Biologische N 2 -Fixierung

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1 Pflanzen (& andere Organismen) benötigen große Mengen N für z.b. Aminosäuren, Nukleinsäuren, Chlorophyll, etc. Pflanzen brauchen reduzierten N in Form von Nitrat oder Ammonium. Biologische N 2 -Fixierung Reduktion von atmosphärischem N 2 zu Ammonium (und Nitrat) nennt man ganz allgemein 'Stickstofffixierung' - die Umwandlung des reaktionsträgen Luftstickstoffs (N 2 ) zu Verbindungen, die reaktiver und bioverfügbar sind. Der Prozess ist aufgrund der sehr stabilen Dreifachbindung in molekularem N 2 mit 946 kj/mol äußerst energieaufwändig Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 1 'N 2 -Fixierung' Man unterscheidet folgende Formen der Stickstofffixierung: Chemische ('spontane') Stickstofffixierung (ca. 10%) Blitzschlag bei Gewittern, Verbrennung und Vulkane: aus N 2 und O 2 der Luft entstehen Stickoxide, die mit Wassertröpfchen zu Salpetriger Säure bzw. Salpetersäure reagieren und als Saurer Regen in den Boden gelangen. Technische (industrielle) Stickstofffixierung Nach dem Haber-Bosch-Verfahren kann N 2 reduziert werden (N H 2 2 NH 3 ). Benötigt ca. Temperatur von 500 C & Druck von 450 bar & Katalysatoren (Dissoziationsenergie N 2 = 940 kj). Meist wird der Ammoniak in nitrathaltige Düngemittel umgesetzt. N-Dünger ist teuer, Herstellung sehr Energie-intensiv - etwa 3 % des Weltenergieverbrauchs gehen in Haber-Bosch-Verfahren! Biologische Stickstofffixierung (>60%, Angaben bis >75%) Ist weltweit die wichtigste Form der N 2 Fixierung. Sie macht zwischen einem Drittel und der Hälfte der gesamten N 2 -Fixierung aus aus. Durch Prokaryoten wird dabei atmosphärischer N 2 zu Ammoniak (NH 3 ) reduziert. Dafür ist der Nitrogenase-Enzym-Komplex und sehr viel Energie (bis 25 Moleküle ATP) notwendig Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 2 1

2 Für molekularen N 2 ist biologische N 2 -Fixierung der 'Eintrittspunkt' in den bio-geochemischen N-Kreislauf! Biologische N 2 -Fixierung Man schätzt die Menge des jährlich fixierten Stickstoffs auf über 120 Mio Tonnen. Wurzelknöllchen- Symbiosen sind verantwortlich für größten Teil des im Landökosystem fixierten N 2 (Sy et al. 2001) Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 3 Biologische N 2 -Fixierung Einige Prokaryoten können atmosphärischen N 2 zu Ammoniak reduzieren, viele von ihnen leben in Symbiose oder Assoziation mit Pflanzen. Globale chemische N Fixierung ca. 3 x 10 7 t/jahr (25%) Globale biologische N Fixierung ca. 9 x 10 7 t/jahr (75%) Freilebende N 2 -fixierende Prokaryoten (~ 1-30 kg N/ha/Jahr): Archaebacterien Methanococcus Anaerobe Bakterien Clostridium, Rhodospirillum Facultativ anaerobe Bakterien Klebsiella, Erwinia Microaerobe Bakterien Azospirillum, Arthrobacter Aerobe Bakterien Azotobacter Photosynthetische Bakterien Rhodopseudomonas, Rhodobacter Cyanobakterien Anabaena, Nostoc, Symbiotische N 2 -fixierende Assoziationen (~ kg N/ha/Jahr): Rhizobium + Leguminosen Vicia, Pisum, Medicago, Lens, Glycine, Phaseolus Rhizobium + nicht-leguminosen Parasponia Frankia - Actinorhiza Alnus, Casuarina Cyanobakterien + Pilze, Pflanzen Geosiphon, Flechten, Anthoceros, Azolla, Cycas, Gunnera Zum Vergleich: Weizen (Triticum) Düngung mit kg N/ha/Jahr Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 4 2

3 Das N 2 -Fixierungs-Enzym, die molybdänhaltige 'Nitrogenase', ist sehr (!) O 2 -empfindlich. Bereits geringe O 2 -Konzentrationen inaktivieren das Enzym irreversibel. Andererseits - braucht viel O 2 für aktive Atmung (Energie!). O 2 Konzentration muss für die erfolgreiche N 2 -Fixierung genau ausbalanciert sein. Biologische N 2 -Fixierung Regulation O 2 Level: Cyanobakterien bilden spezialisierte Zellen, sogenannte Heterocysten Frankia bildet 'Vesikel' In Wurzelknöllchen-Zellen bildet Pflanze ein eisenhaltiges Protein. Dieses Leghämoglobin bindet/puffert überschüssigen O 2 und hält dessen Niveau konstant niedrig. Rhizobien Frankia Anabaena Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 5 Wie 'funktioniert' biologische N 2 -Fixierung? Wurzelknöllchen-Gewebe ist oft blutrot gefärbt. Es enthält Leghämoglobin. Aminosäure-Sequenz & Tertiärstruktur ähnlich tierischen Hämoglobinen. Inzwischen wurden Hämoglobine in vielen, nicht-verwandten Pflanzen- Familien nachgewiesen. Welche Funktion die Hämoglobine hier haben ist unklar. Bei den Wurzelknöllchen- Symbiose ist die Funktion geklärt N 2 Fixierung benötigt microaerobe Bedingungen! Das Schlüsselenzym der N 2 Fixierung - der Nitrogenase- Komplex - wird durch O 2 irreversibel inhibiert! Deshalb ist das Knöllchen räumlich organisiert - und schafft die microaeroben Bedingungen Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 6 3

4 Das Leghämoglobin Leghämoglobin (rechts) hat ca. 10x höhere Affinität zu O 2 als menschliches Hämoglobin! In Soya- Knöllchenzellen 700 µm! Leghämoglobin und O 2 -impermeable Zellschicht halten O 2 -Spiegel in Knöllchen niedrig, so dass Nitrogenase nicht inaktiviert wird. Gleichzeitig transportiert es O 2 zu Bakterien um intensive (!) Atmung zu ermöglichen! Proteinkomponente des Knöllchen-Leghämoglobins von Pflanze gebildet (nur wenn 'infiziert', 'Nodulin'). Häm (Porphyrinring) wird von Bakterien gebildet! Enthält zentrales Eisen-Ion - in Knöllchen viel Fe benötigt! Aber auch Bakterioide haben hohen Bedarf an Fe, und an Molybdän - beide zusammen sind für die Aktivität der Nitrogenase essentiell. Häm Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 7 'Nitrogenase'' reduziert N 2 'Nitrogenase' kommt in allen N 2 -fixierenden Organismen vor. Nitrogenase-Protein-Komplex: Codierung & Regulation bei Klebsiella (freilebend, anaerob) durch ca. 20 Gene (nif-region), in sieben Operons. Nitrogenase Komponente I (220 kd) 4 Untereinheiten, enthalten (neben Eisen) 28 Mo Atome als Co-Factoren. Die Fe & Mo Cofaktoren binden N 2 für Umwandlung in Ammonium. (= Nitrogenase Molybdän-Eisen (MoFe-) Protein, bzw. Dinitrogenase) Nitrogenase Komponente II (70 kd) 2 Untereinheiten, enthalten 8 Fe Atome als Co-Faktoren. (= Nitrogenase Eisen (Fe-) Protein, bzw. Dinitrogenase Reduktase) I (MoFe) II (Fe) Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 8 4

5 'Nitrogenase'' reduziert N 2 1) Ferredoxin reduziert das Fe-Protein II Dinitrogenase Reduktase (Fe) I Dinitrogenase (FeMo) NH 4 + 2) ATP-Bindung & Hydrolyse verursacht Konformations- Änderung des Fe- Proteins, begünstigt Redox-Reaktion 8 x 2 ATP 3) Fe-Protein reduziert das MoFe Protein 4) MoFe Protein reduziert dann N 2 [Buchanan et al. 2000] Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 9 Die Energiebilanz N 2 Fixierung braucht extrem viel Energie! Dinitrogenase Die 3-fachbindung des N 2 gehört zu den stärksten kovalenten Bindungen in biologisch relevanten Molekülen. Für Umsetzung von 1 Mol N 2 zu 2 Mol Ammoniak werden insgesamt ca. 25 Mol ATP benötigt, oder anders ausgedrückt, pro 1 g fixiertem N werden ca. 10 g Glucose verbraucht - unter günstigsten Voraussetzungen. Dinitrogenase Reduktase reduziert Nitrogenase N 2 + 8H + + 8e - 2NH 3 + H 2 16 ATP 16 ADP+P i Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 10 oxydiert 5

6 nif Gene bei Rhizobien oft auf Plasmid Anfang der 80er Jahre wurden aus Rhizobien die ersten nitrogen-fixation (nif) genes kloniert. Bei Rhizobien liegen die nif Gene zusammen mit den nod (und anderen) Genen meist auf dem 'Sym (Symbiosis) Plasmid', bei manchen 'Rhizobien' auf 'Symbiotic Island' (auf Chromosom, z.b. 410 kb Region in B. japonicum). S. meliloti Genom (6.68 Mb) besteht z.b. aus Chromosom (3.65 Mb) und 2 Plasmiden: psyma (1.35 Mb) und psymb (1.68 Mb) Sym Plasmid aus Sinorhizobium sp. strain NGR Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 11 nif Gene bei Klebsiella pneumoniae 20 nif Gene, auf Chromosom in 24kb Region [Pedrosa et al. (2001) J. Biotechnology 91] nifh, nifk & nifd codieren Nitrogenase Subunits NifE, NifN, NifU, NifS, NifV, NifW, NifX, NifB & NifQ sind Proteine für Einbau von Fe & Mo in die Nitrogenase Subunits NifF & NifJ spielen Rolle bei Elektronentransfer bei N 2 Reduktion NifA aktiviert Expression der nif Gene, wenn wenig N (N-Mangel NtrC Expression - ist RNApolymerase welche die NifA Expression triggert) NifL inhibiert NifA - aktiviert wenn O 2 & NH 4+ Konzentration hoch nif Gene Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 12 6

7 Transgene Pflanze - defekt in Leghämoglobin-Synthese: Sauerstoffgehalt in den Knöllchen erhöht, Enzym Nitrogenase nicht mehr nachweisbar Ohne Leghämoglobin Durch Fehlen von Leghämoglobin kann O 2 in Knöllchen nicht mehr abgepuffert werden Aktivierung Transkription von nif L, NifL inhibiert NifA (Transkriptionsfaktor für nif Gen cluster) keine Nitrogenase-Synthese Wurzelknöllchen von Lotus japonicus: Größe und Färbung der Wurzelknöllchen des Wildtypes durch die hohe Konzentration an Leghämoglobin. [Ott et al. (2005) Current Biology 29] Fehlen der Nitrogenase Stickstoffmangel Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 13 nif Gene Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 14 7

8 noch mehr Gene Gene aus (verschiedenen) Mikroorganismen, die an Stickstoff-Fixierung, Stickstoff-Metabolismus und Stickstoff-Regulation beteiligt sind. nifhdk - Nitrogenasekomplex, Strukturgene nifa - NifA, Transkriptionsaktivator der nif-gene nifl - NifL, Regulator NifA-Aktivität; O 2 und NH 4+ abhängig (nur γ-proteobakterien) (NifL wird wiederum reguliert durch GlnD & GlnK) rpon, ntra - σ54, Sigmafaktor für die Transkription von N-abhängigen Promotoren glnd - UTase/UR, N-Status-abhängige Modifizierung des PII-Proteins glnb - PII, Signaltransduktionprotein drat - Dinitrogenase-Reduktase Ribosyltransferase, Repression Nitrogenase-Aktivität drag - Dinitrogenase-Reduktase Glykohydrolase, Aktivierung Nitrogenase-Aktivität glna - Glutamin-Synthetase, Strukturgen glne - ATase, Regulierung der GS-Aktivität gltdb - Glutamat-Synthase, Strukturgene amtb - Ammoniumtransporter glnk - GlnK, PII-Paralog, Signaltransduktionprotein glnz - PZ, GlnK-Homolog ntrc - NtrC, Transkriptionsregulator ntrb - NtrB, Phosphokinase des Zweikomponenten-Regulationsrsystems Vorlesung Pflanzen-Mikroorganismen Symbiosen - VL7b Slide 15 8