Dünnschicht-Chromatographie

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1 Seminar: Organisch-Chemische Übungen Dünnschicht-Chromatographie 1 Die Lernunterlagen können über UNIGRAZonline heruntergeladen werden 1. Allgemeines 2 Rückblende: Grundpraktikum Beispiel: Säulenchromatographie von Pflanzenfarbstoffen : Säulentrennung und DC-Untersuchung von Spinat 1

2 2. Trennprinzipien Mobile Phase (= Lösung eines Substanzgemisches in Lösungsmittel/Gemisch) strömt über stationäre Phase = oberflächenreicher Feststoff oder = stationäres Lösungsmittel) + Substanzgemisch. unterschiedliche Affinität zur mobilen/stationären Phase = unterschiedliche Laufstrecken 3 Trennprinzip ADSORPTION an der Oberfläche der stationären Phase: besteht aus feingepulverten polaren Materialien, z. B. aus Kieselgel, Aluminiumoxid Ad/Desorption durch H-Brücken und Dipol- Dipol-Wechselwirkungen 4 Desaktivierung der stationären Phase: - durch Wasser oder durch - stark polare organische Lösungsmittel 2

3 Trennprinzip VERTEILUNG zwischen 2 nicht-mischbaren Flüssigkeiten. Eine davon ist auf Träger fixiert = stationäre Phase) Träger: z.b. Cellulosepulver, Polyamid 5 Trennqualität 6 Trennleistung = Zonenverbreiterung (Diffusion etc): Materialabhängig Selektivität = R f -Wert- Unterschied für die aufgetrennten Substanzen (Strukturabhängig) = Auflösung Kammereinfluss 3

4 3. Die stationäre Phase Kommerzielle Sorbenzien garantieren gleichbleibende Qualität in Art und Aktivität = Etablierung als Routinemethoden Polare (hydrophile) Phasen: straight / normal phases Unpolare (hydrophobe) Phasen: Umkehrphasen, reversed phases (RP) mittelpolare Phasen: modifizierte Sorbenzien 7 Chemische Zusammensetzung und Struktur - Kieselgel CHEMISCHE Struktur beeinflusst SELEKTIVITÄT Sorbenzien für die Adsorptionschromatographie Kieselgel (90% der Trennungen)... bildet H-Brücken modifiziertes Kieselgel (durch Silane hydrophob) 8 4

5 Aluminiumoxid Aluminiumoxid - neutral - basisch sauer - Aktivitätsstufen I - V: durch Belegen (= Desaktivieren) der aktivsten Stellen mit Wasser (0-18%) 9 Polyamid, Cellulose Verteilungschromatographie Bindung von Lösungsmittelanteilen an Träger (ähnlich wie Papierchromatographie) Typische Anwendungsbeispiele: für Aminosäuren, Kohlenhydrate Acetylierte Cellulose (RP): für polycyclische Aromaten, Chinone, Carbonsäuren 10 5

6 Korn- und Porencharakteristik GEOMETRISCHE Struktur beeinflusst TRENNLEISTUNG Partikeldurchmesser (klein) Korngrößenverteilung (eng) Porenvolumen (angepasst) Oberfläche (groß) Kornstruktur (sphärisch) = gute Trennleistung = hohe Adsorptionskraft Die mobile Phase 12 DC - aufsteigend: Durch Kapillardruck strömt Fließmittel aus Vorratsgefäß in kapillare Hohlräume. SC (Schwerkraft, Überdruck) - absteigend Polarität -> Elutionskraft = großer Rf-Wert der Substanz Solvatisierung von Substanzen = Lösung im Laufmittel Konkurrent um aktive Adsorptionsstellen Verteilungschrom.: unpolarer + polarer Anteil 6

7 Eluotrope Reihe, Mixotrope Reihe Empirische Ordnung nach steigender Elutionskraft 13 Cyclohexan Tetrachlormethan Toluen Chloroform Dichlormethan Acetonitril 2-Propanol Essigester Aceton Ethanol Dioxan THF Methanol Pyridin Wasser unpolar mittelpolar stark polar 5. Präparative Säulenchromatographie 14 Meist Fest-Flüssig-Chromatographie (feste stationäre Phase) Adsorbens: Normal- oder Umkehrphasen dazu passend eher unpolare (organische) oder polare Laufmittel (z.b. Wasser, Puffer) Typischer Porendurchmesser: 60 Å (Kieselgel 60) Drucklose SC (nur Schwerkraft)= großer Zeitaufwand Abhilfe: Flash-Chromatographie (Überdruck durch Gasflasche, Partikel-Durchmesser: 30-60µ) 7

8 Dry-Flash-Säulenchromatographie (1) Partikeldurchmesser: klein -> 15 µm (wie DC-Kieselgel, aber Kieselgel H statt G), größere Oberfläche Unterdruck durch Vakuumpumpe (D) Material wird sehr breit auf eine Glasfritte gepackt (A) Das Bett darf trocken laufen dadurch einfache Gradientenelution möglich 15 Dry-Flash-Säulenchromatographie (2) Detektion: bei färbigen Substanzen visuell, sonst Fraktionen schneiden und mit DC überprüfen. Maximale Trennmenge: Gramm-Bereich Probleme: Vakuum... Verdunstungskälte - Kondensation von Wasser an der Glasapparatur. 16 8

9 6. Dünnschichtchromatographie Substanzen: schwerflüchtig, polar und unpolar kostengünstig große Probenanzahl in kurzer Zeit keine elektrische Energie notwendig Auch Anwendung, wenn GC/LC nicht möglich: -zb Probenmaterial beschädigt Fertig-Säulen - zb Detektion ist aufwendig - zb Probenbestandteile dürfen nicht zerstört werden 17 Methoden und Anwendungsformen Analytische Methode: qualitative bzw. quantitative Identifizierung = Prozess- und Reinheitskontrolle Präparative Methode: Präparative Schicht- Chromatographie (PSC): = Reinigung und Isolierung durch Extraktion aus Schicht 18 9

10 Beschreibung des Laufverhaltens - R f -Wert a... Laufstrecke des Laufmittels b... Laufstrecke der Substanz - bis zum Mittelpunkt des Substanzflecks b R f = a 19 bei unregelmäßigen Flecken: Angabe von R f -Bereichen Aussagekraft von R f -Werten Brauchbare R f -Werte liegen zwischen 0.2 und 0.8 (Frontläufer und Sitzenbleiber sind unbrauchbar) R f -Werte sind in der DC nur Richtwerte Daher: Immer mit Standard vergleichen 20 10

11 Konzentration & Rf-Wert Bei der Sättigungskonzentration der stationären Phase: Gerade knickt ab Laufstrecke ändert sich! durch nicht-lineare Adsorptions- isothermen 21 Daher: Rf-Wert auch von der Konzentration abhängig Schichteigenschaften Schichtdicke: 50 µm (HPTLC) - bis zu 2 mm (PSC) Binder: Gips, organische Polymere Fluoreszenzindikatoren zur Detektion mittels Fluoreszenzlöschung 22 11

12 7. Laufmitteleinfluss auf Trennproblem 23 n-hexan Toluen Toluen/ Chloroform Aceton Chloroform Spot-Test zur Laufmittelwahl 24 Hexan Tetrachlormethan Toluen Aceton Auftragen des Trennguts als kleinen Fleck Laufmittel verdunsten lassen Kapillare in der Mitte des Substanzflecks aufsetzen zirkulares Chromatogramm 12

13 Standard-Laufmittel Für Kieselgel/Aluminiumoxid (Adsorption) Unpolare Substanzen: Aceton-Toluen (1:10) mittelpolare Substanzen: Aceton-Toluen (1:3) oder Chloroform-Aceton (7:3) 25 stark polare Substanzen: Methanol - Chloroform (1:9) Standard-Laufmittel Für Cellulose oder Papierchrom. (Verteilung) Saure Substanzen: n-butanol - Aceton - Eisessig - Wasser (3:3:7:2) Basische Substanzen: 2-Propanol - Ammoniak - Wasser (6:3:1) 26 Merkregel: Säuren in sauren Laufmitteln trennen Basen in basischen Laufmitteln trennen (Similia similibus solvuntur) 13

14 8. Praktische Hinweise zur Durchführung Handhabung der Fertigschichten Träger: meist Aluminiumfolie (zuschneiden) Kanten versäubern... Sonst schiefe Chromatogramm-Bahnen! Plattenmaterial nur am Rand berühren 27 Auswahl des Lösungsmittels Lösungsmittel muss wasserfrei sein (Ads.), Probe vollständig lösen, ungiftig, nicht zu hoch siedend Polarität des Lösungsmittels = entscheidend für Startzone 28 Standard-Lösungsmittel: Adsorption: meist Aceton Verteilung: Wasser, Ethanol 14

15 Auftragen der Probe Wichtig: Vergleichssubstanzen und Probe immer am SELBEN Chromatogramm auftragen 29 Punkt- oder bandförmig (PSC), nicht zu konzentriert sonst Schwanzbildung durch Schicht-Übersättigung Startpunkte mit weichem Bleistift markieren (ca. 1 cm Abstand v. unten) Beschriftung nur oberhalb der Front Auftragen Auftragemethode für qualitative DC s 30 Füllen der Kapillaren: selbsttätig durch Eintauchen Kapillaren aufsetzen - Entleerung durch Kontakt mit Sorbensoberfläche... Schicht nicht beschädigen! Konzentration möglichst so wählen, dass einmaliges Auftragen reicht. Startzonen vor dem nächsten Auftragen trocknen. 15

16 Positionierung der Proben Bei Identitätsproblemen: Überlappende Auftragung Dadurch besserer Vergleich als durch nebeneinanderliegende Probenflecken Entwickeln Aufgabe des Laufmittels & Anforderung 32 Lösen und Transport des Substanzgemisches; Selektivität R f -Werte im mittleren Bereich halten Ausreichende Reinheit (Stabilisatoren?) Ausreichende Stabilität, keine Toxizität β-fronten beachten - täuschen falsche R f -Werte vor 16

17 Ansetzen & Aufbewahren der Laufmittel Einzelkomponenten getrennt abmessen (sonst Fehler durch Volumsänderung) Gut vermischen, Vorrat gut verschließen, nicht zu lange aufbewahren Laufmittel nicht wiederverwenden: Verdunstung, chem. Reaktion, bevorzugte Adsorption Jede DC-Platte hat das Recht auf ein frisches Laufmittel 33 Aufsteigende Entwicklung - Benetzung nur unterhalb der Startpunkte - Deckel muss geschlossen sein - Laufmittel max. 20 cm Startflecken vergrößern sich zur Front hin! 34 Laufmittelfront markieren (Bleistift, einritzen) - Platte gut trocknen. Temperaturkonstanz & Lichtschutz beachten Kammer NICHT bewegen 17

18 10. DC-Trennkammern Gesättigte Normalkammer R f -Werte linear... gut für große R f - Werte 35 Nichtgesättigte Normalkammer 36 Verdunstung an der Front mehr Lösungsmitteldurchsatz mehr Trennstufen kleinere R f -Werte werden auseinandergezogen bessere Trennung im unteren Bereich Zusammenlaufen der großen R f - Werte). 18

19 11. Detektion Visuelle Detektion bei Tageslicht Detektion bei Tageslicht: nur bei färbigen Substanzen 37 Visuelle Detektion - Fluoreszenzlöschung DC-Folien fluoreszieren hellgrün oder hellblau (Fluoreszenzindikatoren F254). UV-aktive Strukturelemente (Aromaten, konjugierte C=C-Doppelbindungen...) löschen Emission dunkle Flecken auf hellfluoreszierendem Hintergrund (Achtung - kurzwelliges UV-Licht, 254 nm) Intensität proportional der Konzentration 38 Fluoreszenz bei UV 365 nm: nicht proportional!! 19

20 Derivatisierung wenn Substanzen nicht färbig oder UV-aktiv sind Aufsprühen von Nachweisreagenzien (häufigste Technik) Tauchen von DC-Platten (umweltfreundlicher, billiger) Bedampfen von DC-Platten - Reaktion mit Iod, Chlor, Thermo- oder Photochemische Reaktion 39 Derivatisierung durch Aufsprühen Besprühen mit Laborsprüher Homogenes Benebeln, bis Schicht leicht glänzt - NICHT zuviel! Eventuell nach dem Sprühen erwärmen 40 Durchführung in Sprühbox (= giftiger, agressiver Reagenznebel, Lösungsmitteldämpfe). Handschuhe und Schutzbrillen tragen 20

21 Derivatisierung durch Tauchen 41 Vorteile gegenüber Sprühen: gleichmäßigere Belegung der Schicht keine Geräte notwendig bessere Reproduzierbarkeit keine Kontamination des Arbeitsplatzes Manuelles Tauchen: einfach durchführbar ca. 3 sek eintauchen, Platte mit Luft abblasen und Rückseite reinigen Tauchlösungen weniger konzentriert als Sprühlösungen Wasser meist durch Alkohol ersetzt Derivatisierungsreagenzien - Ninhydrin Ninhydrin - Nachweis von Aminosäuren, Aminen, 0.2% Ninhydrin in Ethanol oder Butanol; Besprühen oder Tauchen, dann auf ca. 110 C erwärmen... Gelbe, braune, blaue und violette Flecken

22 Derivatisierungsreagenzien V/S Vanillin - Schwefelsäure für höhere Alkohole, Steroide, etherische Öle...: 0.5-1% Vanillin in konz. Schwefelsäure oder in EtOHkonz.H 2 SO 4 (1:4-1:10); 43 Besprühen oder Tauchen, dann auf ca. 120 C erhitzen. 12. Auswertung Visuelle Auswertung Qualitativ: Kontrolle von Syntheseansätzen (Identifikation, Reinheitsprüfung): R f -Werte sind nicht genau reproduzierbar, deshalb ***IMMER*** Referenzsubstanzen am selben Chromatogramm Halbquantitativ: Konzentrationsreihen, Vergleich der Fleckengröße 44 22

23 13. DC-Chromatographie-Kurs Photochemische Umlagerung von Azobenzen (LA) N N hν N N 45 Nur LA trans (E) - Azobenzen cis (Z) - Herstellung von einheitlichem (E)-Azobenzen (Thermolyse) (E) -> (Z)-Isomerisierung von Azobenzen (Photolyse) DC-Untersuchung (Kieselgel) der thermisch hergestellten und der bestrahlten Probe auf die beiden Isomeren Säulentrennung von Azobenzen (nur Bakk.) N N hν N N trans (E) - Azobenzen cis (Z) - 46 Herstellung von einheitlichem (E)-Azobenzen (Thermolyse) (E)-> (Z)-Isomerisierung von Azobenzen durch Photolyse im UV Auftrennung durch Dry-Flash-Säulen-Chromatographie DC-Untersuchung der Reinheit der beiden Isomeren auf Kieselgel 23

24 Trennung & Nachweis von Aminosäuren NH 2 O O O R O OH + O O OH N O 47 Identifizierung von Aminosäuren durch Vergleich mit bekannten Aminosäuren: stark polare Verbindungen: NH 2 - oder COOH-Gruppe - daher: Verteilungschromatographie auf Cellulose Detektion: viele AS im UV unsichtbar daher - Detektion der aromatischen AS im UV - Derivatisierung mit Ninhydrin DC-Untersuchung von Blütenfarbstoffen (LA) HO O OH HO O + OH Cl - 48 OH O OR Nur LA: Aufarbeitung unterschiedlich gefärbter Blüten zu glykosidfreien Farbstoffen DC-Trennung auf Cellulosefolie OH Detektion - durch Farbvergleich - UV-Betrachtung und - ph-änderung OR 24

25 DC-Analyse eines unbekannten Substanzgemisches C H 3 O N H O C H 3 CH 3 OH OH 49 H 3 C CH 3 Probengemisch von 2 Substanzen mit unterschiedlicher Polarität und UV-Aktivität DC-Vergleich (Kieselgel) mit 4 bekannten Substanzen Detektion: - Fluoreszenzlöschung - Derivatisierung: Tauchen in Vanillin-Schwefelsäure Test Trennprinzipien, stationäre Phasen, Laufmittel, Lösungsmittel Rf-Wert (Bestimmung, Einflüsse, Berechnung) Trennleistung, Selektivität, Einflüsse Detektionsmethoden 50 25

26 Ende des Vorlesungsteils 51 26