Biochemie und. chemischer Mechanismus

Transkript

1 Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München Biochemie und chemischer Mechanismus der Thiomethylierung von RNA Dorothea Maria Sophia Matschkai aus Moosburg a. d. Isar Deutschland 2014

2 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 5 2 Summary 7 3 Einleitung Modifikationen der Ribonukleinsäure Allgemeines Modifizierte Basen in der transfer-rna Die Isopentenyl-Modifikation Radikal-SAM-Enzyme Allgemeines Strukturelle Gemeinsamkeiten Methyltransferasen Übersicht Die Enzyme RlmN und Cfr Methylthiotransferasen Übersicht Struktureller Aufbau Biosynthese von ms2i6a Postulierter Mechanismus der Thiomethylierung 26 4 Aufgabenstellung 29 5 Isolierung von mrna über die 5'-Cap-Struktur Methoden zur Aufreinigung von mrna Expressionsplasmid von elf4ekn9a Überexpression und Aufreinigung von elf4ekn9a Aufreinigung von mrna 35 6 Humanes Homolog der Methylthiotransferase MiaB Bioinformatische Analyse Komplementationsassay Prinzip des Komplementationsassays Allgemeine Methode zur Quantifizierung von RNA-Modifikationen Herstellung des Expressionsplasmids Überexpression von CDK5RAP1_v2 in E. coli AmiaB Auswertung sirna-knockdown Prinzip des sirna-knockdowns Auswertung Subzellulare Lokalisation der CDK5RAP1-Varianten Das humane Protein CDK5RAP1_v Überexpression von Strep-CDK5RAP1_v2 49

3 6.5.2 Klonierung des Expressionsplasmids pdest008_tev_cdk5rap1_v Überexpression und Aufreinigung von MBP-CDK5RAP1_v Aktivitätsassay 52 7 Untersuchungen der Methylthiotransferase MiaB MiaB aus Hydrogenobacter thermophilus Klonierung und Expression von H. th. MiaB Aerobe von Aufreinigung H. th. MiaB Anaerobe Aufreinigung von H. th. MiaB Charakterisierung des Eisen-Schwefel-Cluster Aktivitätsassays Assays mit Gesamt-RNA Assays mit RHA-Hairpin Die mechanistische Fragestellung Stand der Wissenschaft Neu postulierter Mechanismus Nachweis von Dehydroalanin Kontrollexperiment Klonierung des Expressionsplasmids pdest007_tev_hthmiab Überexpression und Aufreinigung von Strep-HthMiaB Analyse Markierungsexperiment 72 8 Experimenteller Teil Allgemeine Chemikalien und Lösungen Geräte DNA- und Protein-Standard Plasmide mit Inserts Plasmide ohne Inserts Oligonukleotide Bakterienstämme und Zelllinien Enzyme 8.9 Puffer RNA-Aufreinigung RNA-Verdau RNA-Analytik RNA-Agarosegel-Elektrophorese DNA-Aufreinigung DNA-Agarosegel-Elektrophorese Protein-Aufreinigung SDS-Gelelektrophorese Western Blot Lösungen 83

4 SDS-Gelelektrophorese Western Blot Proteininduktion Wiedien Antibiotika (1000x Stocklösung) Mikrobiologische Methoden Herstellen von chemisch kompetenten Zellen Transformation in chemisch-kompetente E. co//-zellen Bakterien-Übernachtkultur Molekularbiologische Methoden Primer Design Polymerase-Kettenreaktion Amplifikation von DNA Überprüfung der Mutanten DNA-Agarosegelelektrophorese Reinigung und Isolierung von DNA Reinigung der DNA nach der PCR Mini-Plasmidpräparation Gerichtete Topo-Klonierung Gateway-Klonierung Restriktion von DNA Sequenzierung RNA Isolierung Isolierung von Gesamt-RNA Isolierung von trna Isolierung von polya-rna Isolierung von 5'-gecappter mrna RNA-Agarosegelelektrophorese Zellbiologische Methoden sirna-knockdown Subzellulare Lokalisation der CDK5RAP1 -Varianten Proteinchemische Methoden Heterologe Proteinexpression in E. coli Komplementationsassay Zellaufschluss unter aeroben Bedingungen Arbeiten unter anaeroben Bedingungen Zellaufschluss unter anaeroben Bedingungen Protein Chromatographische Methoden Strep-Tag II Affinitätschromatographie " MBP-Tag Affinitätschromatographie GST-Tag Affinitätschromatographie 99

5 Ni-NTA Affinitätschromatographie ßafc/i-Aufreinigung MonoQ-Aufreinigung Rekonstitution des Eisen-Schwefel-Clusters Enzymaktivitäts-Assay Markierungsexperiment SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Western Blot Analytische Methoden UVA/is-Spektroskopie Nano-LC-MS/MS Analytik Tryptischer /n-ge/-verdau von Proteinen Nano-LC-MS/MS Messungen ESI-LC/MS Analytik Enzymatischer Verdau von RNA ESI-LC/MS Messungen Auswertung Anhang Quanitfikationsdaten Trypsin-Verdau Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis I15 12 Danksagung 125