Möglichkeiten und Grenzen der Anwendung molekularer Marker in der Zierpflanzenzüchtung

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1 Möglichkeiten und Grenzen der Anwendung molekularer Marker in der Zierpflanzenzüchtung Th. Debener Institut für Pflanzengenetik Molekulare Pflanzenzüchtung

2 Forum zum Informationsaustausch zwischen Forschung und Züchtung: GPZ, u.a. die AG 18: Zierpflanzen Seit 1993 wurden 17 Tagungen mit wechselnden Themenschwerpunkten organisiert 12. Hann. Münden (2004): Zierpflanzenzüchtung für den Markt 13. Hannover (2005): Forschungspotential für Zierpflanzenzüchtung und Zierpflanzenbau 14. Hillscheid (2006): Genetik und Molekularbiologie der Blüte von Zierpflanzen 15. Ellerhoop (2008): Phänotypische und genetische Stabilität von Zierpflanzensorten 16. Stuttgart (2010): Selektion auf Toleranz gegen abiotischem Stress in der Zierpflanzenzüchtung 17. Erfurt (2011): Neue Technologien für die Zierpflanzenzüchtung/Arthybriden in der Züchtung

3 Konzept genetischer Marker P1 P2 F1 M2/M2 M2/M2 M2/M2 R/R M1/M1 X r/r M1/M1 R/r M1/M1

4 Der ideale Marker ist hoch polymorph, technisch einfach nachzuweisen, universell einsetzbar und ohne Rekombination an das Zielgen gekoppelt F1 M2/M2 R/r M1/M1 F2 F2 F2 F2 F2 M2/M2 R/R M1/M1 M2/M2 R/r M1/M1 M2/M2 r/r M1/M1 M2/M2 R/r M1/M1 M2/M2 R/r M1/M1

5 Mikrosatelliten mit Kopplung an Blütenform Rh 50-5 Kopplung: 4,9 cm

6 Erweiterung der Markerdefinition auf die Verwendung von Markerinformation zur Analyse genetischer Distanzen Voraussetzungen: 1. Das Genom ist genügend dicht mit Markern abgedeckt 2. Die Genome sind genügend eng miteinander verwandt 3. Geringe Fehlerrate

7 Einsatz von molekularen Markern in der Pflanzenzüchtung Einsatzbereich Routineanwendung Entwicklung Forschung Limitierende Faktoren Genetische Identität X (X) Genetische Distanzen X (X) (X) Genügend nahe Verwandtschaft Aufklärung von Erbgängen MAS (markergestützte Selektion) auf Einzelmerkmale X X X Phänotypisierung Populationsgröße Polymorphismus vorhanden X X (X) Erbgang muss bekannt sein, Marker sollten genotypenübergreifend einsetzbar sein MAS auf QTLs X X X Wie MAS auf Einzelmerkm.

8 Charakteristika einer Auswahl molekularer Marker Information pro PCR Zuverlässigkeit Übertragbarkeit Entwicklungs -kosten RAPD + +/- - Keine/niedrig nein Sequenz notwendig AFLP Keine/niedrig nein SSR Hoch ja EST SNP Bisher hoch ja

9 Neue Markertechnologien Neue Markertechnologien werden fast ausschließlich durch die Entwicklungen im Bereich der Sequenziertechnologien beeinflusst!!

10 Leistung und Kosten gegenwärtiger Next- Generation-Sequencing Technologien Technologie Reads pro Lauf Leselänge Kosten/Lauf (Reagenzien) Kosten/Mb (Reagenzien) Kapillars. 96 >650 (1000) 96 $ 1500 $ 2h Laufzeit 454 FLX+ 1 x $ 7 $ 18-20h Illumina HiSeq x $ < 0.04 $ 10 d Helicos 800 x 10 6 >100 k.a. k.a. k.a. SOLID x $ < 0.11 $ 12 d PacBioRS > $ $ 0.5-2h Ion Torrent x 10 6 >100 ~925 $ 0.93 $ 2h Verändert nach: Glenn TC (2011) Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol. Ecol. Res. 11:

11 Möglichkeiten der Markerentwicklung durch NGS 1. Es kann sehr schnell mit wenig Aufwand Sequenzinformation aus genomischer DNA oder aus cdna (exprimierte Gene) gewonnen werden (schnelle Entwicklung von SSRs) 2. Es können sehr schnell Polymorphismen zwischen Sequenzen verschiedener Genotypen (Allele) gewonnen werden (schnelle Entwicklung von SNPs) 3. Der limitierende Faktor ist die Zuordnung von Information über DNA-Polymorphismen zu phänotypischen Merkmalen

12 Möglichkeiten der Markerentwicklung durch NGS 1. SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) Sind bereits bei Menschen, vielen Tier- und Pflanzenarten etabliert 2. Reduced Representation Sequencing Anwendungen sind für einige Pflanzen und Tierarten gezeigt worden

13 Referenzsequenz G T SNPs = Single Nucleotide Polymorphisms G T A G T G T G T G T A G T G T G T Referenzsequenz: Sequenz des gesamten Genoms (Idealfall) oder genomischer Teilsequenzen oder von Transkripten, die als Vergleichsbasis verwendet wird. Sequenzen Nr. 1-9: Stichprobe aus einer Population von Individuen der gleichen Art (oder Gattung). Bei heterozygoten Pflanzen kann jede Pflanze verschiedene Allele aufweisen. Gewinnung der Sequenzen durch Resequenzierung von Genomen oder von Teilen des Genoms bzw. Transkriptoms A A T A A T A T G T

14 Genomsequenz Wo findet man SNPs? Art SNP-Häufigkeit Referenz Arabidopsis Von 1 SNP per 36 bp bis 1 SNP per 3,3 kb Jander et al Tomate 1 SNP alle 7 kb Nesbitt und Tanksley 2002 Kartoffel 1 SNP per 21 bp Rickert et al Gerste 1 SNP per 78 bp Russel et al Mais Teile der Genomsequenz 1 SNP per 47,7 bp für nichtkodierende und 1 SNP per 130,5 bp für kodierende Sequenzen Transkriptom ESTs Ching et al. 2002

15 Als Einzelmarker weisen SNPs kaum Vorteile gegenüber z.b. Mikrosatellitenmarkern auf! Der Hauptvorteil von SNPs liegt in der simultanen, automatischen Detektion vieler tausend Marker

16 Beispiel: Infinium HD Assay von Illumina Quelle: /

17 Beispiel für die kommerzielle Anwendung bei Pflanzen aize_snp50.pdf Kosten bei der Nutzung bereits entwickelter Chips: ~ 100 /DNA- Probe

18 Reduced Representation Sequencing Nur ein ausgewählter Teil des Genoms wird sequenziert!! 1. NGS weist eine relativ hohe Fehlerrate auf 2. Jeder sequenzierte Bereich muss durch viele Einzelsequenzen abgedeckt werden, um Fehler von DNA-Polymorphismen unterscheiden zu können 3. Um den Aufwand vertretbar zu halten, wird daher eine Auswahl der sequenzierten Bereiche getroffen 4. Die Auswahl kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden

19 Sequenzierung nur eines Teils jedes Genoms ( reduced representation sequencing ) 1. DNA wird mit einem Restriktionsenzym geschnitten 2. Fragmente werden größenselektiert 3. Adapterligation und Sequenzierung

20 SNPs wurden im Maisgenom kartiert (276 RILs): Gesamtkosten: 8000 $ SNPs wurden in einer DH-Population (43 DHs) von Gerste kartiert 3. Die hohe Zahl wurde durch die Kombination von Proben in einzelnen Sequenzläufen erreicht

21 Vorteile von Markern als Werkzeuge der Pflanzenzüchtung 1. Sie können zur Kostenersparnis im Selektionsprozess führen 2. Sie können zu Zeitersparnis führen (frühere Markteinführung von Sorten) 3. Es können Ziele erreicht werden, die mit konventionellen Methoden nicht erreichbar sind (Beispiel: Sortenschutz/Sportmutanten) Für jede Kulturpflanzenart und jedes züchterische Problem sind die Punkte 1-3 getrennt zu betrachten!!

22 Marker werden in der kommerziellen Pflanzenzüchtung bereits als Standardmethode verwendet Quelle: Dr. J. Lübek, Solana Research GmbH 1. Jahr Kreuzung 2. Jahr 3. Jahr 4. Jahr 5. Jahr 6. Jahr 7. Jahr 8. Jahr 9. Jahr Feldsämling Topfsämling Variationsschaffung A- Stamm B- Stamm C- Stamm D- Stamm WP 1 WP 2 Beispiel: Kartoffel x Sortenprüfungsphase Selektion mit Markern für HC und PVY

23 Was ist die Voraussetzung für die Nutzung von Markern in der Zierpflanzenzüchtung? Markertechnologien? Kann von Dienstleistern durchgeführt werden/keine Forschungsaufgabe! Aufklärung der genetischen Grundlagen gartenbaulicher Merkmale? Kann von Interesse für Kooperationen mit Forschungseinrichtungen sein Kann auch von Dienstleistern übernommen werden

24 Die Struktur und Funktion von Genomen variiert z.t. erheblich zwischen verschiedenen Arten und auch innerhalb von Arten Echte MLO-Gene Gerste: 1 Arabidopsis: 3 Tomate: 1 Rose: 4? Quellen: Bancroft 2001, Schnable et al. 2009

25 Was ist die Voraussetzung für die Nutzung von Markern in der Zierpflanzenzüchtung? Markertechnologien? Kann von Dienstleistern durchgeführt werden/keine Forschungsaufgabe! Aufklärung der genetischen Grundlagen gartenbaulicher Merkmale? Kann von Interesse für Kooperationen mit Forschungseinrichtungen sein Kann auch von Dienstleistern übernommen werden Routineeinsatz im Zuchtprozess Erfordert ein grundlegendes Verständnis von molekularer und allgemeiner Pflanzenzüchtung sowie der spezifischen Kulturart

26 Konsequenzen für die Forschung 1. Die Neuen Techniken haben in den letzten fünf Jahren einen enormen Fortschritt in den Möglichkeiten der Genomanalyse von Pflanzen bewirkt 2. Eine schnelle Markerentwicklung bzw. Analyse von Kandidatengenen wird einfacher und billiger (Auftragsarbeiten) 3. Viele anwendungsorientierte Markerprojekte müssen in Zukunft mit Servicedienstleistern durchgeführt werden, wenn das know how zur Nutzung in Firmen vorhanden ist 4. Es bleibt die Aufklärung genetischer Prozesse als limitierender Faktor für die Anwendung von Markern in der Zierpflanzenzüchtung 5. Forschungsförderung im Bereich zwischen Grundlagenforschung (z.b. DFG) und Anwendung (z.b. AIF) müsste ausgebaut und qualitativ verbessert werden

27 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit