Science, 307:1965 (2005)

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1 Science, 307:1965 (2005)

2 Gene 1 Gene 2 At Arrow of intermediate IPTG Concentration: Gene 1 is still at low copy number when Gene 2 is switched off. ==> This will be seen in the Noise of the cascade

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4 Usage of Transfer Functions!

5 Stochastic Genes From Concentrations to Probabilities Genes can be viewed as nodes in a complex network, with input being proteins such as transcription factors, and outputs being the level of gene expression. The node itself can also be viewed as a function which can be obtained by combining basic functions upon the inputs (in the Boolean network described below these are Boolean functions or gates computed using the basic AND OR and NOT gates in electronics). These functions have been interpreted as performing a kind of information processing within the cell which determines cellular behaviour. The basic drivers within cells are levels of some proteins, which determine both spatial (tissue related) and temporal (developmental stage) co-ordinates of the cell, as a kind of "cellular memory". The gene networks are only beginning to be understood, and it is a next step for biology to attempt to deduce the functions for each gene "node", to assist in modeling behaviour of a cell (see systems biology). Mathematical models of GRNs have been developed to allow predictions of the models to be tested. Various modeling techniques have been used, including Boolean networks, Petri nets, Bayesian networks, graphical Gaussian models, Stochastic Process Calculi and sets of differential equations.

6 Robuste vs. ultrasensitive Schalter Einfaches Netzwerk mit positiver Rückkopplung Ohne Hysterese: Ultrasensitiver Schalter, rauschinduziertes Schalten Mit Hysterese: Robust gegen Rauschen (Konzentration von A bleibt gering, falls anfängliche Konzentration gering)

7 Robuste Schalter / Bedeutung der Hysterese Einfaches Netzwerk mit positiver Rückkopplung memory-less switch bistable switch Hysterese Ohne Hysterese: Ultrasensitiver Schalter, rauschinduziertes Schalten Mit Hysterese: Robust gegen Rauschen (Konzentration von A bleibt gering, falls anfängliche Konzentration gering)

8 Bistable genetic Switches Protein A = key regulator active when present as a multimer. multimerization => nonlinear dynamics of the system production of A, f(a p ) described by Hill-type function. deactivation rate, described by a linear-type function, f(a d )

9 Eigenschaften des Lac Netzwerkes Die Induktion der lac synthese ist ein Alles-Oder-Nichts Prozess Die Eigenschaft des genetischen Zustandes kann vererbt werden Novick & Weiner 1957

10 Der Lactose Abbauweg eine hierarchische Betrachtung Molekulare Wechselwirkungen Zelluläres Netzwerk Heterogenität in der Populationsdynamik

11 Zeitliches Verhalten des lac-operon Schalters Niedrige Induktor- Konzentration: Hohe Induktor- Konzentration: [β-galactosidase] [β-galactosidase] time (generations) Verschiedene Farben Verschiedene Zellen => Nicht alle Zellen schalten gleichzeitig! Durchgezogene Linie: Mittel über 2000 Zellen Rote dots: Experiment (Novik, Wiener, PNAS 1957) [β-galactosidase] Vilar, J.M.G et al, J.Cell Biol time (generations)

12 Gen-Regulation mit Feedback: lac-operon IPTG, TMG LacI

13 Modell für lac Netzwerk Glukose Konz. konstant GFP: Reportermolekül, Abbildung durch Fluoreszenz-Mikroskopie => je höher das Fluoreszenz-Signal desto mehr LacZ,Y wird exprimiert

14 Experimenteller Nachweis eines Schalters mit Hysterese Anfang: nicht induziert Nach Induktion 2 Populationen: induzierte Population grün, nicht induzierte Population weiß Bistabiler Bereich (grau) Pfeil zeigt den Anfangs-Zustand Zustand der Bakterien hängt vom Ausgangs-Zustand ab! => Schalter mit Hysterese Ozbudak et al, Nature 2004

15 Modell für lac Netzwerk # y dx # x dt R = R T dy dt = $ 1+ = " y! 1+ steady state: 1+ y = # " R x ( x x ) n 0 R 2 (! y) (! y) 2 0! y x: intracellular TMG concentration y: concentration of LacY (permease) (measured in GFP fluorescence units) R: concentration of active LacI (repressor) R T : total concentration LacI n: Hill coefficient (LacI is tetrameric, but 1 TMG is sufficient to interfere with LacI activity) n! 2 α: maximal activity level (if all repressors were inactive) β: transport rate, TMG uptake rate per LacY! = 1+ R T R 0 : repression factor R 0 : half saturation concentration x 0 : half saturation concentration τ x, τ y : time constants Ozbudak et al, Nature 2004

16 Phasendiagramm große ρ: diskontinuierlicher Übergang vom nicht-induzierten zum induzierten Zustand entspricht Phasenübergang 1. Ordnung, thermisches Rauschen wird durch chemisches Rauschen ersetzt kleine ρ: kontinuierlicher Übergang vom nicht-induzierten zum induzierten Zustand entspricht Phasenübergang 2. Ordnung α: maximal activity level (if all repressors were inactive) β: transport rate, TMG uptake rate per LacY! = 1+ R T R 0 : repression factor in Wild Typ Bakterien wurden nur diskontinuierliche Übergange beobachtet => Konstruktion einer Mutante Ozbudak et al, Nature 2004

17 Phasendiagramm Erniedrige ρ unter Wild Typ Niveau! Mutante mit zusätzlichen Bindungsstellen für LacI Repressor (b:4, c:25) => Reduktion der effektiven LacI (Repressor) Konzentration => Reduktion von ρ [TMG] (Inducer) Fluorescence Intensity, [LacY] Fig c: Kontinuierlicher Übergang vom nicht-induzierten zum induzierten Zustand!, kein Schalter (entspricht einem Phasenübergang 2. Ordnung)

18 Die Dynamik des Schaltverhaltens: Vergleich von Experiment und stochastischer Simulation (rot)

19 Quorum Sensing

20 Tintenfisch mit Scheinwerfer Phänomen: Tintenfisch (Euprymna scolopes) emittiert nachts Licht => wird im Mondlicht nicht als Beute erkannt Erklärung: Lichtorgan des Tintenfisches sammelt luminiszente Bakterien (Vibrio fischerei) Frage: Warum sind V. fischerei im Licht-Organ des Tintenfischs luminszent, aber nicht freischwimmend im Meer?

21 Quorum sensing Bakterien teilen sich => exponentielles Wachstum OD: optische Dichte K. Nelson, Cell-Cell Signalling in Bacteria Bakterien detektieren ihre eigene Zelldichte => Regulation der Expression von Luminiszenz-Genen

22 Molekulares Bild von QS Bakterien exportieren Oligopeptide (auch Pheromon, bakterielles Hormon, Autoinduktor) Mit steigender Zellkonzentration akkumuliert Oligopeptid Oligopeptid diffundiert durch Zellmembran, akkumuliert in der Zelle und reguliert Gen- Expression

23 Kompetenz Kompetenz: lateinisch competere = zusammentreffen, ausreichen, zu etwas fähig sein, zustehen die bei Individuen verfügbaren oder durch sie erlernbaren kognitiven Fähigkeiten und Fertigkeiten, um bestimmte Probleme zu lösen, sowie die damit verbundenen motivational, volitional und sozialen Bereitschaften und Fähigkeiten, um die Problemlösungen in variablen Situationen erfolgreich und verantwortungsvoll nutzen zu können. F. E. Weinert Aus biologischer Sicht: Fähigkeit von Zellen, DNA aufzunehmen und in ihre eigene Erbsubstanz zu integrieren

24 Kompetenz: Fähigkeit von Zellen, DNA aufzunehmen und in ihre eigene Erbsubstanz zu integrieren Freiwillig? Nein: Meistens aber müssen die Zellen vorbereitet, kompetent gemacht werden. => künstliche Kompetenz. Wie? Durch Kombination von Reizen: Hitze, Kälte, Salze (Calziumphosphat), Strom Manchmal! Zellen sporenbildender Bakterien wie Bacillus subtilis können unter bestimmten Umweltbedingungen DNA aufnehmen. => natürliche Kompetenz

25 Wann werden Bakterien kompetent? competence unter bestimmten Umweltbedingungen OD 600nm Bacillus subtilis: in einem ganz bestimmtem Lebensabschnitt: der stationären Phase lag exponentiell stationär Time

26 Wie nehmen Bacillen die DNA auf? Molekulares Modell der DNA- Aufnahme über die Zellmembran in Bacillus subtilis Com = Abkürzung für competence Dubnau:Rev Microbiol. 1999;53: Nat Rev Microbiol. 2004;2(3):241-9

27 Wie entscheiden sich Bakterien? Aktiv via quorum sensing Quorum sensing: Die Fähigkeit von Bakterien miteinander über Signal Moleküle (z.b. Pheromone) zu kommunizieren und ihr Verhalten zu koordinieren.

28 Wie wird Kompetenz induziert? ComX- Pheromone ComP Histindinkinase Membrane ComS ComS Proteinaseinhibitor ComX Precursor ComA Transcriptionfactor Pi ComK main Transcriptionfactor After Tortosa and Dubnau, 1999, Curr Opinion in Microbiology, 2: Activation of ~ 100 competence genes