Technologie

7 Automatisation von Immunoassays: Antikörper-beschichtete, ferromagnetische Mikropartikel dominierende Technologie ferromagnetische Mikropartikel zur DNA-Extraktion

8 Automatisation von Immunoassays: Antikörper-beschichtete, ferromagnetische Mikropartikel dominierende Technologie ferromagnetische Mikropartikel zur DNA-Extraktion ferromagnetische Mikropartikel für die Probenvorbereitung in der Massenspektrometrie?

9 Ferromagnetische Mikropartikel für die Probenvorbereitung bei Proteom-Analysen

10 Ferromagnetische Mikropartikel für die Probenvorbereitung bei Proteom-Analysen:

11 Ferromagnetische Mikropartikel für die Probenvorbereitung bei Proteom-Analysen: Nicht-quantiative Analyse von Makromolekülen

12 Ferromagnetische Mikropartikel: Anwendbar für die Probenvorbereitung von quantitativen Analysen kleiner Moleküle?

13 Ferromagnetische Mikropartikel: Anwendbar für die Probenvorbereitung von quantitativen Analysen kleiner Moleküle? Kommerziell verfügbar: C18-modifizierte ferromagnetische Mikropartikel Dynabeads u.a. von Dynal / Invitrogen 1 µm Durchmesser Magnet-Extraktor

14 Ferromagnetische Mikropartikel: Anwendbar für die Probenvorbereitung von quantitativen Analysen kleiner Moleküle? Kommerziell verfügbar: C18-modifizierte ferromagnetische Mikropartikel Dynabeads u.a. von Dynal / Invitrogen 1 µm Durchmesser Magnet-Extraktor Machbarkeitsstudie: Extraktion von Itraconazol aus Plasma mit Mikropartikeln und Quantifizierung mittels LC-MS/MS

15 Arbeitsablauf (Konditionieren der Partikel, Verdünnen Arbeitssuspension in Wasser) 10 µl I.S. in 1.5 ml Eppendorf vorlegen, 10 µl Plasma-Probe zufügen, mixen 100 µl Partikel-Suspension zugeben, mixen Partikel mit Magneten immobilisieren Matrix abnehmen Waschlösung zugeben, Magnet entfernen, Partikel resuspendieren Partikel mit Magneten immobilisieren Waschlösung abnehmen Elutionslösung zugeben, Magnet entfernen, Partikel resuspendieren Partikel mit Magneten immobilisieren Extrakt abnehmen und in HPLC-Vial zur LC-MS/MS-Analyse überführen

16 Dynal Magnetseparator

17 Untersuchung von Recovery und Reinheit / Ion suppression: Direkte Injektion von Itraconazol-Reinsubstanz in LC-MS/MS ( MRM-Peak-Area) vs. Peak-Area einer aufgestockten Plasma-Probe gleicher Konzentration.

18 Untersuchung von Recovery und Reinheit / Ion suppression: Direkte Injektion von Itraconazol-Reinsubstanz in LC-MS/MS ( MRM-Peak-Area) vs. Peak-Area einer aufgestockten Plasma-Probe gleicher Konzentration. 125 µg Partikel zur Extraktion von 10 µl Plasma 95% Signal-Recovery

19 Untersuchung von Recovery und Reinheit / Ion suppression: Direkte Injektion von Itraconazol-Reinsubstanz in LC-MS/MS ( MRM-Peak-Area) vs. Peak-Area einer aufgestockten Plasma-Probe gleicher Konzentration. 125 µg Partikel zur Extraktion von 10 µl Plasma 95% Signal-Recovery d.h.: Magnetpartikel: Zur Extraktion von 1 µl Probe wird 12,5 µg Extraktionsmaterial verwendet Standard-SPE: Zur Extraktion von 1 µl Probe wird 1 mg Extraktionsmaterial verwendet

20 Untersuchung von Recovery und Reinheit / Ion suppression: Direkte Injektion von Itraconazol-Reinsubstanz in LC-MS/MS ( MRM-Peak-Area) vs. Peak-Area einer aufgestockten Plasma-Probe gleicher Konzentration. 125 µg Partikel zur Extraktion von 10 µl Plasma 95% Signal-Recovery d.h.: Magnetpartikel: Zur Extraktion von 1 µl Probe wird 12,5 µg Extraktionsmaterial verwendet Standard-SPE: Zur Extraktion von 1 µl Probe wird 1 mg Extraktionsmaterial verwendet Basis-Validierung: Vier Meßserien 5-Punkt-Kalibration ( µg/l, aufgestocktes Drug-free Serum) VK 5,4% bei 111 µg/l und 7.0% bei 2652 µg/l (jew. 3-fach-Bestimmung, n=12)

21 Fazit

22 Fazit Die Probenvorbereitung mittels C18-modifizierter ferromagnetischer Mikropartikel erlaubt für einen exemplarischen niedermolekularen Analyten gut reproduzierbare LC-MS/MS-Analysen.

23 Fazit Die Probenvorbereitung mittels C18-modifizierter ferromagnetischer Mikropartikel erlaubt für einen exemplarischen niedermolekularen Analyten gut reproduzierbare LC-MS/MS-Analysen. Die Extraktion ist hoch effizient (Wiederfindung und Reinheit).

24 Fazit Die Probenvorbereitung mittels C18-modifizierter ferromagnetischer Mikropartikel erlaubt für einen exemplarischen niedermolekularen Analyten gut reproduzierbare LC-MS/MS-Analysen. Die Extraktion ist hoch effizient (Wiederfindung und Reinheit). Die Anwendung funktionalisierter ferromagnetischer Mikropartikel erscheint attraktiv für die Entwicklung eines kompletten LC-MS/MS-basierten Analysen-Systems für die Klinische Chemie.

25 Vorteil der Magnetpartikeltechnologie für die Automation: Minimierung des Bedarfs an Extraktionsmaterial Feste Phase der Extraktion kann als Flüssigkeit manipuliert werden, keine aufwändige Mechanik

26 Vorteil der Magnetpartikeltechnologie für die Automation: Minimierung des Bedarfs an Extraktionsmaterial Feste Phase der Extraktion kann als Flüssigkeit manipuliert werden, keine aufwändige Mechanik Implementierung des Extraktionsprinzips auf ein Liquid-Handling-System mit direkter Koppelung an ein LC-MS/MS-System

27 Vorteil der Magnetpartikeltechnologie für die Automation: Minimierung des Bedarfs an Extraktionsmaterial Feste Phase der Extraktion kann als Flüssigkeit manipuliert werden, keine aufwändige Mechanik Implementierung des Extraktionsprinzips auf ein Liquid-Handling-System mit direkter Koppelung an ein LC-MS/MS-System Vogeser M, Geiger A, Herrmann R, Kobold U Sample preparation for liquid chromatography-tandem mass spectrometry using functionalized ferromagnetic micro-particles Clin Biochem, on-line first

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