Station 1. Analyse von strahleninduzierten DNA-Schäden durch Gel-Elektrophorese

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1 Station 1 Analyse von strahleninduzierten DNA-Schäden durch Gel-Elektrophorese

2 Inhalt Inhalt...1 Analyse von strahleninduzierten DNA-Schäden durch Gel-Elektrophorese...2 Worum es geht:...2 DNA...2 Plasmid zur Untersuchung von Strahlenschäden...2 Die Elektrophorese...3 Durchführung des Experiments...4 1) Sicherheitshinweis:...4 2) Herstellen des Gels für die Elektrophorese...4 Vorbereitung der Elektrophoresekammer...5 3) Durchführung der Elektrophorese...7 Übung zum Umgang mit der Pipette...7 Vorbereitung der DNA-Proben...8 Auftragen der Proben...8 Start der Elektrophorese...9 4) Färbung der DNA ) Auswertung der DNA-Schäden...13 Scannen des Gels...13 Bestimmung der Häufigkeit unterschiedlicher DNA-Schäden...14 Auswertung der Häufigkeit der DNA-Schäden

3 Analyse von strahleninduzierten DNA-Schäden durch Gel- Elektrophorese Worum es geht: An der GSI wurde eine weltweit neuartige Krebstherapie mit Ionenstrahlen entwickelt. Dazu werden in mehreren hundert Meter langen Beschleunigern Kohlenstoff-Ionen auf bis zu 50 Prozent der Lichtgeschwindigkeit beschleunigt und dann millimetergenau auf Tumoren, hauptsächlich Kopftumoren, geschossen. Die Therapie wird seit einigen Jahren an der GSI sehr erfolgreich eingesetzt. Voraussetzung dazu war jahrzehntelange Grundlagenforschung über die Wirkungsweise von Ionenstrahlen bzw. allgemein schweren, geladenen Teilchen in Zellen und insbesondere auf die DNA. Dazu wird physikalische Wirkung und die daraus resultierenden biologischen Effekte, die Ionenstrahlen in Zellen auslösen mit der Wirkung von Röntgenstrahlen verglichen, die als Standardmethode eingesetzt werden. In diesem Versuch können Sie die Schädigung von mit Röntgenstrahlen bestrahlten DNA- Proben mit der Methode der Gel-Elektrophorese untersuchen. DNA DNA steht als Abkürzung für Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid). Es ist ein großes Molekül, das als Träger der Erbinformation einer Zelle dient. In menschlichen Zellen treten die DNA-Moleküle (verbunden mit Proteinen) als Chromosomen im Zellkern auf. In Bakterienzellen gibt es keinen echten Zellkern, aber einen zentralen Bereich, der einem Zellkern entspricht (das so genannte Kernäquivalent). Dort befinden sich die "Bakterienchromosomen" bzw. die chromosomale DNA. Zusätzlich treten in Bakterienzellen DNA-Moleküle auf, die sich außerhalb des Kernäquivalents frei im Zytoplasma bewegen. Diese werden Plasmide genannt. Plasmid zur Untersuchung von Strahlenschäden DNA-Moleküle sind als Doppelhelix aufgebaut. Strahlung kann bewirken, dass ein Strang oder beide Stränge zerstört werden (Einzelstrangbruch, Doppelstrangbruch). Plasmide eignen sich besonders gut zur Untersuchung der Strahlenschäden. Dies liegt daran, dass die Plasmid-DNA stark unterschiedliche Formen annimmt, je nachdem, ob keine Schädigung, ein Einzelstrangbruch oder ein Doppelstrangbruch vorliegt. Die unterschiedlichen Formen der Plasmid-DNA sind in Abbildung 1 dargestellt. Im Gegensatz zu chromosomaler DNA ist bei Plasmiden im ungeschädigten Zustand die Doppelhelix geschlossen und in sich verdrillt (supercoiled-form). Bei einem Einzelstrangbruch hebt sich die Verdrillung auf und die DNA nimmt die Form einer offenen großen Schlinge an ("offenkettige"- oder "nicked circle"-form). Bei einem Doppelstrangbruch wird das Plasmid zu einem langen Strang (lineare Form)

4 Die Elektrophorese Die Elektrophorese ist eine Methode, mit der DNA-Moleküle nach ihrer Beweglichkeit in einem Trägermedium (meist einem Gel) unterschiedenen werden können um dadurch Strahlenschäden zu analysieren. Dazu werden in der Gel-Elektrophorese bestrahlte DNA- Proben in ein spezielles Gel (Agarose-Gel) eingebracht, das wie ein feines Molekular - Sieb für Moleküle wirkt. Durch Anlegen einer elektrischen Spannung beginnen die von Natur aus elektrisch negativ geladenen DNA-Moleküle langsam durch das Gel zu wandern, und zwar mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Diese Wanderungsgeschwindigkeit hängt sehr stark davon ab, welche Form die Moleküle haben ( supercoiled, nicked circle oder linear, s.o.). Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, unterscheidet sich die Form der Plasmid-DNA-Moleküle stark, je nachdem, ob keine Schädigung, ein Einzelstrangbruch oder ein Doppelstrangbruch vorliegt. Mit der Gel-Elektrophorese können daher die unterschiedlich geschädigten DNA- Moleküle einer Probe getrennt und deren Anzahl bestimmt werden. Wenn man die unterschiedlichen Formen sieht, denkt man, dass die lineare Form am schnellsten wandert, weil sie sich gut durch das Gel schlängeln kann. Diese Vorstellung ist falsch, da bei der Bewegung von Molekülen nicht (nur) ihre Form sondern noch viele andere Dinge wichtig sind. Tatsächlich wandert die supercoiled Form am schnellsten. Die nicked circle Form ist am langsamsten, die lineare Form liegt dazwischen. Für die Auswertung der Strahlenschäden ist es darüber hinaus notwendig, die Plasmid-DNA sichtbar zu machen. Dazu werden nach der Elektrophorese Färbeverfahren angewendet. lineare nicked 1 supercoile Transmissions- Abbildung 1-3 -

5 Durchführung des Experiments 1) Sicherheitshinweis: Alle bei dem Versuch eingesetzten Chemikalien sind ungefährlich. Es besteht keine Gefahr für Sie und die Umwelt. Tragen Sie bei allen Arbeiten die zur Verfügung stehenden Laborhandschuhe, um die Proben und die Apparatur nicht zu verunreinigen! 2) Herstellen des Gels für die Elektrophorese Die für den Versuch nötigen Hilfsmittel befinden sich in den Schubladen des Rollwagens. Stellen Sie zur Herstellung des Gels folgendes bereit: - Elektrophoresekammer mit Zubehör (Abbildung 2) - TAE-Puffer, zwei Messzylinder (klein und groß), Erlenmeyerkolben, Agarose-Pulver, Wärmeschutzhandschuhe (Abbildung 3) - destilliertes Wasser (großer Behälter an der Spüle) Deckel Gelträger Elektrophores e-kammer Silikondichtungen Kamm Abbildung 2-4 -

6 Erlenmeyerkolben Wärmeschutzhandschuhe TAE-Puffer Messzylinde r Agarose- Pulver Abbildung 3 Vorbereitung der Elektrophoresekammer Vor der Herstellung des Gels müssen Sie die Elektrophoreseapparatur vorbereiten. Sie hat zwei verschiedene Funktionen. Zum einen dient sie zur Herstellung des Gels, zum anderen zur Durchführung der Elektrophorese. In diesem ersten Schritt wird sie zur Herstellung des Gels eingesetzt. Nehmen Sie den Gelträger und setzen Sie die roten Silikondichtungen bündig in die Rillen an den Rändern ein (Abbildung 4). Drücken Sie den Gelträger mit den Dichtungen auf den Tisch, damit die Dichtungen fest eingepresst werden. Die Gummidichtungen dürfen nicht überstehen! Setzen Sie nun den Gelträger in die Elektrophoresekammer ein, sodass die Dichtungen an der Wand anliegen. Drücken Sie den Gelträger mit einiger Kraft bis auf den Boden der Kammer (Abbildung 5). Dichtungen bündig! Abbildung 4 Abbildung 5-5 -

7 Herstellen der TAE-Pufferlösung Arbeiten Sie an der Spüle. Messen Sie 35 ml TAE-Puffer im kleinen Messzylinder ab und füllen ihn anschließend in den großen Messzylinder um. Geben Sie nun in den großen Messzylinder destilliertes Wasser hinzu, sodass sich insgesamt 350 ml ergeben. Diese 350 ml TAE-Pufferlösung benötigen Sie in diesem Versuch für zwei Schritte: Zum einen zur Herstellung des Gels und zum anderen zur Durchführung der Elektrophorese. Herstellen des Gels In Eppendorfhütchen ist Agarose in Mengen zu je 0,3 g vorhanden (Abbildung 3). Leeren Sie den Inhalt eines Eppendorfhütchens in den Erlenmeyerkolben. Messen Sie im kleinen Messzylinder 40 ml der zuvor hergestellten TAE-Pufferlösung ab und geben diese hinzu. Erwärmen Sie die Lösung in der Mikrowelle bis sie kocht (Einstellungen: 530W, 1-2min). Ziehen Sie die Wärmeschutzhandschuhe an und schwenken Sie den Erlenmeyerkolben, um die Agarose vollständig zu lösen. Falls noch kleine Partikel zu sehen sind, kochen Sie die Lösung noch einmal auf. Wiederholen Sie den Prozess so lange, bis die Lösung vollkommen klar ist. Lassen Sie die Lösung etwa ein bis zwei Minuten abkühlen bis Sie den Erlenmeyerkolben mit der Hand ohne Handschuh anfassen können ohne sich zu verbrennen. Gießen Sie nun das noch flüssige Gel vorsichtig in den vorbereiteten Gelträger in der Elektrophoresekammer (Abbildung 6). Luftblasen müssen vermieden werden. Sofort nach dem Gießen müssen Sie den Kamm in die Schlitze nahe der Wand, mit den Schrauben nach innen einsetzen (Abbildung 7). Durch den Kamm entstehen Aussparungen bzw. Taschen in dem später erstarrten Gel, in die die DNA-Proben für die Elektrophorese eingebracht werden können. Abbildung 6 Abbildung 7 Danach muss das Agarose-Gel bei Raumtemperatur etwa 20 Minuten erstarren. Währenddessen die Kammer nicht mehr bewegen! - 6 -

8 Reinigen Sie nun den Erlenmeyerkolben mit Leitungswasser. Spülen Sie den Kolben danach mit destilliertem Wasser aus! Während das Gel erstarrt, können Sie sich mit der Pipette vertraut machen und die DNA Proben mit dem loading buffer versetzen (s. nächster Punkt). 3) Durchführung der Elektrophorese Zur Untersuchung von DNA-Schäden mit Elektrophorese stehen Ihnen mehrere mit Röntgenstrahlung bestrahlte Proben Plasmid DNA zur Verfügung (Abbildung 8). bestrahlte Proben loading buffer Übung zum Umgang mit der Pipette Abbildung 8 Bevor Sie die echten Proben zur Elektrophorese bereitstellen, sollten Sie mit destilliertem Wasser den Umgang mit der Pipette üben. (Dazu können Sie die Zeit nutzen, in der das Gel erstarren muss.) Für den Versuch steht Ihnen eine verstellbare Eppendorfpipette im Volumenbereich von 2-20 µl zur Verfügung (Abbildung 9). Der Verstellring ist unterhalb der gelben Kappe. In einem Sichtfenster ist das eingestellte Volumen ablesbar: oberhalb des gelben Striches ganze Mikroliter, unterhalb die Nachkommastellen. Zum Pipettieren stecken Sie eine durchsichtige Spitze fest auf (Abbildung 10). Der Bedienknopf der Pipette hat zwei Druckpunkte. Drücken Sie den Bedienknopf bis zum ersten Anschlag, tauchen Sie die Pipettenspitze in die gewünschte Flüssigkeit und lassen den Bedienknopf langsam zurückgleiten. Zur Flüssigkeitsabgabe den Bedienknopf langsam bis zum ersten Anschlag drücken und anschließend zur völligen Entleerung ganz herunterdrücken. Den Knopf solange gedrückt halten bis die Pipettenspitze komplett aus der Flüssigkeit gezogen wurde. Erst dann den Bedienknopf hochgleiten lassen. Die benutzte Pipettierspitze können Sie mit einer speziellen Taste abwerfen, ohne sie zu berühren. Die Übung können Sie mit destilliertem Wasser und verschiedenen Volumeneinstellungen durchführen

9 Taste zum Abwerfen der Pipettierspitze Bedienknopf Verstellring Anzeigefenster 12,00 µl Bedienknopf Abbildung 9 Abbildung 10 Vorbereitung der DNA-Proben Zur Untersuchung stehen Ihnen acht Eppendorfgefäße mit 10µl unterschiedlich bestrahlter Plasmid-DNA Proben zur Verfügung (Abbildung 8). Die Bestrahlungsintensität ist in der Einheit Gray (Gy = Joule / kg) handschriftlich auf den Deckeln der Eppendorfgefäße vermerkt.100 Gy bdeuten also, dass ein kg dieser DNA mit 100 Joule bestrahlt wurde Geben Sie mit der Pipette zu jeder Plasmidprobe 2µl loading buffer hinzu. Streifen Sie den loading buffer in der oberen Hälfte der Eppendorfgefäße ab. Verschließen sie danach das Eppendorfgefäß sorgfältig. Durch Aufklopfen des Eppendorfgefäßes auf den Labortisch müssen Sie die Tropfen mit der Plasmidprobe mischen. Die Hinzugabe des farbigen loading buffer hat zwei Gründe. Erstens wird damit die Probe beschwert, um sie in die Taschen des Gels einbringen zu können und zweitens um später die Durchführung der Elektrophorese mit dem bloßen Auge optisch zu überprüfen. Auftragen der Proben Nun wird die Elektrophoresekammer zur eigentlichen Elektrophorese vorbereitet. Nehmen Sie, sobald das Gel erstarrt ist, den Gelträger mit dem Gel aus der Elektrophoresekammer und entfernen Sie die roten Silikondichtungen. Setzen Sie nun den Gelträger so in die Kammer ein, dass der Kamm über dem roten Balken platziert ist (Abbildung 11). Abbildung

10 Füllen Sie nun die restliche TAE-Pufferlösung in die Apparatur, sodass das Gel mit der Lösung bedeckt ist, aber die maximale Füllhöhe (Max Fill) nicht überschritten wird. Entfernen Sie nun den Kamm durch vorsichtig ruckelnde Bewegungen. Mit der Pipette können Sie nun die Plasmidproben in die durch den Kamm erzeugten Taschen in das Gel einbringen (Abbildung 12 und 13). Stellen Sie dazu mit dem Verstellring an der Pipette 12 µl ein. Benutzen Sie jedes Mal eine neue Pipettenspitze, um die Proben nicht zu vermischen! (Benutzte Pipettenspitzen können in den normalen Müll). Füllen Sie die höchstbestrahlte Probe in die Tasche nahe dem elektrischen Anschluss ein. Dabei ist eine ruhige Hand gefragt, lassen Sie sich Zeit. Starten Sie danach sofort die Elektrophorese. Abbildung 12 Abbildung 13 Start der Elektrophorese Schließen Sie die Elektrophoresekammer mit dem Deckel. Stellen Sie sicher, dass das Netzgerät ausgeschaltet ist und dass der Drehregler gegen den Uhrzeigersinn an den Anschlag gedreht ist! Verbinden Sie die Elektrophoresekammer mit dem Netzgerät. Die Schraubanschlüsse der Kabel gehören an die Kammer und die Steckanschlüsse an das Netzgerät (Abbildung 14). Schalten Sie nun das Netzgerät ein und stellen Sie mit dem Drehregler langsam 90 V ein. Aufsteigende Blasen an beiden Enden der Apparatur zeigen, dass ein Strom fließt. Abbildung

11 Die Elektrophorese dauert etwa 40 min. Währenddessen dürfen Sie die Apparatur nicht bewegen. Während der Elektrophorese sehen Sie, wie der blaue loading buffer aus allen Taschen gleichschnell durch das Gel wandert. Dies dient zur Kontrolle, ob die Elektrophorese läuft! Die eigentlichen DNA-Proben hingegen haben sich vom loading buffer getrennt und wandern unsichtbar durch das Gel, von der Kathode (-) in Richtung Anode (+). Während die Elektrophorese läuft sollten Sie die Auswertung des Gels üben. Eine Probeaufnahme von einer früher durchgeführten Elektrophorese ist im Computer gespeichert. Üben Sie die Auswertung an dieser Probe. Genau Anweisungen wie Sie dabei vorgehen (und mit Ihrem eigenen Gel wenn es fertig ist ebenfalls) finden Sie auf Seite 14 dieser Anleitung. Nachdem der loading buffer ungefähr den halben Weg durch das Gel zurückgelegt hat, können Sie die Elektrophorese beenden. Stellen Sie dazu mit dem Drehregler die Spannung auf 0 V herunter und schalten Sie danach das Netzgerät aus. Trennen Sie anschließend die Kabel von den Geräten. 4) Färbung der DNA Den Lauf der Elektrophorese konnten Sie durch den beigemischten loading buffer optisch kontrollieren. Die eigentlichen DNA-Proben hingegen sind unsichtbar hinter dem loading buffer durch das Gel gewandert. Für die Auswertung der DNA-Schäden ist es nun notwendig, die DNA-Proben anzufärben. Dazu wird das Gel in eine Farblösung gelegt. Anschließend wird es ausgewaschen bzw. entfärbt, während das Färbemittel in den DNA- Proben hängen bleibt. Stellen Sie für die Färbung der DNA verschiedene Wannen und die Färbelösung bereit (Abbildung 15 und 16). Färbewanne Schutzwann e Entfärbewanne Färbelösung Abbildung 15 Abbildung

12 Führen Sie die folgenden Arbeiten an der Spüle in der roten Schutzwanne durch. Entnehmen Sie das Gel vorsichtig (es bricht leicht) aus dem Gelträger und legen es in die Färbewanne (Abbildung 17). Achten Sie hierbei und bei späteren Arbeiten darauf, dass Sie das Gel nicht umdrehen. Es sollte immer dieselbe Seite oben bleiben! Füllen Sie in die Färbewanne so viel Färbelösung ein, dass das Gel bedeckt ist. Warten Sie etwa 15 Minuten. Entnehmen Sie das gefärbte Gel und füllen Sie die Färbelösung wieder in die Flasche zurück. Abbildung 17 Abbildung 18 Legen Sie nun das gefärbte Gel in die Entfärbewanne und füllen Sie dort destilliertes Wasser ein, sodass das Gel gut bedeckt ist. Durch häufiges Schwenken müssen Sie das Gel entfärben (Abbildung 18). Dies dauert etwa min. Dabei sollten Sie das Wasser mindestens 2-3 wechseln, indem sie das Wasser aus dem Ablasshahn ablassen. Während des Entfärbens wird das Gel immer heller, während die DNA-Proben gefärbt bleiben. Sie sollten immer deutlicher zu erkennen sein. Nach erfolgreichem Entfärben sollte ein Muster wie in Abbildung 19 (unten) zu erkennen sein. Sie erkennen, dass aus den Gel-Taschen DNA-Moleküle unterschiedlich weit gewandert sind, je nach Art der Schädigung. In Abhängigkeit der Bestrahlungsdosis verändert sich das Verhältnis zwischen den verschiedenen DNA-Schäden, zu erkennen an der unterschiedlich starken Färbung. Reinigen Sie anschließend die gebrauchten Laborgeräte mit destilliertem Wasser!

13 Geltaschen Schematische Darstellung des gefärbten Gels nach der Elektrophorese Abbildung

14 5) Auswertung der DNA-Schäden Es ist ausgesprochen wichtig, dass Sie die nachfolgenden Arbeitsschritte genau so durchführen wie angegeben. Die Auswertung funktioniert sonst nicht. Scannen des Gels Auf dem entfärbten Gel sehen Sie, dass die Menge (Intensität) der verschiedenen DNA- Schäden von der Bestrahlungsdosis abhängt. Um dies genau zu analysieren können Sie mit einem Scanner ein digitales Bild des Gels herstellen. Gehen Sie dazu wie folgt vor: Legen Sie das Gel vorsichtig in die vorbereiteten durchsichtigen Folien. Achten Sie darauf, dass möglichst keine Luftblasen entstehen (Abbildung 20) Legen Sie das Gel in der Folie auf den Scanner (Abbildung 21). Dazu müssen Sie das Gel so wenden, dass die Oberseite des Gels auf der Scannerplatte liegt, die Geltaschen vorne und die hochbestrahlten Proben rechts liegen. Schalten Sie den Scanner auf der Geräterückseite hinten links ein. Abbildung 20 Abbildung 21 Loggen Sie sich auf dem PC ein. Benutzername und Passwort erfahren Sie von den Betreuern. Starten Sie das Programm ScanWizard5 ( Symbol auf der Arbeitsoberfläche). Stellen Sie für die folgenden Menupunkte ein (Abbildung 22): Original: Film, Positiv Bildtyp: Grau Verwendung: Laserdruck (Standard): 300 dpi Ausgabegröße: 100 %

15 Markieren Sie den Bereich auf dem Gel, der ausgewertet werden soll, mit einem Rahmen in dem Vorschaubild. Der Rahmen muss alle gefärbten DNA-Proben umfassen (Abbildung 22). Scannen Sie nun das Gel mit dem Button Scanziel. Geben Sie als Scanziel Q:/Eigene Dateien/Experimente/Station_1 an und wählen Sie den Dateityp Tagged Image File Format (*.TIF). Wählen Sie dazu selbst einen geeigneten Dateinamen. Markierungs- Rahmen Abbildung 22 Bestimmung der Häufigkeit unterschiedlicher DNA-Schäden Aus dem digitalisierten Bild des Gels können Sie nun die Häufigkeiten (Intensitäten) der unterschiedlichen DNA-Schäden in Abhängigkeit der Bestrahlungsdosis bestimmen. Dazu steht Ihnen ein spezielles Analyseprogramm mit vorbereiteten Analyse-Prozeduren zur Verfügung. Diese Schritte können sie mit Ihrem eigenen Gel wenn es fertig ist oder zur Übung mit dem gespeicherten Scan einer früheren Elektrophorese zum Üben durchführen. Gehen Sie folgendermaßen vor: Starten Sie das Bildauswerteprogramm Scion Image ( Symbol auf der Arbeitsoberfläche). Öffnen Sie nun die von Ihnen mit dem Scanner aufgenommene Datei. (Zum Üben alternativ auch: F:\Scan\Beispiel\beispiel.tif) Optimieren Sie den Bildkontrast mit Process Enhance Contrast). Laden Sie die vorbereitete Auswerteprozedur: Special Load Macros F:\Scan\Gelanalyse.txt

16 Markieren Sie die gefärbten DNA-Proben auf dem Gel: Dazu muss im Fenster Tools das ROI Selection Tool (s. rechts) angeklickt sein. Danach wird bei gedrückter linker Maustaste ein Bildrahmen von knapp links oberhalb bis knapp rechts unterhalb der gefärbten DNA-Proben gezogen (ähnlich wie beim Scannen). Führen Sie nun folgende vorbereitete Prozedur aus: Special Autoexecute. Dieser Makrobefehl teilt den markierten Bereich in 8 gleichgroße Teilbereiche ein (Abbildung 23) und erzeugt für jeden Teilbereich ein so genanntes Profilhistogramm. Das bedeutet, die Intensität der Schwärzung wird für jeden der acht Bereiche in einem Höhenprofil dargestellt (Abbildung 24). In den Profilhistogrammen sind bei niedrigen Dosen zwei Maxima erkennbar, ab etwa 400 Gy sollten drei sichtbar sein. Abbildung 23 Abbildung

17 Die in den Profilhistogrammen erkennbaren Maxima sind umso höher je größer die Schwärzung an dieser Stelle ist. Sie sind also ein Maß für die Menge an DNA an dieser Stelle. Da Sie wissen an welchen Stellen sich die DNA befindet, die ungeschädigt ist bzw. einen Einzel oder Doppelstranbruch aufweist, können sie den Versuch damit auswerten Um die DNA-Schäden quantitativ zu analysieren, müssen Sie nun die Flächen unter den Maxima bestimmen. Wählen Sie dazu im Fenster Tools das Line Drawing Tool (s. rechts). In die Profilhistogramme können Sie nun Linien einzeichnen. Tun Sie dies so, dass jedes einzelne Maximum durch eine Linie lückenlos verschlossen wird (Abbildung 25).Die Striche können ruhig rechts und/oder links überstehen. Linie Abbildung 25 Nun können Sie die Flächen unter den Maxima bestimmen. Wählen Sie dazu im Fenster Tools das Wand Tool (s. rechts) aus. Sie können nun in den Profilhistogrammen die Maxima eines nach dem anderen anklicken. Dabei müssen Sie genau in den von den Strichen markierten Bereich hineinklicken, nicht rechts oder links daneben! Die Maxima werden mit einer fortlaufenden Nummer versehen und die dazugehörige Fläche wird in einem separaten Fenster Results angezeigt (als normierte Zahlen ohne Einheiten). Werden Maxima irrtümlich markiert, so kann der Integrationsschritt über den Menüpunkt Analyze Reset ggf. zurückgesetzt und wiederholt werden. Wenn Sie alle Ergebnisse im Fenster Results angezeigt bekommen, ordnen Sie die Elemnete auf dem Bildschirm so, dass Sie sowohl die Profilhistogramme als auch das Bild Ihres Scans und die Results vollständig sehen können. Stellen Sie von dieser Ansicht einen Schreenshot her (Drücken Sie die dazu die Taste Druck auf der Tastatur des PC, minimieren [nicht schliessen!] Sie kurzzeitig das Programm Scion Image, öffnen Sie eine Word Datei und klicken Sie in die leere Worddatei mit der rechten Maustaste. Aktivieren Sie im aufspringenden Dialogfeld Einfügen ). Speichern Sie die Worddatei mit dem Screenshot unter Eigene Dateien/Experimente/Heutiges Datum/Station_1-16 -

18 Nachdem Sie die Worddatei geschlossen haben aktivieren Sie wieder Scion Image Speichern Sie nun die Ergebnisse mit Special Save only Data im Ordner Eigene Dateien/ Experimente/Station_1. Auswertung der Häufigkeit der DNA-Schäden Mit den Flächen der Maxima in den Profilhistogrammen können Sie nun quantitativ die DNA- Schäden in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis bestimmen. Dazu können Sie das Programm Excel benutzen. (Sie können es aber auch per Hand auf Millimeterpapier durchführen.) Starten Sie das Programm Excel und öffnen Sie Ihre Ergebnis-Datei. (Es erscheinen einige Abfragen zum Datenformat: Wählen Sie dabei die Standardeinstellungen). Berechnen Sie nun die prozentualen Anteile der verschiedenen DNA-Formen als Funktion der Bestrahlungsdosis. Tragen Sie die Ergebnisse in eine Tabelle ein und stellen Sie sie in Form eines Graphen dar. Vorschlag für Tabelle Dosis [Gy] Anteil ungeschädigte DNA (supercoiled) Anteil Einzelstrangbruch (nicked circle) Anteil Doppelstrangbruch (lineare Form) Beispiel für Graphen (hier: halblogarithmische Darstellung) 1 Anteil ungeschädigte DNA 0,1 0, Dosis [Gy]

19 Der Anteil ungeschädigter DNA als Funktion der Bestrahlungsdosis verhält sich wie eine Exponentialfunktion. In Excel können Sie durch den Befehl "Trendlinie anpassen" diese Exponentialfunktion bestimmen. Anhand der Funktion (oder rein grafisch) können Sie nun bestimmen bei welcher Strahlendosis die Hälfte aller DNA-Moleküle geschädigt sind (oder allgemeiner: Wie viel Prozent DNA-Moleküle werden je 1 Gray zusätzlicher Strahlungsdosis geschädigt). Sollte bei Ihrem Versuch schon bei geringeren Strahlungsdosen keine ungeschädigte DNA mehr vorliegen, bietet sich statt der oben beschriebenen Vorgehensweise an, den prozentualen Anteil an Einzelstrangbrüchen als Funktion der Dosis in Excel darzustellen. Einzelstrangbrüche gibt es in unterschiedlicher Häufigkeit grundsätzlich bei fast jeder Bestrahlungsdosis. Versuchen Sie falls Sie so vorgehen den Verlauf der entstehenden Kurve zu interpretieren. Genauer: Warum steigt der Anteil an Einzelstrangbrüchen zunächst an und fällt dann wieder? C:\Dokumente und Einstellungen\axel\Eigene Dateien\GSI-SL-Anleitungen ab \Anleitung_1.doc Erstelldatum :57 Zuletzt gespeichert von Axel Gruppe Zuletzt gedruckt 4/3/2006 7:28 Zuletzt gespeichert :