Biokatalysen zur Darstellung enantiomerenreiner Wirkstoffvorstufen mit Hilfe kälteaktiver Enzyme

Transkript

1 Abschlussbericht AZ: Wirkstoffvorstufen mit Hilfe kälteaktiver Enzyme Projektpartner: Dr. Rieks GmbH, Uetersen (Dr. Markus Kähler, Dr. André Rieks, Dr. Ulrike Kirchner, Kerstin Wiggenhorn, Mona Kinzer); Rieks GmbH Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, Institut für Chemie und Biochemie (Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer, Marlen Schmidt, Angelika Eisner); Universität Greifswald UNA Synth GmbH, Uetersen (Dr. Wolfgang Petersen, Frauke Ellerbrock, Stefan Bollow); UNA Synth GmbH Projektkoordination: Dr. Markus Kähler (Dr. Rieks GmbH) Stand: 28. Juni

2 Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung 2. Zielsetzung 3. Angewandte Methoden 3.1. Projektpartner Universität Greifswald 3.2. Projektpartner Rieks GmbH 3.3. Projektpartner UNA Synth GmbH 4. Ergebnisse und Diskussion 4.1. Projektpartner Universität Greifswald 4.2. Projektpartner Rieks GmbH 4.3. Projektpartner UNA Synth GmbH 5. Ökologische und ökonomische Evaluation (Unterauftrag an UNA Labor GmbH) 6. Soll-/Ist-Vergleich 7. Ausblick auf den Projektanschluss 8. Kooperationen im Rahmen des Projekts 9. Teilnahme an projektrelevanten Veranstaltungen 10. Literatur Stand: 28. Juni

3 1. Zusammenfassung Ziel des Projekts war die Entwicklung von biotechnologischen Verfahren zur Herstellung enantiomerenreiner sekundärer Alkohole durch den Einsatz ausgewählter und teilweise evolutiv verbesserter Lipasen und Esterasen sowie durch Optimierung von Prozeßabläufen mit Hilfe einer Reaktionsführung bei tiefen Temperaturen. Zu Beginn wurden Modellsubstrate in ausreichenden Quantitäten synthetisiert und die notwendige Chiralanalytik via HPLC und GC etabliert. Der Aufbau von Systemen zum Hochdurchsatz-Screening für die Durchmusterung vorhandener Esterasebibliotheken sowie zur gerichteten Evolution der Esterasen wurden vom Projektpartner Universität Greifswald erfolgreich durchgeführt. Im Rahmen eines umfangreichen Screenings wurden Esterasebibliotheken für die Modellsubstrate 3-Hydroxytetrahydrofuran und 3- Butin-2-ol getestet. Hierzu wurde ein eigener neuer Acetat-Assay erfolgreich im Mikrotiterplatten-Maßstab eingesetzt. Einen Schwerpunkt des Projekts stellten die Versuche zur gerichteten Evolution von Esterasen dar. Dieser Ansatz führte auf sehr zufrieden stellende Weise zur Generierung neuer enantioselektiver Enzyme. So konnten beispielsweise neue Esterase-Mutanten mit verbesserter Selektivität für (S)-3-Butin-2-ol detektiert werden. Diese Mutanten zeigten beim Projektpartner Rieks GmbH im präparativen Maßstab eine deutliche Steigerung der Enantioselektivität. Durch Optimierung der Reaktionsparameter konnte ein weiteres Up-Scaling zur präparativen Synthese enantiomerenreinen (S)-3-Butin-2-ols vorbereitet werden. Parallel erfolgte bei den Projektpartnern Rieks GmbH und UNA Synth GmbH die Etablierung der verfahrenstechnischen Basis für die industrielle Produktion. Auf Grund eines frühzeitig verfügbaren Enzym-Systems, das auch bei tiefen Temperaturen und damit verbundener hoher Selektivität ausreichend aktiv war, konnte ein leistungsfähiges Scale-up für (S)-1-Methoxy-2-propanol im kg-maßstab abgeschlossen werden. Dank der engen Kooperation zwischen allen Projektpartnern konnte somit in der zurückliegenden Projektzeit ein Verfahren zur biotechnologischen Synthese eines enantiomerenreinen sekundären Alkohols erarbeitet werden. Die hieraus abgeleiteten Kenngrößen wurden im Rahmen einer ökologischen und ökonomischen Evaluation bewertet. Danach zeichnen sich umweltrelevante Vorteile gegenüber den chemischtechnischen Prozessen ab. In den nachfolgenden Projektphasen galt es, die bereits etablierte technologische Basis eines jeden Projektpartners im Rahmen der Verwirklichung weiterer enantiomerenreiner Synthesen auszubauen und den Übergang von der Molekularbiologie über den labortechnischen Ansatz bis hin zum fertigen Massenprodukt zu realisieren. Stand: 28. Juni

4 2. Zielsetzung des Projekts Ziel des Projekts war die Entwicklung eines biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung enantiomerenreiner sekundärer Alkohole für die Verwendung als pharmazeutische Wirkstoffvorstufen. Gegenwärtig existierende verfahrenstechnische Schranken sollen durch den Einsatz ausgewählter und teilweise evolutiv verbesserter Lipasen und Esterasen sowie durch Optimierung von Prozeßabläufen beseitigt werden. Enantiomerenreine Alkohole stellen vielseitig einsetzbare Synthesebausteine dar, die in entsprechenden Folgereaktionen stereospezifisch in Amine, Halogenide, Thiole usw. umgewandelt werden können. Auch als Syntheseintermediate bei der Darstellung von Naturstoffen wie Steroiden, Vitaminen, Prostaglandinen und Pheromonen spielen sie eine wichtige Rolle. Die im Rahmen des Vorhabens zu synthetisierenden sekundären Alkohole, insbesondere 1-Methoxy-2-propanol, 3-Butin-2-ol und 3-Hydroxytetrahydrofuran, stellen Schlüsselsubstanzen von enormer medizinischer Relevanz dar und bergen hinsichtlich ihrer vielfältigen Verwendung als Synthesevorstufen enantiomerenreiner Pharmazeutika ein immenses Potenzial. Zahlreiche Medikamente können effizient und umweltschonend aus den genannten Schlüsselverbindungen synthetisiert werden. Enantiomerenreines 3-Butin-2-ol stellt beispielsweise die Vorstufe für (-)-Akolactone, ein zytostatisches Butanolid, oder das Antitumor-Alkaloid Pancrastatin dar. Ferner können ausgehend von diesem Alkohol HIV-Proteaseinhibitoren, Thrombose- und Arteriosklerosemedikamente sowie substituierte Alkinylharnstoffe, welche als Lipoxygenasehemmer beschrieben werden, hergestellt werden. 3- Hydroxytetrahydrofuran findet als Baustein bei der Synthese von antiviralen Wirkstoffen, Atemwegstherapeutika oder Asthmamitteln Verwendung. Die Herstellung enantiomerenreiner Alkohole ist eine der großen Herausforderungen der organischen Synthese. Im Laufe der letzten Jahre wurden Biokatalysen bei der Synthese von Feinchemikalien eine zunehmend attraktive Alternative gegenüber konventionellen chemischen Methoden. Biokatalysen verlaufen in der Regel unter milden Reaktionsbedingungen. Stand: 28. Juni

5 Hinsichtlich der Minimierung von Energiekosten, einer Vermeidung des Einsatzes toxischer Reagenzien, der Reduzierung von Abfall- und Nebenprodukten sowie einer optimierten Produktausbeute bieten Biokatalysen eine Reihe umweltrelevanter Vorteile gegenüber chemischen Verfahren. Letztere werden oft bei hohen Temperaturen und Drücken sowie in Gegenwart umweltgefährdender Schwermetallkatalysatoren durchgeführt. Sie bedingen nicht nur große Energiemengen, sondern erzeugen auch Rückstände und Nebenprodukte, welche aus dem gewünschten Produkt entfernt werden müssen. Die ökologischen Vorteile von Biokatalysen gehen einher mit der Eigenschaft der Enzyme, eine Vielzahl von Reaktionen stereo- und enantioselektiv zu katalysieren. Insbesondere Lipasen und Esterasen bieten sich auf Grund ihres Substratspektrums für einen Einsatz in Biokatalysen an. Im Rahmen des geplanten Projekts sollte das biokatalytische Potenzial gut charakterisierter Esterasen durch Methoden der gerichteten Evolution hinsichtlich verfahrensrelevanter Parameter (Substratspezifität, Enantioselektivität, ggf. Kälteaktivität) optimiert werden. Anforderungsgerecht ausgewählte Lipasen oder Esterasen sollten hinsichtlich einer Verfahrenstauglichkeit getestet und gegebenenfalls in den Prozeß integriert werden. Begleitend sollte die notwendige Aktivitäts- und Chiralanalytik etabliert werden. Eine effiziente enantiomerenreine Darstellung leichtflüchtiger sekundärer Alkohole erforderte die Entwicklung eines neuen Synthese- und Produktaufbereitungsverfahrens, welches einerseits eine effektive Darstellung, andererseits eine effiziente, kostengünstige Isolierung der Wirkstoffe aus dem Reaktionsansatz ermöglicht. Durch eine optimierte Prozeßführung sollten die angestrebten Produktreinheiten und - ausbeuten sichergestellt werden. Stand: 28. Juni

6 3. Angewandte Methoden 3.1. Projektpartner Universität Greifswald Im Rahmen des Projekts wurden im Arbeitsbereich des Projektpartners Universität Greifswald folgende Methoden angewandt: Chemische und enzymatische Modellsubstratsynthese Chromatographische und destillative Substratreinigung Chiralanalytik (GC) Error-prone PCR, Quik Change Steady-State-Growth -Methode und Esteraseexpression in Mikrotiterplatten Enzymaktivitäts- und Enantioselektivitäts-Screening im Hochdurchsatz (HTS) mit Hilfe eines im Haus etablierten Acetat-Assays Kultivierung ausgewählter Mutanten Präparation (im Schüttelkolben und Fermenter) und Charakterisierung lyophilisierter Rohextrakte Biokatalysen in µg und mg Maßstab zur Verifizierung der Ergebnisse, aus dem Acetat-Assay 3.2. Projektpartner Rieks GmbH Folgende Methoden wurden vom Projektpartner Rieks GmbH angewandt: Chemische Modellsubstratsynthese Chromatographische Substratreinigung im semipräparativen Maßstab Chiralanalytik (HPLC, Chiralyzer) Chromatographische Anreicherung und Aufreinigung von Enzymen aus Rohextrakten Enzymkinetische Messungen im Labormaßstab Enzymatische Racematspaltung Extraktive und destillative Produktaufarbeitung Maßanalyse zur Reinheits- und Aktivitätsbestimmung Stand: 28. Juni

7 3.3. Projektpartner UNA Synth GmbH Folgende Methoden wurden vom Projektpartner UNA Synth GmbH angewandt: Ausarbeitung eines Ex-Schutzkonzepts Installation Ex-geschützter Bauteile Entwicklung von Stoffstromkonzepten Destillationen polynärer Gemische im Hochvakuum Fraktionierte Destillation im industriellen Maßstab an Füllkörperkolonne Festphasenextraktion an polaren und unpolaren Adsorbentien Fraktionierte Desorption im industriellen Maßstab Mehrstufige Fördertechnik für Flüssigmedien Feststoffrückgewinnungstechniken aus Flüssigmedien Lösemittelrezyklierung Entwicklung und Aufbau von Prozeßleitsystemen Datenverarbeitung prozeßrelevanter Meßgrößen Entwicklung und Umsetzung eines Konzepts zur Wassereinsparung 4. Ergebnisse und Diskussion Im Folgenden werden die von den jeweiligen Projektpartnern durchgeführten Arbeiten nach einzelnen Projektzielen gegliedert dargestellt und diskutiert. Stand: 28. Juni

8 4.1. Projektpartner Uni Greifswald Bereitstellung der projektrelevanten Substrate (durch Synthese, sofern kommerziell nicht erhältlich) Die Synthese der racemischen bzw. optisch reinen Acetate bzw. Butyrate (2-Acetoxy-3- butin, 2-Butyroxy-3-butin und Tetrahydrofuryl-3-acetat) erfolgte zu Beginn der Projektlaufzeit im Gramm-Maßstab in Gegenwart von Pyridin mit Acetyl- bzw. Butyrylchlorid als Acyldonoren. Die Aufreinigung erfolgt über Kieselgelchromatographie durch Elution mit geeigneten Lösungsmittelgradienten oder über Destillation. Die Ausbeuten lagen meist unter 50%. Es erschien sinnvoll, die Synthese enzymatisch mit der Lipase B von Candida antartica (CAL-B) und Vinylacetat (Umesterung) durchzuführen, da CAL-B für die Substrate keine Enantioselektivität zeigt. Folglich war eine quantitative Umsetzung des racemischen Alkohols möglich. Die weiteren Vorteile enzymatischer Synthesen gegenüber chemischen Synthesen sind hier unter anderem die milderen Reaktionsbedingungen, die geringere Reaktionszeit und die nicht anfallenden giftigen Abfälle (z.b. Pyridin). Es war ein 100%iger Umsatz des Alkohols zum Acetat in kurzer Zeit zu beobachten, Substrat und Produkt mussten somit nicht mehr durch Säulenchromatographie voneinander getrennt werden. Es erfolgte lediglich eine Destillation um das entsprechende Produkt vom Lösungsmittel und überschüssigem Vinylacetat zu trennen, was wiederum einen Vorteil gegenüber der chemischen Methode darstellt. Die Ausbeuten für Tetrahydrofuryl-3-acetat lagen für die racemischen und enantiomerenreinen Formen bei etwa 95%, die für 2-Acetoxy-3-butin bei etwa 70%, was auf die größere Flüchtigkeit zurückzuführen ist Entwicklung der gaschromatographischen Chiralanalytik zum differenzierten Nachweis der Produktenantiomere Im Arbeitskreis erfolgte die Weiterentwicklung der gaschromatographischen Chiralanalytik. Die Enantiomere von 3-Butin-2-ol, 2-Acetoxy-3-butin, 2-Butyroxy-3- butin, 3-Hydroxytetrahydrofuran und Tetrahydrofuryl-3-acetat konnten grundliniengetrennt werden. Stand: 28. Juni

9 Die Analyse erfolgt am GC-14A Gaschromatograph (Shimadzu) unter Einsatz chiraler Säulen (Säule 1: Hydrodex -β-3p (Heptakis-(2,6-di-O-methyl-3-O-pentyl-βcyclodextrin) (25 m, 0,25 mm), Säule 2: Heptakis-(2,3)-di-O-acetyl-6-O-TBDMS-βcyclodextrin (25 m, 0,25 mm)). Die entsprechenden Säulentemperaturen, Säulendrücke (Trägergas Wasserstoff) und Retentionszeiten sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Injektions- und Detektions-Temperaturen betragen jeweils C. Tabelle 1: Übersicht zur GC-Analyse Verbindung Säule Temp. [ C] Druck [kg/cm 2 ] Retentionszeit [min] 3-Butin-2-ol ,5 9,7 (R) und 10,2 (S) 2-Acetoxy-3-butin ,25 4,3 (R) und 6,6 (S) ,5 11,9 (R) und 18,3 (S) 2-Butyroxy-3-butin ,25 16,7 (R) und 20,5 (S) 3-Hydroxytetrahydrofuran ,25 11,3 (R) und 12,9 (S) Tetrahydrofuryl-3-acetat ,25 5,9 (R) und 6,7 (S) Die folgenden Abbildungen der Chromatogramme verdeutlichen die Basislinientrennung der Verbindungen. Die absolute Konfiguration (R) bzw. (S) ist in Tabelle 1 aufgeführt. Abbildung 1: 2-Acetoxy-3-butin getrennt bei 40 C und 1,25 kg/cm 2 an Säule 1 Stand: 28. Juni

10 Abbildung 2: 3-Butin-2-ol getrennt bei 40 C und 0,5 kg/cm 2 an Säule 1 Abbildung 3: 3-Hydroxytetrahydrofuran getrennt bei 110 C und 1,25 kg/cm 2 an Säule 2 Abbildung 4: Tetrahydrofuryl-3-acetat getrennt bei 80 C und 1,25 kg/cm 2 an Säule Übertragung der entwickelten Analytik zum Hochdurchsatz-Screening im Mikrotiterplattenformat (HTS-MTP-Test) auf die Modellverbindungen Hierbei lag der Schwerpunkt des "mehrdimensionalen Screenings" auf der Detektion der Aktivität und der Enantioselektivität. Im Mikrotiterplattenformat wurde der im Arbeitskreis entwickelte Acetat-Assay eingesetzt. Dieses Testverfahren kann zur Durchmusterung von Esterasen und Lipasen bezüglich ihrer Aktivität gegenüber 2- Acetoxy-3-butin und Tetrahydrofuryl-3-acetat verwendet werden. Stand: 28. Juni

11 Die zu untersuchende Hydrolase-katalysierte Reaktion setzt Essigsäure frei, die anschließend in einer Kaskade von Enzymreaktionen bestimmt wird. Dabei wird Essigsäure in Gegenwart von ATP und Coenzym A (CoA) durch Acetyl-CoA- Synthetase (ACS) zu Acetyl-CoA umgesetzt. Die Citratsynthase (CS) katalysiert die Reaktion zwischen Acetyl-CoA und Oxalacetat zu Citrat, das dafür notwendige Oxalacetat stammt aus der L-Malat-Dehydrogenase (L-MDH) katalysierten Reaktion von Malat und NAD + (siehe Abbildung 5). So kann die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit der Essigsäureentstehung durch Messung der Zunahme von NADH spektrophotometrisch bei 340 nm bestimmt werden 1. Zu 150 µl Mischung aus Testkit-Komponenten (Master Mix) werden 20 µl Enzym- und 20 µl Substratlösung (15 mg/ml) für 2-Acetoxy-3-butin bzw. 10 µl Substratlösung (5 mg/ml) für Tetrahydrofuryl-3-acetat gegeben und die Absorption bei 340 nm gemessen. Als Kontrolle dienen Mischungen des Testkits mit Zugabe von Puffer ohne Substrat bzw. Enzym. O O Hydrolase OH R 1 R 2 + H 2 O Acetic acid + R 1 R 2 CoA Citrate CS ACS ATP H 2 O NADH + H + + Oxaloacetate Acetyl-CoA L-MDH L-Malate + NAD + AMP + Pyrophosphate Abbildung 5: Schema des Acetat-Assay 1 Baumann et al., (2001), Angew. Chem. Int. Ed. 40, Stand: 28. Juni

12 Durchmusterung der im Arbeitskreis des Projektpartners Prof. U. T. Bornscheuer verfügbaren kommerziellen Lipasen oder Esterasen und neu charakterisierten Wildtyp- Esterasen auf Aktivität und Bestimmung der Enantioselektivität durch GC-Analytik Kommerziell erhältliche Lipasen und Esterasen wurden mit Hilfe des Acetat-Assays in Mikrotiterplatten auf ihre Aktivität gegenüber 2-Acetoxy-3-butin und Tetrahydrofuryl- 3-acetat (jeweils in enantiomerenreiner Form und als Racemat) getestet. Dafür werden von kommerziell erhältlichen Lipasen und Esterasen 20 µl einer 2 mg/ml Stammlösung verwendet. Mit Hilfe eines Roboters (Tecan Miniprep75, Crailsheim, Germany) werden 150 µl Master Mix und 20 bzw. 10 µl der Substratlösung pipettiert. Anschließend wird die Zunahme an NADH zu verschiedenen Zeitpunkten am Fluorimeter "Fluostar Galaxy" oder "Fluostar Optima" (beide BMG) über die Absorption bei 340 nm gemessen. Die Aktivität der Enzyme wird als Zunahme der Absorption pro Zeiteinheit bestimmt. Durch Vergleich der Aktivitäten eines Enzyms bezüglich des (S)- Enantiomers und des (R)-Enantiomers kann eine Aussage über die Enantioselektivität gemacht werden (so genannte scheinbare Enantioselektivität E app ). Mit Enzymen, die eine Selektivität zeigen, werden Reaktionen im größeren Maßstab durchgeführt und die wahre Enantioselektivität (E true ) am Gaschromatographen ermittelt. Die Reaktionsansätze im Eppendorfreaktionsgefäß setzen sich wie folgt zusammen: 2 mg Enzym, 1 ml Natriumphosphatpuffer ph 7,4 10 mm, 1,5 µl Acetat (des entsprechenden racemischen Alkohols). Die Proben werden bei Raumtemperatur geschüttelt, zu bestimmten Zeitpunkten werden 100 µl Proben entnommen, zweimal mit je 100 µl Dichlormethan extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet und mit Stickstoff eingeengt. Anschließend werden die Proben am Gaschromatographen analysiert und Enantioselektivitäten sowie Umsätze berechnet. Stand: 28. Juni

13 Die Berechnung der Enantioselektivität und des Umsatzes erfolgt nach Chen et al. 2 %ee = (peak area R-peak area S)/(peak area R+peak area S)*100 C=ees/(ees +eep) E = ln[1-c(1+eep)]/ln[1-c(1-eep)] oder E = ln[(1-c)(1-ees)]/ln[(1-c)(1+ees)] Es wurden 120 kommerziell erhältliche Esterasen und Lipasen mit dem Acetat-Assay getestet, von denen die meisten Enzyme aktiv gegenüber beiden Substrate sind. Dabei zeigten 10 Enzyme der Firma Diversa und 2 Chirazyme Enzyme eine höhere Enantioselektivität E app gegenüber 2-Acetoxy-3-butin und 5 Enzyme der Firma Diversa gegenüber Tetrahydrofuryl-3-acetat. Von diesen Enzymen zeigt eines einen E-Wert von 40 bei einem Umsatz von 55% gegenüber 2-Acetoxy-3-butin in der Verifizierung im µl Maßstab. Bei einer Umsetzung im präparativen Maßstab erreicht man allerdings einen Umsatz von nur 20% mit einem viel geringeren E-Wert von 8. Ein kommerzielles Enzym, das Selektivität gegenüber Tetrahydrofuryl-3-acetat zeigt, wurde nicht gefunden und ist auch noch nicht in der Literatur beschrieben worden Durchmusterung der im Arbeitskreis von Prof. U. T. Bornscheuer bereits vorhandenen Esterasebibliotheken Im Arbeitskreis sind bereits aus früheren Arbeiten einige Esterase-Bibliotheken vorhanden, welche durch error-prone PCR (eppcr) erstellt wurden. Als Expressionsvektor kommen hierbei Derivate des Rhamnose-induzierbaren Plasmids pjoe2702 zum Einsatz 3. Die Esterasegene stehen auf diesem mid-copy-plasmid (pjoe2792) bzw. high-copy-plasmid (pgaston) unter der Kontrolle eines Rhamnoseinduzierbaren Promotors 4. Die bereits bestehenden Bibliotheken, ausgehend von einer Bacillus subtilis p-nitrobenzylesterase (BsubpNBE)(Wildtyp und Mutante G105A), einer Bacillus subtilis Esterase (BsubE) (Wildtyp), einer Bacillus stearothermophilus Esterase (BsteE) (Wildtyp) und einer Pseudomonas fluorescens Esterase (PFEI) (Wildtyp), wurden auf ihre Aktivität gegenüber 2-Acetoxy-3-butin und Tetrahydrofuryl- 3-acetat getestet. 2 Chen et al., (1982), J. Am. Chem. Soc. 104, Stumpp et al., (2000), Biospektrum 6, Schmitt et al., (1993), Mol. Biol. Reports 18, Stand: 28. Juni

14 Die Esteraseexpression erfolgte im Mikrotiterplattenformat unter Anwendung der so genannten "Steady State Growth"-Methode. Zunächst wird dabei von einer Masterplatte (Glycerolstock) eine Produktionsplatte angefertigt, indem je 200 µl LB-Medium (mit Ampicillinzusatz; LB/Amp ) unter Zuhilfenahme eines Stempels angeimpft werden und für 24 Stunden bei 37 C inkubiert werden. Die Kultur befindet sich dann in der stationären Phase ihres Wachstums. Damit ist sichergestellt, dass sich die Kulturen in allen Vertiefungen der Platte in der gleichen Wachstumsphase befinden und somit verglichen werden können. Mit Hilfe des Roboters werden dann 100 µl Kultur zu 100 µl frischem LB/Amp pipettiert, erneut für ca. 3 bis 4 Stunden inkubiert und dann in der exponentiellen Phase die Esteraseexpression durch Zugabe von 20 µl einer 1%igen L- Rhamnoselösung induziert. Nach weiteren fünf Stunden werden die Zellen geerntet. Dazu wird die Platte 15 Minuten bei 1750 g und 4 C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zu jeder Vertiefung werden 200 µl Lysispuffer mit DNase I und Lysozym pipettiert und die Zellen durch Gefrier-Auftauzyklen aufgeschlossen. Nach erneuter Zentrifugation wird der Überstand in eine neue Platte überführt, von dem dann wiederum 20 µl (die Esterase enthaltend) abgenommen werden. Anschließend wird der Acetat-Assay wie oben durchgeführt (Abbildung 6). Stand: 28. Juni

15 Abbildung 6: Schema zur Enzymproduktion in MTP ausgehend von einer Masterplatte Insgesamt wurden mit 58 Masterplatten (5568 Klone) nach diesem Schema (Enzymproduktion in MTP und anschließendes Screening mit Acetat-Assay) durchmustert. Dabei zeigten ca. 12% aller Varianten Aktivität gegenüber 2-Acetoxy-3- butin und nur etwa 1% Aktivität gegenüber Tetrahydrofuryl-3-acetat. Einige wenige Enzymvarianten zeigten höhere Enantioselektivitäten (E app ), die allerdings nach der Verifizierung (E true ) im µl-maßstab nicht bestätigt werden konnten. Stand: 28. Juni

16 Generierung weiterer Esterasebibliotheken (ausgehend von BsteE, BsubE, BsubpNBE, PFEI und einer Esterase aus Streptomyces diastatochromogenes (SDE)) durch eine Methode der gerichteten Evolution: eppcr und Durchmusterung der Mutanten mittels HTS-MTPTest Die Gene, kodierend für die entsprechenden Esterasen, befinden sich im Vektor pjoe oder pgaston (Derivate des Rhamnose-induzierbaren Plasmids pjoe2702), von denen sich die entsprechenden Primer ableiten. Durchgeführt wurde folgende eppcreaktion: 10 µl dntpmix (2 mm ATP, 2 mm GTP, 10 mm CTP, 10 mm TTP), 10 µl Mutationspuffer (70 mm MgCl 2 ; 500 mm KCl; 100 mm Tris ph 8; 0,1% (w/v) Gelatine), je 1 µl Forward und Reverse Primer, 1 µl 50 µg/ml Plasmid DNA gewonnen aus Plasmidisolation mit QIAprep Spin Miniprep Kit einer 5 ml Übernachtkultur, 1 µl Taq Polymerase, 3 bzw. 5 µl 10 mm MnCl 2, ad 100 µl Wasser unter den Reaktionsbedingungen: 1) 95 C 60 s, 2) 25 Zyklen: 95 C 30 s, 50 C 30 s, 72 C 45 s, 3) 72 C 150 s. Anschließend erfolgte eine Aufreinigung der PCR-Produkte mittels QIAquick TM PCR Purification Kit, das Erzeugen kohäsiver Enden durch Verdau mit den entsprechenden Restriktionsenzymen, die Ligation in den leeren Vektor und die Transformation in einen E. coli Stamm. Die erhaltenen Transformanden wurden mittels replica plating auf eine "Produktionsplatte" (LB/Amp Agarplatte die zusätzlich Rhamnose enthält) überführt, um die Aktivität gegenüber α-naphthylacetat zu testen. Aktive Klone färben sich durch die Zugabe von Fast Red rot und werden in eine Masterplatte gepickt. Dabei befinden sich in jedem Well einer 96er Mikrotiterplatte 200 µl LB/Amp, die Inkubation erfolgt unter leichtem Schütteln bei 37 C für 16 h. Zu jedem Well werden 100 µl 60%iges Glycerol oder DMSO gegeben und die Platten bei 80 C gelagert (siehe auch Abbildung 6). Die Enzymproduktion und Durchmusterung von 15 Platten (1440 Klone) erfolgte wie bereits oben beschrieben. Ausgehend von PFEI, SDE und BsubpNBE zeigten fast alle produzierten Varianten eine hohe Aktivität gegenüber 2-Acetoxy-3-butin. Die Aktivitäten gegenüber Tetrahydrofuryl-3-acetat sind deutlich geringer, die Aufnahme der Kinetik / Zunahme der NADH Konzentration erfolgte über Nacht, während die Messung im Falle des Stand: 28. Juni

17 anderen Substrats nur ein bis zwei Stunden benötigte. Außerdem ist aufgefallen, dass im Fall von BsubpNBE weitaus mehr inaktive Varianten vorlagen. Die Mengen an produzierten BsteE und BsubE im Mikrotiterplattenformat reichen aufgrund der geringen spezifischen Aktivitäten kaum aus, um ein gutes Screening durchzuführen. Von den aktiven Klonen zeigten 40 einen höheren E app gegenüber 2-Acetoxy-3-butin und 8 einen höheren E app gegenüber Tetrahydrofuryl-3-acetat als der jeweilige Wildtyp. Nach der Verifizierung im µl-maßstab konnte eine Mutante mit einem deutlich veränderten Verhalten gegenüber 2-Acetoxy-3-butin identifiziert werden. Nach der Sequenzierung wurde eine Dreifachmutante der PFEI (Ile76Val/Gly98Ala/Val175Ala) bestimmt. Diese Mutante wurde genauer untersucht und charakterisiert. Gleichzeitig wurden ausgehend von dieser Dreifachmutante alle Einfach- und Doppelmutanten durch Quik Change hergestellt und ebenfalls genauer charakterisiert. Dabei wurde zufällig eine weitere Mutante der PFEI (Ile76Val/Asp99Glu/Val175Ala) erzeugt. Abbildung 7 zeigt die Struktur der PFEI, die Aminosäuren, die die katalytische Triade bilden, sind in Rot dargestellt (Ser94, His 251, Asp222), die Positionen der Mutationen sind Blau (Ala98), Grün (Ala175) und Gelb (Val76) dargestellt. Abbildung 7: Proteinstruktur der PFEI Stand: 28. Juni

18 Die Dreifachmutante Ile76Val/Gly98Ala/Val175Ala produziert bei einer 37 C Kultivierung Inclusion Bodies (IB) und damit sehr wenig lösliches Enzym mit einer geringen spezifischen Aktivität gegenüber p-nitrophenylacetat (pnpa). Die IB-Bildung konnte durch Kultivierung bei niedrigeren Temperaturen (25 C und 16 C) verringert und gleichzeitig die spezifische Aktivität gesteigert werden, allerdings nicht in dem Ausmaß, das Aktivitäten gleichwertig mit denen des Wildtyps erreicht wurden. Außerdem kann nicht die gleiche Enzymmenge bei geringeren Expressionstemperaturen erlangt werden. Die Doppelmutanten Ile76Val/Gly98Ala, Gly98Ala/Val175Ala und die Einfachmutante Gly98Ala produzieren Enzym, welches als IB vorliegt und eine deutlich geringere spezifische Aktivität gegenüber pnpa zeigen. Die Mutanten ohne den Glycin-Alanin- Austausch an Position 98 zeigen keine IB und ähnliche spezifische Aktivitäten wie der Wildtyp. Der Aminosäureaustausch an der Position 98 führt demzufolge zur IB- Bildung. Die Mutation liegt dicht an der katalytischen Triade im Zentrum der dreidimensionalen Struktur des Proteins. Sie befindet sich in einer α-helix, die durch die Einführung einer Methylgruppe unterbrochen sein könnte, oder deren Ausbildung verhindert, was wiederum zum Zusammenbruch oder einer veränderten Proteinstruktur führt, mit der Folge der IB-Bildung. Bemerkenswert ist, dass die Variante Ile76Val/Asp99Glu/Val175Ala, mit einem nur um eine Position versetzten Aminosäureaustausch, keine IB ausbildet, d.h. die Struktur erhalten bleibt. Weiterhin kann man erkennen, dass das Vorhandensein aller drei Mutationen die stärkste Auswirkung auf die IB-Bildung hat, gefolgt von den Doppelmutanten Gly98Ala/Val175Ala und Ile76Val/Gly98Ala und dann erst von der Einfachmutante Gly98Ala. Das heißt, dass die Aminosäureaustausche von Val zu Ala an Position 175, in einer α-helix an der Oberfläche des Proteins, und Ile zu Val an Position 76, im Inneren des Proteins, ebenfalls einen Einfluss auf die Aktivität haben, allerdings in einem geringeren Ausmaß. In Tabelle 2 sind spezifische Aktivitäten und Angaben zur IB-Bildung aller Mutanten und des Wildtyps aufgeführt. Stand: 28. Juni

19 Tabelle 2: Spezifische Aktivitäten gegenüber pnpa Lyophilisat Pellet Abkürzungen Enzymvariante von PFEI U/mg Protein IB U/mg Protein WT Wildtyp 77 - V2A Ile76Val/Gly98Ala/Val175Ala 0, ,1 2A Gly98Ala /Val175Ala 0,2 + 1,1 VA1 Ile76Val/Gly98Ala 0,6 + 1,7 A1 Gly98Ala VEA Ile76Val/Asp99Glu/Val175Ala 37 - V Ile76Val 49 - VA2 Ile76Val/Val175Ala 57 - A2 Val175Ala 67 - Die Aktivitäten wurden ebenfalls gegenüber α-naphthylacetat auf einem SDS-Gel überprüft. Gebildetes α-naphthol komplexiert mit Fast Red und färbt die entsprechende Proteinbande rot an. Der Wildtyp, Val175Ala und Ile76Val zeigen neben einer deutlichen Überexpression eine deutliche Rotfärbung und damit Aktivität gegenüber α- Naphthylacetat. Ile76Val/Asp99Glu/Val175Ala und Ile76Val/Val175Ala zeigen ebenfalls eine deutliche Überexpression, allerdings völlig unerwartet nur geringe Banden in der Aktivitätsfärbung. Gly98Ala und Ile76Val/Gly98Ala zeigen Proteinbanden, nicht überexprimiert und ohne Aktivität. Im Falle von Ile76Val/Gly98Ala/Val175Ala und Gly98Ala /Val175Ala kann man kaum die entsprechende Proteinbande im SDS-Gel erkennen, und ebenfalls keine Aktivität gegenüber α-naphthylacetat nachweisen. Alle Enzymvarianten sind auf einem Gel in Abbildung 8 zusammengefasst. Stand: 28. Juni

20 kda 66 M VEA2 V2A 2A V A2 WT VA2 A1 VA Abbildung 8: SDS-Gel mit Aktivitäts- und Coomassie-Färbung aller Enzymvarianten Im folgenden Abschnitt wird das Hydrolyse-Verhalten der einzelnen Enzymvarianten gegenüber der Modellsubstanz 2-Acetoxy-3-butin beschrieben. Alle Versuche dazu wurden in 1 ml Natriumphosphatpuffer (10 mm ph 7,4) bei 37 C, etwa gleicher Enzymmenge und einer Substratkonzentration von 25 mm durchgeführt. Die PFEI beginnt die Hydrolyse von 2-Acetoxy-3-butin als selektives Enzym, und erreicht schnell einen 53%igen Umsatz mit E = 64. Allerdings steigt der Umsatz schnell weiter bis auf 96% und racemisches 3-Butin-2-ol wird gebildet, der E-Wert sinkt auf etwa 3, siehe Abbildung 9. Die Dreifachmutante Ile76Val/Gly98Ala/Val175Ala erreicht sehr langsam (aufgrund der IB und damit geringen Menge an aktivem Enzym) einen Umsatz von 54% bei einem E-Wert von 89, es erfolgt kein weiterer Umsatz (Abbildung 10). Stand: 28. Juni

21 Umsatz [%] Umsatz E E t [min] Abbildung 9: Hydrolyse von racemischem 2-Acetoxy-3-butin durch PFEI Umsatz [%] Umsatz E 100 E t [h] Abbildung 10: Hydrolyse von racemischen 2-Acetoxy-3-butin durch die Dreifachmutante Ile76Val/Gly98Ala/Val175Ala (V2A) Stand: 28. Juni

22 Die Einfachmutanten Val175Ala (A2) und Ile76Val (V) erreichen wie der Wildtyp sehr schnell einen Umsatz von 50% nach bereits einer Minute (!) der Hydrolyse, aber mit E >100. Die Umsätze steigen dann langsam bis auf maximal 74% mit E = 26 nach 25 h bzw. bis auf 83% mit E = 16 nach 25 h. Sie verhalten sich ähnlich wie der Wildtyp, benötigen aber viel länger um höhere Umsatzraten zu erreichen. Die Doppelmutanten Gly98Ala /Val175Ala (2A) und Ile76Val/Gly98Ala (VA1) erreichen nach ca. 3 h bzw. 10 min ihren maximalen Umsatz von 40% mit E > 100 bzw. 25% mit E = 80. Danach erfolgt wie bei der Dreifachmutante kein weiterer Umsatz. Die Einfachmutante (A1) Gly98Ala setzt trotz geringer aktiver Enzymmenge (IB Bildung) 2-Acetoxy-3-butinol nach bereits 5 min zu 52% um, der E-Wert ist dabei größer als 100, der Umsatz steigt bis auf maximal 57% mit E = 90 nach 25 h Umsatz 2A E 2A Umsatz A1 E A Umsatz [%] E t [min] Abbildung 11: Hydrolyse von racemischem 2-Acetoxy-3-butin durch die Mutanten Gly98Ala /Val175Ala (2A) und Gly98Ala (A1) Die Doppelmutante (VA2) Ile76Val/Val175Ala erreicht einen maximalen Umsatz nach 20 min von 53% mit E = 96. Die zufällig entstandene Mutante (VEA2) Ile76Val/Asp99Glu/Val175Ala verhält sich dazu sehr ähnlich, der maximale Umsatz von 53% ist nach 7 h erreicht, der E-Wert beträgt dabei 92. Stand: 28. Juni

23 Umsatz [%] E 20 Umsatz E t [min] 0 Abbildung 12: Hydrolyse von racemischem 2-Acetoxy-3-butin durch die Mutante Ile76Val/Val175Ala (VA2) Die Mutanten Ile76Val/Gly98Ala/Val175Ala (V2A) und Ile76Val/Val175Ala (VA2) wurden im 4 Liter-Maßstab fermentiert und dem Projektpartner Rieks GmbH für weitere Untersuchungen zur Verfügung gestellt. Im Arbeitskreis Bornscheuer erfolgten weitere Untersuchungen, um die Zusammenhänge der IB-Bildung und der Hydrolyseeigenschaften mit den Mutationen besser zu verstehen. Stand: 28. Juni

24 4.2. Projektpartner Rieks GmbH Der erste Projektabschnitt hatte zunächst das Ziel, die für die Projektdurchführung notwendigen Basistechnologien im Haus zu etablieren. - Aufbau einer adäquaten Analytik zur Bestimmung von ee-werten - Bereitstellung von Reaktionsvorstufen zur Racematspaltung - Aufbau der Verfahrenstechnik zur Reaktionsführung - erste präparative Ansätze mit kommerziellen Enzymen In den nachfolgenden Projektabschnitten standen dann verfahrenstechnisch geprägte Ziele im Fokus: - Ermittlung der Enantioselektivitäten ausgewählter, verbesserter Mutanten (Modellsysteme: enzymatische Hydrolyse von Tetrahydrofuryl-3-acetat und enzymatische Hydrolyse von 2-Acetoxy-3-butin ) - Optimierung der Reaktionsparameter im semipräparativen Maßstab (Modellsysteme: enzymatische Hydrolyse von 1-Methoxy-2-propylacetat und enzymatische Hydrolyse von 2-Acetoxy-3-butin ) - Up-Scaling des Modellsystems: enzymatische Hydrolyse von 1-Methoxy-2- propylacetat - Ermittlung der Basisdaten für die ökonomische und ökologische Evaluation des Modellsystems: enzymatische Hydrolyse von 1-Methoxy-2-propylacetat Zielsubstanzen waren die Alkohole 1-Methoxy-2-propanol, 3-Butin-2-ol sowie 3- Hydroxytetrahydrofuran. Zur Vereinfachung obiger Fragestellungen wurde für die Zielsubstanzen zunächst die enzymatische Hydrolyse der jeweiligen Acetate in wäßriger Phase als Reaktionssystem gewählt. Die Arbeiten sollten neben der Etablierung eines allgemeinen Fließschemas zur Vorgehensweise einer effektiven Forschung und Entwicklung auch Strategien zur verfahrenstechnischen Umsetzung in den industriellen Maßstab beinhalten. Stand: 28. Juni

25 Etablierung der HPLC-Analytik Die Analytik der Reaktionssysteme wurde zunächst dadurch erschwert, daß die Alkohole 3-Hydroxytetrahydrofuran und 1-Methoxy-2-propanol im Gegensatz zu 3- Butin-2-ol nicht UV-aktiv sind. Die Ester aller Alkohole konnten dagegen sehr gut detektiert werden. Gleichfalls im UV-Bereich detektierbar ist die aus der Hydrolyse resultierende Essigsäure. Somit standen für die Quantifizierung der Reaktion immer ein Edukt-Peak und mindestens ein Produkt-Peak zur Verfügung. Die Analytik erfolgte über eine HPLC-Anlage der Firma Merck (LaChrom) unter nachfolgenden Laufbedingungen: 1-Methoxy-2-propylacetat: RP-8, 125-4, 60% H 2 O / 40% MeOH, 0,25 ml/min, 40 C, 210 nm, Loop 20 µl, Probe 1:10 in Eluent verdünnt. (Abb. 13 a); Tetrahydrofuryl-3-acetat: RP-8, 125-4, 0-12 min 80% H 2 O / 20% MeOH, min 60% H 2 O / 20% MeOH, 0,125 ml/min, 40 C, 210 nm, Loop 20 µl, Probe 1:10 in Eluent verdünnt. (Abb. 13 b); 2-Acetoxy-3-butin: RP-8, 125-4, 60% H 2 O / 40% MeOH, 0,5 ml/min, 40 C, 210 nm, Loop 20 µl, Probe 1:10 in Eluent verdünnt (Abb. 13 c) Enantiomerenanalytik Die Enantiomerenanalytik erfolgte über einen der HPLC nachgeschalteten Chiraldetektor (Chiralyser, IBZ-Meßtechnik). Das Meßprinzip basiert auf einer Bestimmung der Drehung von linear polarisiertem Licht über eine Faraday Kompensationsmessung. Hierdurch können über Referenzmessungen absolute Drehwerte von chiralen Verbindungen unterhalb einer Konzentration von 1 µg/ml bestimmt werden. Für das Etablieren der Analytik und die Durchführung erster Reaktionsansätze wurden keine Absolutwerte der Enantiomerenüberschüsse der jeweiligen Alkohole bestimmt. Hierzu sind Eichmessungen mit den entsprechenden Referenzsubstanzen notwendig, die nur in sehr geringen Mengen als reine Enantiomere verfügbar sind. Stand: 28. Juni

26 Die Signale im Chiraldetektor verhalten sich jedoch direkt proportional, so daß auch über eine relative Quantifizierung im Rahmen erster Reaktionsansätze eine Aussage hinsichtlich der jeweiligen ee-werte im Verhältnis der einzelnen Ansätze zueinander getroffen werden kann. Die exakte Quantifizierung unter Eichung der Absolutwerte wurde bei Bedarf in Form einer Endpunktbestimmung durchgeführt. Abbildung 13a: 1-Methoxy-2-propylacetat Essigsäure Abbildung 13b: 3-Hydroxytetrathydrofurylacetat Essigsäure Stand: 28. Juni

27 Abbildung 13c: Essigsäure 3-Butin-2-ol 2-Acetoxy-3-butin Abbildung 13a-c: HPLC-Chromatogramme der Analytik enzymatischer Esterhydrolyse (CALB): a) 100 mm D/L-MPA, Phosphatpuffer, ph 7; I = 0,2; RT; 1,5 Units/ml b) 100 mm D/L-HTA, Phosphatpuffer, ph 6; I = 0,2; RT; 1,5 Units/ml. c) 100 mm D/L-2-Acetoxy-3-butin, Phosphatpuffer, ph 7,4; 10 mm; RT; 1,5 Units/ml Stand: 28. Juni

28 Abbildung 14a: 1-Methoxy-2-propylacetat + 1-Methoxy-2-propanol Abbildung 14b: Tetrahydrofuryl-3-acetat + _ 3-Hydroxytetrahydrofuran Stand: 28. Juni

29 Abbildung 14c: 2-Acetoxy-3-butin + 3-Butin-2-ol - Abbildung 14a-c: Chiraldetektorsignale der in Abbildung 13 dargestellten HPLC- Chromatogramme für die enzymatische Esterhydrolyse von a) 1-Methoxy-2- propylacetat sowie b) Tetrahydrofuryl-3-acetat und c) 2-Acetoxy-3-butin. Drehwerte (±) der Ester und Alkohole. Die Chromatogramme in Abbildung 13 a, b und c resultieren aus den in Abbildung 14 a, b und c dargestellten HPLC-Läufen. Die Signale stehen jeweils in einem proportionalen Verhältnis zum Enantiomerenüberschuß des Analyten. Zu erkennen ist die antipode Beziehung von Substrat und Produkt hinsichtlich des Drehwerts in Richtung positiv bzw. negativ bei enantioselektiver Hydrolyse. Stand: 28. Juni

30 Synthese von Acetaten Die Racemate von 1-Methoxy-2-propanol (Merck) und dessen Acetat (Merck) sowie das racemische 3-Hydroxytetrahydrofuran (Sigma) wurden kommerziell erworben. Die Acetate von 3-Hydroxytetrahydrofuran und 3-Butin-2-ols (ABCR GmbH & Co.) wurden im Labor synthetisiert. Hierzu wurde über Acetylchlorid acetyliert und das Produkt anschließend destillativ bzw. chromatographisch aufgereinigt Optimierung von Reaktionsansätzen im Labor- und im präparativen Maßstab Für die Hydrolyse von Acetaten der racemischen sekundären Alkohole wurden zunächst im Haus vorhandene und zusätzlich vom Projektpartner Greifswald bereitgestellte Lipasen und Esterasen hinsichtlich ihrer Enantioselektivität im präparativen Ansatz untersucht. Dabei wurden für alle Ansätze zur Optimierung der Reaktionsführung und Enantioselektivität Variationen der Prozeßparameter Temperatur und ph-wert sowie Wahl der Puffer/Lösemittelsysteme durchgeführt. Zusätzlich wurden 2 neue kälteaktive Lipasen hinsichtlich einer Hydrolyseaktivität gegenüber unseren Zielsubstraten untersucht. Diesbezüglich wurden vom Arbeitsbereich Technische Mikrobiologie der Technischen Universität Hamburg-Harburg (Prof. G. Antranikian) zwei aufkonzentrierte Lipasepräparationen der psychrophilen Hefestämme Mrakia gelida (Stamm HAT 1-2) und Trichosporon pullulans (Stamm HAT 6-1) zur Verfügung gestellt. Beide Organismen zeigen bei Wachstum auf Olivenöl als Substrat deutliche Lipaseaktivität gegenüber p-nitrophenylpalmitat. Leider konnte unter optimalen Reaktionsbedingungen (ph 7 und 15 C für Mrakia gelida bzw. ph 7 und 25 C für Trichosporon pullulans) keine Hydrolaseaktivität gegenüber unseren drei Zielverbindungen detektiert werden. Aus diesem Grund wurden im Rahmen des Projekts diese Lipasepräparationen in weiteren Arbeiten nicht eingesetzt. Stand: 28. Juni

31 Ein asymmetrischer Prozeß, wie die kinetisch kontrollierte Racematspaltung, bei dem das Verhältnis der stereoisomeren Produkte durch die Differenz der Gleichgewichtskonzentrationen der einzelnen aktivierten Komplexe in den diastereomorphen Übergangszuständen bestimmt wird, läßt sich mit folgendem modifizierten Eyring-Ansatz beschreiben: k ln k S R H = - R T RS S + R RS Die jeweiligen Anteile von H und S an der Differenz der freien Aktivierungsenergien sind von großer Bedeutung für die Syntheseplanung. Aus ihnen ist abzuleiten, dass asymmetrische Prozesse bei möglichst tiefen Temperaturen durchgeführt werden sollten, um so G zu vergrößern. Alle Wechselwirkungen im Enzym-Substrat-Komplex sind ph-abhängig. Wenn der Einfluß einer dieser Größen für die beiden Enantiomere unterschiedlich ist, sollte auch eine ph-abhängigkeit der Stereoselektivität vorliegen. Diese wird umso ausgeprägter sein, je größer der Einfluß auf die Katalyse ist. So werden leichte Konformationsänderungen einen geringeren Einfluß haben, als der Wegfall von Wasserstoffbrücken oder Ladungswechselwirkungen. Die kinetische Beschreibung der ph-abhängigen Enzymaktivität kann für eine reversible Einsubstrat-Reaktion mit Zwischenstufe, wie sie bei den im Rahmen des Projekts verwendeten Serinproteasen vorkommt, vorgenommen werden. Die Ionisierung des Substrats wird zunächst nicht berücksichtigt. Das Protein soll über drei Protonierungsgrade verfügen, von denen nur einer den Reaktionsweg der optimalen Katalyse darstellt. Zur Vereinfachung wird angenommen, daß die seitlichen Reaktionswege sehr viel langsamer sind, als der optimale Reaktionsweg über die einfach protonierte Enzymform (HE). So ist beispielsweise das Gleichgewicht H2ES H2EP innerhalb der kinetischen Beschreibung vernachlässigbar. Stand: 28. Juni

32 Danach ergibt sich folgendes Reaktionsschema zur ph-abhängigkeit einer reversiblen Einsubstratreaktion mit Zwischenstufe. Das Enzym verfügt danach über zwei geladene Gruppen im aktiven Zentrum. Nur der Ionisierungsgrad EH des Enzyms soll die Katalyse ermöglichen und die seitlichen Reaktionswege damit zur Vereinfachung ohne Berücksichtigung bleiben. Die mögliche Ionisierung des Substrats bleibt ohne Berücksichtigung. E ES EP E H + H + H + H + k 1 k 2 k 3 HE + S HES HEP HE + P + k -1 + k -2 + k -3 + H + K K K K E(1) ES(1) EP(1) E(1) H + H + H + K E(2) K ES(2) K EP(2) K E(2) H 2 E H 2 ES H 2 EP H 2 E Die enzymkinetischen Parameter V max und K m ergeben sich für die reinen Enantiomere eines Substrats aus den Geschwindigkeitskonstanten für den normalen Reaktionsweg unter Einfügung der Terme, die die unterschiedlichen Protonierungsgleichgewichte eines jeden Reaktionsschritts beschreiben: V max k2k3[e] 0 = + K + ES(1) KEP(1) ( k-2+ k3 ) 1+ [H ] + + k 1+ [H ] + K [H + 2 ] K [H + ] ES(2) EP(2) K m + KE(1) ( k-1k -2+ k-1k + k k3) 1+ [H ] KE(2) [H ] = + + KES(1) KEP(1) k1 ( k-2+ k3) 1+ [H ] + + k 1+ [H ] KES(2) [H ] KEP(2) [H ] Die maximale Umsatzgeschwindigkeit und erreichbare Enantioselektivität wird somit auch als eine Funktion des ph beschrieben. Stand: 28. Juni

33 Neben dem ph der Reaktion besteht eine weitere Möglichkeit der Einflußnahme auf die Stereoselektivität in der Wahl des Lösungsmittels. Durch den Zusatz von organischen Lösungsmitteln ändert sich auch die Dielektrizitätskonstante des Reaktionsmediums. In Abhängigkeit von der elektronischen Abschirmung durch das Medium kommen so unterschiedliche Seitenketten untereinander und mit dem Substrat in elektrostatischen Kontakt. Diese Effekte können für das einzelne Enantiomer unterschiedlich sein Enzymatische Hydrolyse von 1-Methoxy-2-propylacetat (MPA) Mit der Zielsetzung, verfahrenstechnische Ansätze für die weitere Optimierung von Racematspaltungen zu erhalten, wurden Hydrolysen von MPA unter Variation der Reaktionsparameter in Gegenwart von CAL-B durchgeführt. Wie in der Literatur bereits beschrieben 5, konnte für dieses Enzym eine hohe Enantioselektivität erwartet werden. Die Umsatzraten der Reaktion konnten durch die Auswertung der über die HPLC- Analytik erhaltenen Daten ermittelt werden. Diese wurden dann in Relation zu den über den Chiraldetektor erhaltenen Intensitäten des Enantiomerenüberschuß gesetzt. Im Rahmen der Meßgenauigkeit kann im Ergebniss festgestellt werden, daß die Hydrolyse mit einer Enantioselektivität von E > 100 abläuft. Dies wurde bereits frühzeitig deutlich aus dem Umstand, daß keine signifikanten Umsätze über 50% erzielt werden konnten und die Signale des Chiraldetektors keine wesentlichen Änderung ab Umsatzraten von 50% zeigten. Obwohl der Einfluß der Temperatur auf die Enantioselektivität auf dieses ohnehin gute Reaktionssystems eher als gering einzustufen war, konnten die höchsten Selektivitäten bei tieferen Temperaturen gefunden werden. Gleiches konnte für die Versuche der Variation vom ph-wert ermittelt werden. Hier war allerdings nur eine schwache Abhängigkeit der Selektivität vom ph-wert erkennbar, so dass die wesentliche Steuerung der Enantioselektivität über den Reaktionsparameter Temperatur erfolgte. 5 Baumann, M., Hauer, B. H., Bornscheuer, U. T., (2000), Tetrahedron: Asymmetry, 11, Stand: 28. Juni

34 Hydrolyse von 1-Methoxy-2-propylacetat unter Variation der Temperatur (ph = 7.0) relative ee-werte (Peak-Flächen) 3,0E+07 2,5E+07 2,0E+07 1,5E+07 1,0E+07 5,0E+06 0,0E+00 Alkohol-Fläche 10 C Alkohol-Fläche 20 C Alkohol-Fläche 30 C Alkohol-Fläche 40 C Umsatz [%] Abbildung 15: Abhängigkeit der Enantioselektivität einer Hydrolyse von MPA bei variabler Temperatur. 100 mm Substrat, 0,1 mg/ml Novozym 525 (CAL-B), Phosphatpuffer I = 0,2; ph 7 Aus den vorstehenden Versuchen wurden unter Berücksichtigung der Anforderungen an einen technischen Prozeß noch verschiedene Parameter optimiert. So führten die im Rahmen der Evaluation gewonnenen Erkenntnisse zu einer Umstellung des Reaktionspuffers. Für das resultierende Puffersystem konnte unter Verzicht des üblicherweise verwandten Phosphatpuffers ein durch Natriumhydrogencarbonat auf neutralen ph-wert titriertes System gefunden werden, ohne dass dieses einen Einfluss auf die Enantioselektivität der Reaktion hat. Nachgeschaltet wurde in enger Zusammenarbeit mit dem Projektpartner UNA Synth GmbH eine Umsetzung der Versuchsergebnisse in den Produktionsmaßstab realisiert, die begleitend auch die Ermittlung von Datensätzen für die ökonomische sowie ökologische Evaluation ermöglichte. Stand: 28. Juni

35 Enzymatische Hydrolyse von Tetrahydrofuryl-3-acetat Analog der Vorgehensweise für MPA wurde auch Tetrahydrofuryl-3-acetat unter Variation der Reaktionsparameter in Gegenwart von CAL-B umgesetzt. Die Hydrolyse zeigt eine deutliche Abhängigkeit der Enantioselektivität von den Reaktionsbedingungen. Zu erkennen ist die Verbesserung des Enantiomerenüberschuß für den Alkohol bei aciden ph-werten. So ergab die Hydrolyse bei einem ph-wert von 5 einen 1,5-fach höheren ee-wert als bei ph 9,5. Aus der Steilheit des Chiralitäts-Signals in Abhängigkeit vom Umsatz der Reaktion konnte außerdem erkannt werden, daß sich beide Enantiomere des Tetrahydrofuryl-3- acetats annähernd gleich gut umsetzen lassen. Der Enantioselektivitätsfaktor für die Reaktion aus dem Racemat liegt danach bei E = 4. Die enzymatische Hydrolyse von 3-Hydroxytetrahydrofuran-Derivaten stellte sich somit als anspruchsvolles Modell für die weitere Selektion optimierter Enzymvarianten dar. Entsprechende Arbeiten wurden vom Projektpartner Universität Greifswald angegangen. Bis Projektabschluss zeigten keine von den generierten neuen Esterase- Varianten (siehe 4.1.6) eine für die Übertragung in den technischen Maßstab notwendige Steigerung der Enantioselektivität um mindestens den Faktor 10. Nach entsprechenden Vorversuchen erfolgte im weiteren Projektverlauf daher eine starke Fokussierung auf die Untersuchung des Modellsystems enantioselektive Hydrolyse von 2-Acetoxy-3-butin. Stand: 28. Juni

36 relative ee-werte (Peakfläche) 6,0E+06 5,0E+06 4,0E+06 3,0E+06 2,0E+06 1,0E+06 Hydrolyse von Tetrahydrofuryl-3-acetat unter ph-variation Alkohol [Fläche], ph = 7.0 / RT Alkohol [Fläche], ph = 6.0 / RT Alkohol [Fläche], ph = 9.5 / RT Alkohol [Fläche], ph = 5.0 / RT Alkohol [Fläche], ph = 6.0/10 C 0,0E Umsatz [%] Abbildung 16: Abhängigkeit der Enantioselektivität einer Hydrolyse von Tetrahydrofuryl-3-acetat bei variabler T/pH. 100 mm Substrat, 0,1 mg/ml Novozym 525 (CAL-B), Phosphatpuffer I = 0,2, ph 5, 6, 7, Carbonatpuffer I = 0,2; ph 9, Enzymatische Hydrolyse von 2-Acetoxy-3-butin In enger Kooperation mit dem Projektpartner Universität Greifswald (Prof. U. Bornscheuer) wurde in der zweiten Projekthälfte insbesondere die Hydrolyse des Modellsubstrats 2-Acetoxy-3-butin untersucht. Im Arbeitskreis von Prof. U. T. Bornscheuer wurden ausgehend von der Esterase aus Pseudomonas fluorescens (PFEI) zahlreiche Mutanten, welche eine hohe Aktivität gegenüber 2-Acetoxy-3-butin zeigten, produziert. Nach der Verifizierung im µl-maßstab konnte eine Mutante mit einem deutlich veränderten Verhalten gegenüber 2-Acetoxy-3-butin identifiziert werden. Stand: 28. Juni

37 Für eine erfolgreiche technische Umsetzung der enantioselektiven Hydrolyse von 3- Acetoxy-2-butin zur großtechnischen Gewinnung von enantiomerenreinem 3-Butin-2-ol sind im Hinblick auf potentielle Enzym-Mutanten folgende Parameter von entscheidender Bedeutung: - hohe Enantioselektivität des Enzyms gegenüber 3-Acetoxy-2-butin - hohe spezifische Enzymaktivität gegenüber 3-Acetoxy-2-butin - Reaktionsführung unter milden Bedingungen (Temperatur, ph) - hinreichende Verfügbarkeit des aktiven Enzyms Basierend auf den Untersuchungen des Projektpartners Universität Greifswald wurde zunächst die Dreifachmutante V2A ausgewählt und hinsichtlich der enzymatischen Hydrolyse von 2-Acetoxy-3-butin untersucht. Es wurden semipräparative Ansätze unter den vom Projektpartner (Universität Greifswald) vorgegebenen Reaktionsbedinungen gefahren. Die entsprechende Analytik erfolgte via HPLC sowie Chiraldetektor nach unter und detailliert beschriebener Methode. 2-Acetoxy-3-butin (%) WT 25 C V2A 25 C Zeit (min) Abbildung 17: Hydrolyse von 2-Acetoxy-3-butin mit der Wilttyp-Esterase PFEI und der Mutante lle76va/gly98ala/val175ala (V2A) bei 25 C. Stand: 28. Juni

38 Analog zu den Ergebnissen des Projektpartners (Uni Greifswald) erweist sich die Dreifachmutante V2A gegenüber 2-Acetoxy-3-butin als deutlich selektiveres Enzym im Vergleich zur Wildtyp-Esterase PFEI (Abbildung 17). Im Rahmen der Messgenauigkeit konnte festgestellt werden, dass die Hydrolyse von 2-Acetoxy-3-butin mit der Mutante V2A mit einer Enantioselektivität > 80 abläuft. Wie aus Abbildung 17 und 18 hervorgeht, wurden mit dieser Enzymvariante keine signifikanten Umsätze über 50 % erzielt und die Signale des Chiraldetektors zeigten keine wesentlichen Änderungen ab Umsatzraten von 50 %. Jedoch ist auch im semipräparativen Maßstab die Menge an aktivem Enzym und somit dessen spezifische Aktivität auf Grund der Bildung von IB deutlich verringert. Wie die Abbildung 17 veranschaulicht, erreicht der Wildtyp bereits nach 2h schon einen Umsatz von über 60%, während die Mutante ca. 30% des Substrats zum selben Zeitpunkt umgesetzt hat. Nach 7 h erreiht V2A einen ca. 50%-igen Umsatz, während der Wildtyp zu diesem Zeitpunkt bereits 84% des Esters hydrolysiert hat. 1,80E+06 1,60E+06 1,40E+06 relative ee-werte (Peakfläche) 1,20E+06 1,00E+06 8,00E+05 6,00E+05 4,00E+05 2,00E+05 0,00E+00 Alkoholfläche 10 C Alkoholfläche 37 C Umsatz (%) Abbildung 18: Abhängigkeit der Enantioselektivität einer Hydrolyse von 2-Acetoxy-3- butin mit der Dreifachmutante lle76val/gly98ala/val175ala (V2A) bei variabler Temperatur Stand: 28. Juni