OXYDASE. IV. Mitteilung: Uber die Eigenschaften der gereinigten Ascorbinsaureoxydasgt VON

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Kai Kohl
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1 The Journal of Biochemistry, Vol. 32, No. 2. UNTERSUCHUNGEN UBER OXYDASE. ASCORBINSAURE IV. Mitteilung: Uber die Eigenschaften der gereinigten Ascorbinsaureoxydasgt VON DANJI MATSUKAWA. (Aus dem Biochemischen Laboratoriunt des Kitasato-Instituts in Tokyo. Direktor: Dr. Akiji Fujita.) (Eingegangen am 7. August 1940) In der vorangehenden Arbeit (Ebihara 1939) wurden die Eigenschaften der gereinigten Ascorbinsaureoxydase hauptsachlieh jodometrisch untersucht. Da aber die zeitliche Veranderung der Aseorbinsaureoxvdation manometrisch bequemer and genauer zu verfolgen ist, so babe ich die Eigenschaften des Ferments mano metrisch erneut and eingehend untersucht. 1. Inaktivierung der Oxydase durch Sauerstoff. Die gereinigte Oxydase wird durch Schutteln mit Luft einiger massen, aber mit Sauerstoff deutlich teilweise inaktiviert. Zum Belege diene folgender Versuch. Die gereinigte Oxydaselosungl) wurde mit Wasser aufs 30 fache verdunnt. Mittels der manometrischen Anordnung nach Warburg wurde die Oxydaselosung mit Luft bzw. Sauerstoff verschieden lange geschuttelt, danach kippt man die Ascorbinsaurelosung ein and der Sauerstoffverbrauch wurde zeitlich verfolgt. Wie man aus Tabelle I ersieht, ist die Fermentlosung in dem konzentrier terem Zustande verhaltnismassig bestandig. Der Sauerstoff 1) Im folgenden soil die Verdunnung auf these Stanunfermentlosung bezogen werden. Die Stammlosung selbst ist im bezug auf das Ausgangs material etwa 25 fach verdunnt. Nebenbei sei hier erwahnt, dass die gereinigte Oxydase bei ph 6,0 im Eisschrank relativ bestandig ist, wahrend sie ihre Aktivitat bei ph 5,0 unter Ausflockung bedeutend verliert. 257

2 258 D. Matsukawa : verbrauch ist der Konzentration ungefahr proportional, das ist aber in verdunnteren Losungen nicht der Fall. Mit Sauerstoff wird die Inaktivierung noch deutlicher erkennbar (Vgl. Tabelle II). TABELLE I. Hauptraum: 1,0 ccm m/10 Acetatpuffer (pi1 6,0) +1,0 ccm Oxydase (1:30). Anhangsbirne: 0,2 ccm 0,977%ige Ascorbinsqure in 2%iger HPO3 (ph 6,0). Einsatz: 0,2 ccm 10%ige KOH. TABELLE II. Hauptraum: 1,0 ccm m/l0 Acetatpuffer (ph 6,0) + 1,0 ccm Oxydaselosung. Anhangsbirne: 0,2 ccm 0,977%ige Ascorbinsaure in 2%iger.HPO3 (ph 6,0). Einsatz: 0,2 ccm 10%ige KOH 2. Kinetik der Ascorbinsaureoxydation. Die manometrische Untersuchung der Kinetik der Ascorbin saureoxydation ergab, dass die Reaktion vielmehr monomolekular

3 Untersuchungen uber Ascorbinsaureoxydase.-IV. 259 TABELLE III. a: Zugesetzte Ascorbinsauremenge in cmm O2. x: Oxydierte Ascorbinsauremenge in cmm 02. Abb. 1. Hauptraum: 1,0 ccm m/10 Acetatpuffer (ph 6,0) +1,0 ccm Oxydase (1:30). Anhangsbirne: 0,1, 0,2 bzw. 0,3 ccm 0,977%ige Aseorbinsaure in 2%iger HPO3 (ph 6,0). Einsatz: 0,2 ccm 10%ige KOH Gasraum: Luft (statt 02) Zett uv Muwlen x-x 2,931 mg Aseorbinsaure o-o 1,954" " E- 0,977" "

4 260 D. Matsukawa : verlauft im Gegensatz zum vorigen jodometriseben Versueh. (Vgl. Abb. 1 and Tabelle III). Dabei verbrauchen jede 2 Mole Ascorbinsaure ungefahr ein Mol Sauerstoff, wie man sehon im vorigen Versuch gefunden hat (Tabelle IV). Der Meehanismus der Fermentreaktion soll hier vorlaufig dahingestellt bleiben. TABELL1c IV. Abb. 2. Hauptraum: 1,0 ccm n/10 Essigsaure in n/10 HPO3 +x ccm 1 n NaOH (auf verschiedenes PH gestellt) +1-x ccm Wasser + 1,0 ccm Oxydase (1:20) Anhangsbirne: 0,2 ccm 0,977%ige Ascorbinsaure in 2%ige HPO3 (mit NaOH auf verschiedenes PH gestellt) Einsatz: 0,2 cern 10%ige KOH Gasraum: 02

5 Untersuehungen uber Ascorbinsaureoxydase.-IV Einifluss von ph. Als Puffer nahm ieh ein Gemisch von Acetat mid Metaphos phat. Der geprufte Pn Bereich liegt zwischen 4 u. 9. Der Sauer stoffverbrauch in 10 Minuten nach Einkippen der Ascorbinsaure wird graphiseh in Abb. 2 gezeigt. Da die Ascorbinsaure im alkali scheren Bereich ohne Fermentzugabe spontan bedentende Menge Sauerstoff verbraucht, wurden die gefundenen Werte mit denen der Blindversuche korrigiert. Das Wirktingsoptirnum der-oxydase liegt also wie im vorigen Versuch bei ungefahr PH Spezifitat der Fermentreaktion. Als Substrate versuchte ich ausser t-ascorbinsaure, d-arabo.ascorbinsaure, Glukoredukton, Cystein and Glutathion. Spontane Oxydation war bei Glukoredukton sehr erheblich wie aus Tabelle V hervorgeht, wahrend die Oxydation von. Cystein and Glutathion sehr unbedeutend war im Gegensatz zu anderen Substraten. TABELLL V. Hauptraum: 1,0 ccm m/10 Aeetatpuffer (PH 6,0) + 1,0 ccm Oxydase (1: 30) Anhangsbirne: 0,2 ccm 0,057 mol. Substrat in 2%iger HPO3 (PH 6,0) Einsatz: 0,2 ccm 10%ige KOH Gasraum : 02 5; Henrmung dterch Kwnplexbildner mit Schwermetallen. Ich untersuchte den Einfluss der verschiedenen Komplex bildner mit Schwermetallen. Beim Zusatz von Ferrocyankalium,

6 262 D. Matsukawa : 1-Amino-8-naphthol-4-sulfosaure und 2-Aminophenol-4-sulfosaure fand ich keine Hemmung, sondern vielmehr Forderung der Oxyda tion, moglicherweise infolge der beigemischten Schwermetallspuren.. (Tabelle VI). TABELLE Hauptraum: 1,0 ccm m/10 Acetatpuffer (PH 6,0) + 1,0 ccm Hemmungsstoff (PH ca. 6) + 1,0 ccm Oxydase. (1: 30) Anhangsbirne: 0,2 ccm 0,977%ige Ascorbinsaure in 2%iger HP03 (PH 6,0) Einsatz: 0,2 ccm 10% KOH Gasraum : 02 Temperatur des Thermostats: 38 Ž. Kontrolle: Ohne Hemmungsstoff. 02-Verbraueh in 10 Minuten: 59,7 ccm. VI. * Eudkonzentration nach Misehung mit Puffer and Oxydase. Da der 02-Verbrauch inuerhalb der anfangliehen 10 Minutes uiigefahr linear verlauft, wurden in Tabelle VI die Ergebnisse von 10 Minuten angefuhrt. 6. Hemmung durch CO. Ich farad zwar die Hemmung der Aseorbinsaureoxydation durch CO aber viel unbedeutender als beim vorigen Versuch. Einen Einfiuss der Bestrahlung.konnte ich auch nicht finden (Tabelle VII). Der Sauerstoffverbrauch in den anfanglichen 5 Minuten nach jedem Wechsel der Bestrahlung wurde in den Werten von Tabelle VII nicht mitberechnet.

7 Untersuchungen uber Ascorbinsaureoxydase.-I V 263 TABELLE VII. Hauptraum: 1,0 ccm m/10 Acetatpuffer (PH 6,0) +1,0 ccm Oxydase (1:20) Anhangsbirne: 0,2 ccm 0,977%ige Ascorbinsaure in 2%iger HPO3 (PH 6,0) Einsatz: 0,2 ccm 10%ige KOH Gasraum: 95% CO bzw. 95% N2 in Kupfergehalt in Ferment. Der Kupfergehalt der gereinigten Oxydasestammlosung wurde hauptsachlich wegen der Empfindlichkeit manometrisch nach Warburg (1927) in der modifizierten Anordnung von mir (Matsukawa Es ergab sick: 1940) bestimnit. Nach Trocknen bei 100 E0,0194 ƒá Cu pro ccm Oxydasestammlosung Nach Trocknen mit KH2PO4 bei 100 Ž: 0,0243 " Nach Veraschung: 0,062 " 1,0 ccm der O xydaselosung (1:20) verbraucht nach Zusatz der Ascorbinsaure in der beschriebenen Anordnung (m/20 Acetat puffer, PH 6,0, Luft, 38 Ž) in 30 Minuten 120 cmm 02.1) Also 1 ƒá Cu oxydiert Ascorbinsaure in 30 Minuten unter Ver brauch des 02 von Mit anderen Worten oxydiert 1ƒÁ Cu in 30 Minuten Da der Cu-gehalt nach Veraschung etwa 3 fach hoher gefunden wird, so ist das Kupfer der Oxydase hauptsachlich als organisch gebunden zu betrachten. 1) Aus dem Wert von 10 Minuten extrapoliert.

8 8 264 D. Matsukawa : ZUSAMMENFASSUNG. 1. Die gereinigte Oxydase wird durch Sehuttelung mit Luft etwas, aber mit Sauerstoff bedeutender inaktiviert. 2. Die Fermentlosung ist in konzentriertem Zustande ver haltnismassig bestan.dig, dagegen in verdunnter Losung un bestandig. Bei den konzentrierteren Losungen ist der Sauerstoff verbrauch der 1 onzentration proportional. Das ist aber bei den verdunnteren Losung nicht mehr der Fall. 3. Ascorbinsaureoxydation verlauft each dem manometrischen Versuch monomolekular. Aber ich fand, dass je 2 Mole Ascorbin saure ungefahr ein Mol Sauerstoff verbrauchen. 4. Wirkungsoptimum der Oxydase liegt bei etwa PH Die gereinigte Oxydase oxydiert d-araboascorbinsaure and Glukoredukton ziemlich' leicht, wahrend Cystein and Glutathion dadurch kaum oxydiert werden. 6. Die Ascorbinsaureoxydation durch Oxydase wird durch viele Komplexbildner mit Cu gehemmt, aber es wurde auch in einigen Fallen Forderung der Oxydation beobaehtet, moglicher weise infolge der Beimengung der Seliwerinetallspuren. 7. Die Wirkung der Oxydase wird durch CO gehemmt, aber sehr geringfugig. Ein Einfluss der Bestrahiung auf die CO Hen-inning wurde nicht beobaehtet.. Die gereinigte Oxydasestammlosung enthalt pro ccm etwa -0,062 ƒá Cu and zwar, hauptsachlich in organiseh gebundener Form. 1 ƒá Kupfer der Oxydase verbraucht unter der Versuchsbedingung in 30 Minuten 38,7 ccm Sauerstoff, entsprechend der Oxydation von 608 mg Aseorbinsaure. Diese Arbeit wurde auf Veranlassung and enter Leitung von Herrn Dr. A. Fujita ausgefuhrt, dem ich an dieser Stelle bestens -danke. LITERATUR. Ebihara (1939): J. Biochem., 29, 199. Matsukawa (1940): J. Bioch., 32, 175. Warburg (1927) : Bioch. Z., 187, 255.

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