Sophia Buhs. Dissertation. Diplom-Biochemikerin
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1 Beeinflussung Phosphotyrosin-abhängiger Signalwege in humanen unter Einsatz von SH2-Domänen und Phosphatasen in Kombination mit dem TAT-Transduktionssystem Dissertation Zur Erlangung der Würde des Doktors der Naturwissenschaften an der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften Fachbereich Biologie der Universität Hamburg vorgelegt von Diplom-Biochemikerin Sophia Buhs Hamburg, Mai
2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Phosphorylierungen in der Signaltransduktion SH2-Domänen Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs) Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs) Die Protein-Tyrosin-Phosphatase YOPH DasTAT-Transduktionssystem Aufbau von aggregation nach Rezeptoraktivierung ADP-Signaltransduktion in Zielsetzung Material und Methoden Klonierung von SH2-Domänen und Phosphatasen in den pgex-6p-l- 14 Vektor Verwendete Reagenzien für die Klonierungen Methoden PCR Overlap-PCR Aufreinigung der PCR-Produkte Agarosegelelektrophorese Gelelution Restriktionsverdau und Aufreinigung spezifischer 17 Banden Ligation von DNA in den Vektor pgex-6p-l (für YOPH: 17 PAC4) Transformation Klone picken und ÜN-Kultur Plasmid-Isolierung (Miniprep) Sequenzierung der Plasmid-DNA Transformation der DNA in das Expressionsbakterium 19 AvBIOO Glycerolstocks 19
3 3.2. Aufreinigung und Expression von SH2-Domänen und Phosphatasen Verwendete Reagenzien für die Aufreinigung und Expression 19 von GST-Fusionsproteinen Methoden Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen Proteinbestimmung nach Bradford im ELISA-Reader bei 595 nm und 21 im Nanodrop bei 280 nm Verwendete Reagenzien für die Proteinbestimmung Methoden Proteinbestimmung nach Bradford am ELISA-Reader bei 21 OD Proteinbestimmung am Nanodrop Prescission Protease Verdau von GST-Fusionsproteinen Verwendete Reagenzien für Prescission Protease-Verdau von 22 GST- Fusionsproteinen Methoden Prescission Protease-Verdau SDS-PAGE Verwendete Reagenzien für die SDS-PAGE Methode Durchführung der SDS-PAGE Coomassie-Gelanalyse Verwendete Reagenzien für die Coomassiefärbung von SDS- 24 Gelen Methode Coomassiefärbung von SDS-Gelen Western Blot Analyse Verwendete Reagenzien für die Western Blot und für die Far 25 Western Blot Analyse Methoden Western Blot Far Western Blot Analyse mit SH2-Domänen Entfernen von Antikörpern und HRP-gekoppelten SH2-27 Domänen von PVDF-Membranen 3.8. Phosphataseaktivitätstest im modifizierten Far Western Blot 28 Verfahren und im Phosphopeptid-Assay
4 Verwendete Reagenzien für den Phosphataseaktivitätstest 28 im modifizierten Far Western Blot und im Phosphopeptidassay Methoden Modifizierte Far Western Blot Analyse zur 29 Aktivitätsmessung von Phosphatasen nach Nollau & Mayer (2001) Aktivitätsmessung von Phosphatasen im Phosphopeptid- 29 Assay 3.9. Komplexierung von Proteinen Verwendete Reagenzien für die Komplexierung von 30 Proteinen Methoden Komplexierung von GST-freien SH2-Domänen und 31 Phosphatasen Komplexierung von SH2-Domänen und Phosphatasen 31 (GST- Fusionsproteine) Komplexierung von GST Native PAGE Verwendete Reagenzien für die native PAGE Methode Native PAGE Zellkultur und Herstellung von Zellextrakt Verwendete Reagenzien für die Zellkultur und für die 33 Herstellung von Zellextrakt Methode Zellkultur von K562- und THPl-Zellen Herstellung von Zellextrakten von K562- und THP1-34 Zellen Messung der Lebendzellzahl im WSTl-Assay Verwendete Reagenzien für den WSTl-Assay Methode WSTl-Assay Mikroskopische Untersuchung von transduzierten Zellen am 36 Konfokalen-Laserscanning Mikroskop Verwendete Reagenzien für die mikroskopische 37 Untersuchung Methoden
5 Konfokale Laserscanning-Mikroskopie von K562- und 37 THPl-Zellen Konfokale Laserscanning-Mikroskopie von Aufreinigung von aus Buffy Coats und 38 Frischblutproben Verwendete Reagenzien für die Aufreinigung von Methode Aufreinigung von Aggregometrie und Stimulation von Verwendete Reagenzien für die Stimulierung von Methode Aggregometrische Messung Behandlung von mit Kinase-Inhibitoren Verwendete Reagenzien für die Behandlung von 41 mit Inhibitoren Methoden Aggregometrische Messung von, die mit 41 Kinase-inhibitoren vorinkubiert wurden Anfertigung von Proteinextrakten aus, 41 die mit Kinase-Inhibitoren vorinkubiert wurden Transduktion von mit SH2-Domänen und 42 Phosphatasen mit anschließender aggregometrischer Messung unter ADP-Stimulation Verwendete Reagenzien für die Transduktion von Methode Transduktion von und anschließende 42 aggregometrische Messung Proteinpräzipitation und Silberfärbung Verwendete Reagenzien für die Präzipitation und die 43 Silberfärbung Methode Präzipitation mit YOPH-WT und YOPH-MUT aus 43 Proteinextrakt ADP-stimulierter Silberfärbung Massenspektrometrische Analyse 44
6 3.20. Verwendete Software und Auswertung Verwendete Software Auswertung Ergebnisse Generierung von SH2-Domänen Klonierung von SH2-Domänen in den pgex-6pl-vektor Aufreinigung und Aktivitätstest von SH2-Domänen Klonierung und Aufreinigung der SH2-Domäne Super-SRC Analyse der Bindungsstärke und des Bindungsspektrums der SH2-52 Domänen SRC und Super-SRC 4.2. Generierung von Phosphatasen Klonierung und Aufreinigung der Phosphatasen YOPH, SHP2 und 55 PTPN Untersuchung der Aktivität der Phosphatase YOPH im 57 modifizierten Far Western Blot Vergleich der Aktivität der Phosphatasen YOPH, SHP2 und 59 PTPN18 im Phosphopeptidassay 4.3. Nachweis von Proteinkomplexen in der nativen PAGE Untersuchung der Komplexierung der biotinylierten Phosphatase 61 YOPH an Streptavidin mit Hilfe der nativen PAGE Untersuchung der Bildung eines Gesamtkomplexes aus YOPH, 63 Streptavidin und dem TAT-Peptid in der nativen PAGE 4.4. Überprüfung des TAT-Transduktionssystems an Leukämie-Zelllinien Untersuchung von K562- und THPl-Zellen nach Transduktion mit 65 TAT-Streptavidin-Alexa 488 im konfokalen Laserscanning- Mikroskop Konfokalmikroskopische Untersuchung von K562- und THP1-68 Zellen nach Transduktion eines Komplexes aus Phosphatase oder SH2-Domäne mit Streptavidin- Alexa 488 und dem TAT-Peptid Messung der Lebendzellzahl von transduzierten THPl-Zellen im 72 WSTl-Assay 4.5. Konfokalmikroskopische Untersuchung von TAT-Streptavidin Alexa transduzierten 4.6. ADP-Stimulation von und Aggregometrie Transduktion von SH2-Domänen in und ihre 79 Auswirkung auf die ADP-induzierte aggregation 4.8. Analyse biologischer Effekte: Transduktion der Phosphatase YOPH in 83
7 Beeinflussung der ADP-induzierten Aggregation von 83 mit YOPH Kontrolluntersuchungen: Bedeutung des TAT-Peptids und der 89 Stimulation mit ADP für die Effekte der Phosphatase YOPH Vergleich der Effekte der Wildtyp-Phosphatase YOPH mit der 91 Phosphatase-Mutante YOPH-MUT auf die ADP-induzierte Aggregation von Auswertung der Transduktionsergebnisse der Wildtyp- 93 Phosphatase YOPH und der mutierten Phosphatase YOPH-MUT YOPH-Proteinpräzipitation aus extrakten und 94 massenspektrometrische Analyse zur Identifizierung von YOPH- Bindungspartnern in 5. Diskussion Proteintransduktion unter Einsatz des TAT-Transduktionssystems: 99 Vor- und Nachteile 5.2. Transduktion von SH2-Domänen in : Biologische 101 Auswirkung auf die ADP-induzierte aggregation 5.3. Superbinder SH2-Domäne SRC: Vergleich ihrer Aktivität und 103 biologischen Wirksamkeit zur Wildtyp-SH2-Domäne SRC in Leukämiezellen und 5.4. ADP-Refraktärität von und ihre möglichen Ursachen Transduktion der Phosphatase YOPH in : Auswirkungen 105 auf die ADP-induzierte aggregation 5.6. Interpretation der Effekte von YOPH auf die ADP-induzierte 106 aggregation 5.7. Massenspektrometrische Analyse der YOPH-Proteinpräzipitation in 108 extrakt: Integrin-Linked-Kinase (ILK) ein möglicher Bindungs-partner von YOPH? 5.8. Biologische und therapeutische Bedeutung von YOPH Zusammenfassung / Summary Literaturverzeichnis Zusatzkapitel Kinase-Inhibitoren: Betrachtung der Auswirkung auf die ADP- 123 induzierte aggregation Anwendung von Inhibitoren der SRC-Kinasen auf Far Western Blot Analyse Kinase-inhibierter 125
8 9. Abkürzungsverzeichnis Ursprungsproteine der SH2-Domänen Tyrosin-Kinasen der SRC-Familie Protein-Tyrosin-Phosphatasen Aminosäuren Einheiten Präfixe Veröffentlichungen Danksagung Eidesstattliche Versicherung 134
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