Wechselwirkungen von Metallen in Biosystemen

Transkript

1 Fakultät Mathematik/Naturwissenschaften Fachbereich Chemie/Lebensmittelchemie Professur für Radiochemie Wechselwirkungen von Metallen in Biosystemen Ziel: Dieser Praktikumsversuch soll einen Einblick in die Bedeutung von Radionukliden und Schwermetallen in Biosystemen geben. Dabei soll die Wirkung von Uran, als Vertreter der Radionuklide, mit der Wirkung ausgewählter nicht radioaktiver Schwermetalle auf das Wachstum von verschiedenen Bakterienstämmen verglichen werden. Schlussendlich bietet dieser Versuch die Möglichkeit, sich mit (mikro-)biologischen Arbeitstechniken vertraut zu machen. Aufgabenstellung: Untersuchen Sie den Effekt von Uran sowie weiterer Schwermetalle auf das Wachstum vier verschiedener Bakterienstämme! Bestimmen Sie für jeden Stamm die minimale Hemmkonzentration (MHK) und die minimale bakterizide Konzentration (MBK) für die untersuchten Schwermetalle! Vergleichen Sie Ihre Ergebnisse mit den Ergebnissen der anderen Gruppen und treffen Sie Aussagen zur Toxizität von Uran im Vergleich mit anderen Schwermetallen! Durchführung: Teil A: Metalltoleranztest Jede Gruppe erhält einen fertigen Satz Agarplatten mit unterschiedlich hohen Urankonzentrationen. Darüber hinaus stellt jede Gruppe weitere Agarplatten mit vier verschiedenen Konzentrationen eines weiteren Schwermetalls her. Welche Metalle zum Einsatz kommen, entnehmen Sie bitte Tabelle 1. Für Wachstumskontrollen erhält jede Gruppe zusätzlich noch Agarplatten ohne Metallzusatz. Tabelle 1: Zuweisung der Metalle zu den Praktikumsgruppen Praktikumsgruppe Herzustellende Agarplatten Bereitgestellte Agarplatten (Tab. A1) 1 Cr U 2 Cu U 3 Cd U

2 1. Herstellung der Agarplatten Vier 500 ml-erlenmeyerkolben mit noch warmer, steriler Agarlösung erhalten vor dem Gießen unter leichtem Rühren und sterilen Bedingungen folgende sterile Lösungen (Zusammensetzung in Tabelle 2). (Jeder Kolben wird einzeln mit den Zusatzlösungen befüllt und gegossen. Die restlichen Agarsuspensionen verbleiben bis zu Ihrem Einsatz im 70 C-Brutschrank.) Tabelle 2: Zusammensetzung des Nährmediums (exakte Zusammensetzung der Lösungen siehe Tabelle A2) Lösung Agarsuspension Volumen 158 ml 10 x Salzlösung 20 ml 10 % Pepton 20 ml Glycerin 1 ml CaCl µl Thiamin 80 µl Metallsalzlösung Siehe Tabelle 3 Tabelle 3: Metallkonzentrationen und entsprechende Zugabe zu 200 ml Medium Metall Cr Cu Cd Konzentratio n im Nährmedium 0.1 mm 0.5 mm 2.0 mm 5.0 mm 0.5 mm 1.0 mm 4.0 mm 6.0 mm mm 0.1 mm 0.5 mm 2.0 mm Zugabe je Kolben 20 µl 1 M Cr-Lösung 100 µl 1 M Cr-Lösung 400 µl 1 M Cr-Lösung 1 ml 1 M Cr-Lösung 100 µl 1 M Cu-Lösung 200 µl 1 M Cu-Lösung 800 µl 1 M Cu-Lösung 1,2 ml 1 M Cu-Lösung 20 µl 1 mm Cd-Lösung 20 µl 1 M Cd-Lösung 100 µl 1 M Cd-Lösung 400 µl 1 M Cd-Lösung Nach der Zugabe aller Komponenten werden je sechs Platten jeder Metallkonzentration gegossen. Insgesamt werden 24 Platten gegossen. Luftblasen ggf. mit einer glühenden Impföse entfernen

3 Platten anschließend leicht geöffnet unter sterilen Bedingungen (in der Nähe der Brennerflamme und unter der Sterilbox) 5-10 min abkühlen lassen, anschließend abdecken und mit Gruppennummer, Metall und Konzentration beschriften! 2. Vorbereiten der Bakterienkultur Jede Gruppe erhält eine frisch gewachsene Kultur eines Bakterienstammes (Tab. A3) und erntet die Zellen aus 10 ml Kulturmedium mittels Zentrifugieren (8000*g/ 10 min) ( für den späteren Lochtest werden pro Stamm zusätzlich 100 µl Bakterienkultur in ein steriles Eppi überführt.) Während des Zentrifugierens wird die optische Dichte der übrigen Zellsuspension bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD 600 ) bestimmt. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand verworfen und das Pellet mit 10 ml steriler, physiologischer 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen (Resuspendieren und erneutes Zentrifugieren). Während dieser Zentrifugation wird anhand der ermittelten OD 600 das Volumen der 0.9% NaCl-Lösung berechnet, um die OD 600 jedes Bakterienstammes auf einen Wert von 0.5 einzustellen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen werden diese im berechneten Volumen frischer 0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert. Anschließend wird diese Zellsuspension verdünnt und aliquotiert (Abb. 1). Abbildung 1: Verdünnungsreihe der Zellsuspensionen

4 3. Beimpfen der Platten Die fertig abgekühlten Agarplatten sowie die Kontrollplatten werden nun mit den drei verschiedenen Bakteriensuspensionen beimpft (zwei Stämme erhält man fertig geerntet, gewaschen und aliquotiert von den anderen Gruppen) (Pipettierschema in Tabelle 4). Dazu werden je 50 µl der Verdünnungsstufen 3 bzw. 4 (bzw. der Verdünnungsstufe 2 bzw. 3 bei Sporosarcina sp.) mittels steriler Pipette direkt auf den Agar gegeben. (Die Bakteriensuspensionen wird zuvor noch einmal gründlich geschüttelt zur gleichmäßigen Verteilung der Bakterien in der Lösung.) Die bereitgestellten Uranplatten werden ausschließlich mit je 50 µl der Verdünnungsstufen 3 bzw. 4 (bzw. der Verdünnungsstufe 2 bzw. 3 bei Sporosarcina sp.) des eigenen Bakterienstammes beimpft Tabelle 4: Pipettierschema für 4 verschiedene Metallkonzentrationen und 3 Stämme mit je 2 Verdünnungen Agarplatten Sporosarcina sp. Pseudomonas sp. Escherichia coli Kontrolle V2 V3 V3 V4 V3 V4 Metall- Konzentration 1 Metall- Konzentration 2 Metall- Konzentration 3 Metall- Konzentration 4 V2 V3 V3 V4 V3 V4 V2 V3 V3 V4 V3 V4 V2 V3 V3 V4 V3 V4 V2 V3 V3 V4 V3 V4 Anschließend wird die Zellsuspension auf der Agarplatte mit einem Drigalskispatel verteilt (Abb. 2). Die Platten werden mit je zwei Streifen Parafilm verschlossen, um eine Kontamination mit Luftkeimen zu verhindern. Platten in Tüten verpacken (für Pseudomonas sp. separate Tüten nutzen) Inkubation bei 30 C für 2-3 Tage.

5 Stamm 4 Stamm 2 Stamm 3 Abbildung 2: Ausspateln der Zellen Teil B: Agardiffusionstest/ Lochtest Geben Sie 500 µl der ihrer Gruppe zugewiesen Metallsalzlösung in das ausgestanzte Loch einer Ihnen zur Verfügung gestellten Agarplatte (die zu verwendenden Metallsalzlösungen finden Sie in Tabelle 5). Tabelle 5: Zuweisung der Metalle zu den Praktikumsgruppen Praktikumsgruppe Verwendete Metalle Konzentration der Metallsalzlösungen 1 Cr und Co 2 Cu und Zn 3 Cd und Ni 250 mm Lagern Sie die Platte unter der Sterilbox, bis die Metallsalzlösung in den Nährboden diffundiert ist. Danach tragen Sie vier Teststämme mit einer OD 600 von 0.5 (ein weiterer Stamm wird gestellt) strichförmig (Abb. 3) mit einer Impföse auf die Agarplatte auf und verschließen Sie die Platten mit Parafilm. Inkubation bei 30 C für 2-3 Tage. Stamm 1 Bacillus Abbildung 3: Ausstrichmuster beim Agardiffusionstest/Lochtest

6 Teil C: Mikroskopie Um die eingesetzten Bakterien sichtbar zu machen, untersuchen Sie diese mit Hilfe des inversen Zeiss Lichtmikroskops. Die Bakterien können bis zu 1000fach vergrößert betrachtet werden. Über die Kamera können die Bakterien auch über einen Bildschirm beobachtet werden. Dazu werden 5 µl der Kultur OD 600 =0.5 auf einen Objektträger überführt und mit einem Deckgläschen abgedeckt (Abb. 4). Anschließend werden die Bakterien mit dem Lichtmikroskop Zeiss Axiovert S 100 vergrößert. Zunächst wird das 40 x Objektiv mit Phasenkontrast (Einstellung 2) ausgewählt und das Objektiv an den Objekttisch mit der Probe heranbewegt. Sobald die richtige Ebene mit den Bakterien gefunden ist, wird von den Bakterien mit der Kamera ein Bild gemacht. Anschließend wird das 40 x Objektiv vom Objektiv wegbewegt und die Probe vom Objekttisch entfernt. Jetzt wird mit dem Objektivwechsler das 100 x Objektiv gewählt und auf dieses Objektiv ein Tropfen Immersionsöl gegeben. Die Probe wird nun erneut auf den Objekttisch gespannt, nun aber mit dem Deckgläschen nach unten. Das Objektiv wird wieder an den Objektivtisch mit der Probe heranbewegt und die Zellen werden scharf gestellt. In dieser Vergrößerung erneut ein Bild von den Bakterien machen. Abbildung 4: Probenvorbereitung zur Lichtmikroskopie

7 Auswertung: Teil A: Metalltoleranztest 1.) Treffen Sie Aussagen über das Wachstumsverhalten der untersuchten Bakterienstämme bei bestimmten Schwermetallkonzentrationen! Zählen Sie dazu die Bakterien-Kolonien auf Ihren Agar-Platten. Wählen Sie die Verdünnungsstufe mit Kolonien pro Platte. Berechnen Sie die Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten (cfu=colony-forming units) pro ml Bakteriensuspension-Ausgangslösung für die Platten mit den verschiedenen Metallkonzentrationen sowie für die Kontrollplatten ohne zusätzliche Metalle. 2.) Vergleichen Sie ihre Ergebnisse mit den Ergebnissen der anderen Gruppen! 3.) Bestimmen Sie die MHK50 und die MBK! Teil B: Lochtest 1.) Bestimmen Sie, bis zu welchem Abstand vom Loch ein Wachstum der getesteten Stämme erfolgt! 2.) Beurteilen Sie die Empfindlichkeit der Testbakterien gegenüber dem untersuchten Metall (empfindlich [e], mäßig empfindlich [m], unempfindlich [u])! 3.) Welche Faktoren könnten die Wirkung des Metalls auf das Wachstum der Testbakterien beeinflussen? Teil C: Makroskopische und mikroskopische Charakterisierung der Bakterienstämme 1.) Treffen sie Aussagen zur Makromorphologie der untersuchten Stämme, d.h. über Farbe, Form und Oberflächenbeschaffenheit der gewachsenen Kolonien! 2.) Beschreiben sie die Mikromorphologie der untersuchten Bakterienstämme (Zellform, Zellgröße, Beweglichkeit, erkennbare Bildung von Sporen)! pro Gruppe einen USB-Stick für die Bilder mitbringen

8 ANHANG Tabelle A1: Metallkonzentrationen der bereitgestellten Agarplatten. Metall U Konzentratio n 0.1 mm 0.25 mm 0.5 mm 1.0 mm Tabelle A2: Zusammensetzung der benötigten Lösungen. Lösungen Konzentration Bestandteile Salzlösung 46,8 g/l 14,9 g/l 10,7 g/l 4,3 g/l 2,033 g/l 2,7 mg/l 143,3 g/l NaCl KCl NH 4 Cl (NH 4 ) 2 SO 4 MgCl 2 *7H 2 O ZnSO 4 Tris base Pepton 10% Pepton Glycerin Glycerin CaCl mm CaCl 2 Thiamin 50 mg/ml Thiamin Tabelle A3: Klassifizierung der verwendeten Bakterienstämme. Praktikumsgruppe Vorzubereitende Bakterienstämme 1 Sporosarcina sp. 2 Pseudomonas sp. 3 Escherichia coli Alle (nur Lochtest) Bacillus sp.

9 Tabelle A4: Zeitlicher Ablauf des Praktikums (Modul Biologie). Dienstag 8:15 Antestat, Belehrungen Gruppe I Gruppe II Gruppe III 9.30 Für den Lochtest, Metallsalzlösungen in vorgestanzte Löcher geben Cr + Co (250mM) Cu + Zn (250mM) Cd + Ni (250mM) 9:35 Jede Gruppe erhält eine frische Vorkultur eines bakteriellen Stammes Sporosarcina sp. Pseudomonas sp. Escherichia coli Ernte von 10 ml Kulturmedium mittels Zentrifugation Waschen der Zellen mit 10ml 0,9% NaCl Bestimmung der OD 600 der gewaschenen Zellen Volumenberechnung des zuzugebenden NaCl Resuspendieren der Zellen in errechneten Volumen NaCl OD 600 von ~0.5 prüfen Verdünnungsreihe bis zu folgenden Verdünnungen erstellen Verdünnen 1: und 1: Verdünnungen aliquotieren Verdünnen 1: und 1: Verdünnen 1: und 1: In der Wartezeit können die Gruppen schon Platten beschriften oder sie machen den Kleinen Test am Rande = Wachstum von MO von Hand, etc. auf NB-Platten 11:00 Platten gießen mit den folgenden Schwermetallen Cr Cu Cd 12:00 Mikroskopische Präparate vorbereiten (Originalkultur) Mikroskopie der Stämme 12:15 Mittagspause 13:00 Beimpfen der Platten Jede Gruppe beimpft Platten ihres Metalls mit allen 3 Stämmen (V3 und V4 bzw. V2 und V3 bei Sporosc.) + Kontrollen Uranplatten werden nur mit V3 und V4 bzw. V2 und V3 bei Sporosc. des eigenen Stammes beimpft 14:00 Agar-Diffusionstest (Stämme ausstreichen mit OD ) Donnerstag Nachmittag Auszählen der Kolonien/Auswerten des Agar-Diffusionstests