Kriterien der Einteilung von RNA Viren entsprechend Ihrer Genomorganisation

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1 Kriterien der Einteilung von RNA Viren entsprechend Ihrer Genomorganisation einzelsträngig (+)-Polarität (-)-Polarität ambisense Poliovirus segmentiert Influenza A Virus nicht segmentiert vesicular stomatitis virua (VSV) Arenavirus doppelsträngig Reovirus circulär Hepatitis -Virus Prinzipien der Replikation und mrna-synthese nicht-retroviraler RNA-Viren Synthese von mrna (+) Transkription mrna-sysnthese RNA Genom (+),(-), ds Replikation Kopie des RNA Genoms (+),(-), ds Translation in virale Proteine (Strukturproteine, regulatorische Proteine) Verpackung in neue Virionen (Verpackungssequenzen, Strukturproteine) RNA RNA-abhängige RNA Synthese RNA Virale RNA-abhängige RNA Polymerasen (RdRPs)!! Ausnahme: Retroviren (RdDP)

2 RNA-abhängige RNA-Polymerasen Zellextrakte Poliovirus-infizierter Zellen enthalten eine enzymatische Aktivität die die primer und template abhängige Inkorporation von Ribonukleotiden katalysiert Die Aktivität ist insensitiv gegenüber Actinomycin D Die Aktivität konnte dem cytoplasmatischen viralen 3Dpol-Protein zugeschrieben werden Vergleichbare Aktivitäten sind später in Partikeln von (-) Strang RNA Viren entdeckt worden Die meisten RNA-abhängigen RNA Polymerasen (RdRPs) sind primerunabhängig (vergleichbar den zellulären DNA-abhängigen RNA Polymerasen) Aufgrund der präferentiellen Membranlokalisation ist die Reinigung der meisten RdRPs schwierig Primärsequenzvergleiche verschiedener zellulärer und viraler Polymerasen weisen auf einen gemeinsamen Vorfahren hin Primärstrukturvergleich und Sequenzhomologie viraler und zellulärer Polymerasen Poliovirus 3D pol HIV-I RT Pol I Klenow RNA Pol T7 Metallbindung

3 Tertiärstruktur der Poliovirus 3D pol -Polymerase und generelle Strukturhomologien von Polymerasen YGDD Nur in RdXPs Klenow T7 RNAP HIV-I RT 3D pol Einige repräsentative Viren mit RNA-Genomen

4 Funktionen akzessorischer Proteine bei der RNA-abhängigen RNA Synthese 1. Direktion der RNA-Polymerase zum korrekten zellulären Kompartiment RNA-Synthese findet typischerweise nicht frei im Cytoplasma, sondern in bzw. an definierten zellulären Strukturen statt: (-) Strang Segmente von Influenza A Virus werden vermittels eines NLS im NP Proteins in den Kern dirigiert. (+) Strang des Poliovirusgenoms wird vermittels der Interaktion von 3AB mit 3CD an ein vesikuläres Kompartiment dirigiert. 2. Direktion der RNA-Polymerase zur korrekten Stelle der viralen Matrize Die Matrizenspezifität viraler RdRP wird durch spezifische Interaktionen der Polymerase mit akzessorischen viralen oder zellullären Proteinen, die an spezifische Stellen in der Matrize binden (RNA-Sekundärstrukturen), vermittelt. Beispiel: Poliovirus 3CD/RNA Interaktion. 3. Stimulation der Polymeraseaktivität 4. Erleichterung der RNA-Synthese durch viruscodierte Helicasen Basengepaarte Bereiche innerhalb der RNA werden durch Helicasen aufgeschmolzen. Dies stellt einen möglichen Angriffspunkt für therapeutische Intervention dar (HCV-Helicase) Strategien der Replikation und mrna Synthese von RNA Virusgenomen

5 Zelluläre Orte viraler RNA Synthese Cytoplasma: Die meisten RNA-Viren replizieren ihr Genom und synthetisieren ihre mrnas im Cytoplasma Synthese erfolgt nicht frei sondern ist an zelluläre Strukturen gebunden (Vesikel, Membranen, Cytoskelett) Die hohe lokale Konzentration der für die Replikation notwendigen Komponenten erhöht die Effizienz der Replikation Membranen stellen häufig den Ort der Verpackung neuer Virionen dar. Problem: Alle normalerweise nukleären Aktivitäten des Wirtes müssen von viralen Proteinen bereitgestellt werden (z.b. capping von mrnas). Nukleus: Von den RNA Viren replizieren nur Influenza und Borna Viren im Nukleus Vorteil besteht in der Möglichkeit der Ausnutzung des zellulären splicing -Apparates Es müssen Mechanismen des Kerntransportes entwickelt werden. NP-Protein enthält Kernlokalisationssequenz. Replikation und RNA-Synthese von (+) Strang RNA Viren RNA von (+) Strang RNA Viren ist infektiös - (+) Strang genomische RNA kann als direkte Matrize für die Synthese von RdRP dienen (+) Strang RNA Viren bedürfen keine aktive RdRP im Viruspartikel Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (-) Strang Intermediat Polivirus hat ein 5 VpG statt CAP

6 Struktur und Genomorganisation des (+) Strang Picornavirus: Poliovirus Bindung an PVR (Kapsidöffnung, RNA-Freisetzung) Replikationszyklus des (+) Strang Picornavirus: Poliovirus Zellkern Polyproteinsynthese (VPg-Entfernung, Ribosomenbindung an IRES Element) Membranvesikel VPg (-) Strangsynthese Polyproteinprozessierung (P1:Struktur; P2, P3: Proteasen und RdRP) VPg (+) Strangsynthese Proteintransport in Vesikel (vesikuläre RNA-Synthese)

7 Struktur des 5 -Endes des Poliovirus (+) Strang RNA Genoms Hydrolyse durch zelluläre Esterase (Generierung eines 5 -Up-Endes) Phosphosäureester mit Tyr 3 von VPg 5 -Uridylrest 22 Aminosäuren VPg Peptid Kleeblattstruktur des 5 -Endes des Poliovirus RNA-Genoms RNA Sekundärstrukturen stem-loops und Pseudoknoten stem-loop Strukturen Pseudoknoten Basenpaarungen im Stamm (stem), Keine Basenpaarungen innerhalb der Schleife (loop) Basenpaarungen im Stamm, Basenpaarungen der Schleife mit Nukleotiden außerhalb der Schleife

8 Die Spezifität der Poliovirus RNA Synthese wird durch spezifische Interaktionen viraler und zellulärer Proteine an RNA-Sekundärstrukturelemente gewährleistet Bindung von viralem 3CD und dem zellulären Poly (rc) Bindeprotein an stem-loop D und B Priming und proteolytische Abspaltung von VPg aus 3AB durch die Protease 3C;Bindung von 3Dpol/VPg-primer an 3 -Ende; Erkennung des 3 pseudoknot durch 3D pol bedingt Spezifität Bindung von UTP und Anlagerung des Komplexes an Membrangebundenes 3AB Protein Elongation und (-) Strang Synthese Priming Reaktion am 3 -Ende der Poliovirus RNA Bindung von 3AB an Membranen (membranous web) Uridylylierung von Tyr 3 des VPg- Teils in 3AB durch 3Dpol Rekrutierung des polyadenylierten 3 -Endes der Poliovirus RNA Ausbildung eines geprimten Ribonukleoproteinkomplexes mit 2 Uriditylresten (VPgpUpU) Proteolytische Abspaltung von VpG durch virale 3C Protease Elongation des (-) Stranges Synthese eines vollständigen VPg gebundenen (-) Stranges

9 Translation viraler RNA in Proteine und RNA-Synthese sind koordinierte Prozesse Replikation und RNA-Synthese von (-) Strang RNA Viren RNA von (-) Strang RNA Viren ist nicht infektiös - (-) Strang kann durch zelluläre Enzyme weder kopiert noch translatiert werden. (-) Strang RNA Viren enthalten aktive RdRP im Viruspartikel Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (+) Strang Intermediat

10 Struktur und Genomorganisation des nicht segmentierten (-) Strang Rhabdovirus: vesicular stomatitis virus (VSV) leader Replikationszyklus des nicht segmentierten (-) Strang Rhabdovirus: vesicular stomatitis virus (VSV) Bindung und Fusion (Freisetzung des helicalen viralen Nukleokapsids) Synthese von 5 mrnas (ausgehend von leader-sequenz) (+) Strang Synthese (unter Beteiligung von N-, P- und L-Protein) Translation viraler mrnas (an freien und ER-gebundenen Ribosomen) (-) Strang Synthese (unter Beteiligung von N-, P- und L-Protein) Verpackung (unter Beteiligung von M-Protein) Prozessierung und Lokalisierung des G-Proteins

11 Genomorganisation und mrnas des vesicular stomatitis virus VSV Genlokalisation korrespondiert zur mrna Menge Stop-Start Modell der VSV mrna Synthese Initiation der RNA Synthese am 3 -Ende des (-) Strang Genoms von VSV (Primerunabhängig) Synthese einer 47 nt langen leader -Sequenz; Termination durch Ablösen der RNA von Polymerase Reinitiation der RNA-Synthese am 3 -Ende des 1. Gens (N) (nur ein Teil der Polymerasemoleküle reinitiieren) Synthese der N mrna und Termination in der folgenden intergenischen Region. Reinitiation der RNA-Synthese am 3 -Ende des 2. Gens (P) (nur ein Teil der Polymerasemoleküle reinitiieren)

12 Funktion der VSV RNA-Polymerase an der Intergenregion Komplementärer Einbau von 7A-Resten an der U7 Sequenz der IR Verrutschen des neusynthetisierten Stranges am Template Stottern der viralen Polymerase Termination nach Einbau von ca. 200 A Resten: Polyadenylierung durch stotternde Transkription einer U7 Sequenz Reinitiation und capping der nachfolgenden mrna ( capping erfolgt im Zytoplasma durch virale Polymerase und ähnelt der cap Struktur zellulärer mrnas) Die Umschaltung von mrna-synthese zur Genomreplikation Bei VSV wird durch das virale N-Protein reguliert Niedrige N-Proteinkonzentration favorisiert mrna Synthese Hohe N-Proteinkonzentration favorisiert (+) Strang Synthese

13 Struktur und Genomorganisation des segmentierten (-) Strang Orthomyxovirus: Influenza A Replikationszyklus des segmentierten (-) Strang Orthomyxovirus: Influenza A Bindung über HA an Sialinsäure (Endozytose) ph-induzierte Fusion (Freisetzung der 8 Nukleokapsidsegmente) Kerntransport des Nukleokapsids (NP/P/RNA-Komplex über NLS) mrna-synthese/export (cap-snatching) Synthese von PA, PB1, PB2 (Kernimport) mrna-splicing (NS2/M2) Synthese von HA, NA (am rer, Transport)

14 Nukleäre RNA-Synthese bei dem Orthomyxovirus Influenza A 8 Segmente mit (-) Strang Polarität als Nukleoproteinkomplex im Virion Synthese gecappter und polyadenylierter mrna aus (-) Strang Segmenten Inhibierbar durch -Amanitin und Actinomycin D!? Genomisches RNA-Segment mit 5 und 3 konservierten Regionen (vrna) Gecappte mrna mit zellulären? Nukteotiden und 3 -Poly A (mrna) Vollständige Kopie des (-) Segmentes (crna) Capping eukaryontischer mrnas Capping ist ein Prozess des Editings eukaryontischer mrnas Es involviert mehrere Transferasenkatalysierte Reaktionen Es bildet sich u.a. ein 7N-methylguanosyl cap am 5 Ende Gecappte mrnas sind monocistronisch und polyadenyliert Cap-Struktur stabilisiert mrna Capping ist notwendige Voraussetzung für die Initiation der Translation. Cap bindet an den eukariontischen Initiations- Faktor eif4f der die Bindung der RNA ans Ribosom vermittelt.

15 mrna-synthese bei Influenza A Virus: cap snatching Cap -Raub im Nucleus der Wirtszelle Hydrolyse einer beliebige zellulären mrna ( capping erfolgte durch zelluläre Transferase) durch virales Protein CpG Initiation der (+) Strang Synthese durch Einbau eines komplementären GTP an vorletztem C im (-) Strang Segment: Cap-primer-abhängige Initiation G Elongation durch sukkzessivem Einbau komplementärer Nukleotide Aktivierung des Influenza A Virus Polymerasekomplexes Bindung der konservierten (-) Strang Segmentsequenz durch PB1 induziert Bindung gecappter zellullärer mrna an PB2 2. Zur mrna Synthese aktivierter Polymerasekomplex (Komplex ist inaktiv im freien Zustand) 3. Bindung des 3 -Endes an PB1 und Positionierung des hydrolysierten gecappten zellulären mrna-fragmentes zum 3 Ende 4. Templatespezifische Elongation des gecappten primers bis zu einer U7 Sequenz vor dem gebundenen 5 -Ende. Die RNA wird dabei durch den Polymerasekomplex gefädelt (Polymerase ist Fixpunkt, RNA wandert). 5. RNA blockiert eigene Elongation und reiterativer Einbau von As führt zur Polyadenylierung und Termination.

16 Umschaltung von mrna-syntese auf Genomreplikation bei Influenza A Virus durch Polymerasemodifikation PB1 Polymerase wird durch die Bindung von (-) Strang Bindung aktiviert. Daraufhin bindet PB2 mrna PA hat hier keine Funktion. In Gegenwart des viralen NP Proteins erfolgt Bindung an PA. Die Polymerase PB1 wird primer-unabhängig und katalysiert eine komplette crna-synthese Genetische Diversität bei Viren mit RNA-Genomen Die fehlende Akkuratesse von RNA-Polymerasen bedingt den Fehleinbau von Nukleotiden RNA-abhängige RNA Polymerasen haben keine proof-reading Aktivität (keine Exonuklease). Dies führt zu einem Fehleinbau von jedem 1.000sten bis sten Nukleotid. Für die Translation hat dies gegebenenfalls Aminosäureaustausche und Funktionsverlust des Proteins zur Folge. Bezüglich der Replikation bedeuted dies, das typischerweise jedes neue synthetisierte Virion 1-10 Mutationen in seinem Genom aufweist. Eine Population von RNA-Viren ist immer heterogen und bildet somit eine Quasispezies Die Segmentierung viraler Genome (Influenza A) ermöglicht Neukombinationen Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten segmentierten Viren erlaubt eine Neuver- Teilung der viralen Gensegmente. Bei Influenza A Viren führt dies regelmäßig zur neuen Virussubtypen mit antigener Diversität. RNA-Rekombination ermöglicht den Austausch von viralen und zellulären Gensegmenten Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten Viren erlaubt Rekombination durch Sprung Der Polymerase auf den anderen Strang (Template-abhängig). Rekombination viraler und zellulärer RNAs kann zur Integration neuer gene führen (z.b. Eibau zellulärer Gene der Zellzyklusregulation).