RD-100i OSNA die neue Generation der Sentinellymphknoten-Analyse bei Brustkrebs
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- Nora Möller
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1 RD-1i OSNA die neue Generation der Sentinellymphknoten-Analyse bei Brustkrebs
2 RD-1i OSNA die neue Generation der Sentinellymphknoten-Analyse bei Brustkrebs Die Sentinellymphknoten-Biopsie (SLNB) hat sich in den letzten Jahren als das operative Verfahren der Wahl bei klinisch nodal-negativen Patientinnen mit primärem Mammakarzinom etabliert. Die intraoperative Analyse des Sentinellymphknotens (SN) erfolgt üblicherweise über den Schnellschnitt oder die Imprint-Zytologie mit anschließender HE-Färbung (Hämatoxylin-Eosin). Diese histopathologischen Methoden besitzen jedoch eine eingeschränkte Sensitivität, da während der Operation nur ein geringer Teil des Lymphknotengewebes untersucht werden kann. Es besteht daher ein beträchtliches Risiko, falsch-negative Ergebnisse zu generieren. Metastasen werden erst später bei der postoperativen Aufarbeitung des Lymphknotengewebes detektiert. OSNA (One Step Nucleic Acid Amplification) ist ein neuer diagnostischer Ansatz, der bereits vielfältig in der Routine Einsatz findet. Erstmals wird die Untersuchung des gesamten Lymphknotens innerhalb des intraoperativen Zeitrahmens ermöglicht. Auf diese Weise liegt bereits während des chirurgischen Eingriffs ein zuverlässiges Ergebnis vor, auf dessen Basis klinische Entscheidungen getroffen werden können. Somit können eine erhebliche Anzahl von Zweit- Operationen und weitere histologische Untersuchungen vermieden werden.
3 Klinische Validierungsstudien und deren Ergebnisse Das OSNA -Verfahren wurde in mehreren multizentrischen Studien in verschiedenen Ländern evaluiert [1 5]. In all diesen Studien wurde die Methode mit einer sehr ausführlichen histopathologischen Untersuchung verglichen. Dazu wurden die Lymphknoten mit einem speziellen Schneidgerät in vier Scheiben von 1 oder 2 mm Dicke geschnitten. Jeweils zwei alternierende Scheiben wurden mit OSNA analysiert, und die anderen beiden Scheiben für die histologische Begutachtung verwendet. Hierfür wurden Paraffinschnitte in fünf Stufen im Abstand von 1, 2 oder 25 μm angefertigt. Die Analyse von insgesamt 2313 Lymphknoten hat für die OSNA Methode folgende Daten ergeben: Konkordanzrate 96.5 % Sensitivität 95.6 % Spezifität 96.7 % Innerhalb einer japanische Multicenterstudie ergab die Analyse mit OSNA bei pn-patientinnen (144 analysierte Lymphknoten) eine Spezifität von 1 % (Tabelle 1). OSNA n = 144 (++) (+) ( ) Makro Pathologische Untersuchung positiv Mikro Spezifität: 1 % (95% C.I.:.935 ~.993) Tabelle 1 Die Analyse von 144 Lymphknoten von 6 pn-patientinnen ergab eine Spezifität von 1 % negativ 144 Bei dieser Studie zur Spezifität des OSNA -Verfahrens lag die Anzahl der CK19 mrna-kopien deutlich unter dem Cut-off-Wert des OSNA -Assays. Somit ist es extrem unwahrscheinlich, dass mit OSNA falsch-positive Ergebnisse generiert werden (Abb. 4). Anzahl der Lymphknoten k.d Ergebnisse einer Spezifitätsstudie Abb. 4 Verteilung der CK19 mrna-kopienzahl von 144 Lymphknoten von 6 pn-patientinnen Die Ergebnisse aller klinischen Studien zeigen, dass CK19 mrna ein ausgezeichneter molekularer Marker zur Detektion von Lymphknotenmetastasen beim Mammakarzinoms ist. Darüber hinaus belegen sie, dass der Assay als diagnostisches Verfahren zur Analyse des Sentinellymphknotens bei Patientinnen mit Mammakarzinom-Patientinnen sehr gut geeignet ist. OSNA ist CE-zertifiziert und entspricht in vollem Umfang den Anforderungen der Richtlinie 98/79/EG für In-Vitro- Diagnostika. Der Test ist somit europaweit für den routinemäßigen Einsatz in der klinischen Diagnostik zugelassen CK19 mrna (Kopien/μL) Cut-off-Wert Referenzen [1] Tsujimoto M et al. (27): One-Step Nucleic Acid Amplification for Intraoperative Detection of Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Patients. Clin Cancer Res 13(16) [2] Visser M et al. (28): Intra-operative rapid diagnostic method based on CK19 mrna expression for the detection of lymph node metastases in breast cancer. Int. J. Cancer [3] Schem C et al. (29): One Step Nucleic Acid Amplification a molecular method for the detection of lymph node metastases in breast cancer patients; results of the German study group. Virchows Arch [4] Tamaki Y et al. (29): Molecular detection of lymph node metastases in breast cancer patients: Results of a multicenter trial using one-step nucleic acid amplification assay. Clin Can Res. 15 : [5] Snook KL et al. (21): Multicentre evaluation of intraoperative molecular analysis of sentinel lymph nodes in breast carcinoma. Br J Surg, DOI: 1.12/bjs [6] Frère-Belda MA et al. (212): Diagnostic performance of one-step nucleic acid amplification for intraoperative sentinel node metastasis detection in breast cancer patients. Int J Cancer. 212 May 15 : 13(1) :
4 Fortschrittliche Technologie OSNA ist ein weitestgehend automatisierter molekularer Assay. Das Reaktionsverfahren basiert auf einer speziellen Technologie zur Amplifikation von Nukleinsäuren (RT- LAMP*) und ermöglicht die Bestimmung der Cytokeratin 19 (CK19) mrna-expression. CK19 ist ein Epithelzellmarker und in Lymphknotengewebe normalerweise nicht vorhanden. Die Expressionsrate der CK19 mrna korreliert mit der Größe der metastatischen Herde. Die Auswertung der Analyseergebnisse erfolgt auf der Grundlage einer Standardkurve mit drei Kalibratoren unterschiedlicher Konzentrationen. Auswahl des Markers Im Rahmen der Entwicklung des OSNA -Verfahrens wählte Sysmex 45 infrage kommende Marker aus einer öffentlichen Genexpression-Datenbank aus. Auswahlkriterien waren eine hohe mrna-expressionsrate in Brustgewebe, bei gleichzeitig minimaler oder gänzlich fehlender Expression in normalem Lymphknotengewebe. Das Expressionsrate dieser mrna-marker wurde bei histopathologisch positiven und negativen Lymphknoten evaluiert (Abb. 1 a+b). Untersuchung von 45 mrna-markergenen Es konnten sieben Marker identifiziert werden, die eine hohe Expressionsrate bei Metastase-positiven Lymphknoten zeigten, hingegen in negativen Lymphknoten eine sehr geringe Expressionsrate aufwiesen. In einem zweiten Schritt wurden mit diesen Markern weitere Tests an einer größeren Anzahl von Lymphknoten durchgeführt (Abb. 2). Dabei erwies sich CK19 als der am besten geeignete Marker. Aufgrund seiner hohen Expressionsrate in metastatischen Lymphknoten und der niedrigen Expressionsrate in metastasefreien Lymphknoten besitzt er eine hohe Sensitivität, als auch die Möglichkeit, klar zwischen positiven und negativen Lymphknoten zu differenzieren CK19 FOXA1 SPDEF CEA MGB1 TACSTD2 MUC1 FOXA1 (forkhead box A1), SPDEF (SAM pointed domain containing ETS transcription factor), CEA (carcinoembryonic antigen), TACSTD2 (tumor associated calcium signal transducer 2), MGB1 (mammaglobin1), MUC1 (mucin1) Abb. 2 Expression von mrna-markern in histopathologisch positiven und negativen Lymphknoten Abb. 1 a Verhältnis der mrna-expression zwischen histopathologisch positiven und negativen Lymphknoten Abb. 1 b Expression der einzelnen mrna-marker in histopathologisch positiven Lymphknoten * RT-LAMP = Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification lizensiert von Eiken Chemical CO., LTD
5 RT-LAMP Bei der innovativen Amplifikationstechnologie RT-LAMP handelt es sothermes Reaktionsverfahren, das Vorzüge gegenüber konventionellen PCR-Methoden aufweist. Die Amplifikationsreaktion läuft in nur 16 Minuten ab und erfordert keine vorherige Aufreinigung der RNA. Die Vorgehensweise bei der Probenvorbereitung und das spezielle Primerdesign, zielen auf eine hohe Spezifität und die Vermeidung falsch-positiver Ergebnisse ab. Der Reaktionsverlauf wird im RD-1i, einem automatisierten Real-Time System, in Echtzeit überwacht und ausgewertet. Je nach Anzahl der zu untersuchenden Sentinel-Lymphknoten (max. 4 Proben) liegen die Ergebnisse nach etwa 3 bis 45 Minuten vor (Abb. 3). Das RT-LAMP-Verfahren verwendet sechs unterschiedliche Primer. Sie sind so ausgewählt, dass eine Amplifikation von CK19-Pseudogenen oder deren Transkripten verhindert und zugleich die Reaktion des Assays beschleunigt wird. LAMP Primer Weiterhin verhindert die Präzipitation der DNA bei niedrigem ph-wert (3,5) des Puffers zur Probenaufbereitung, sowie die isotherme Reaktionstemperatur von 65 C eine unerwünschte Amplifikation genomischer DNA. Abb. 3 Real-Time-Monitoring der Reaktion B1 Alle erforderlichen Reagenzien sind gebrauchsfertig. 5 3 B2 3 Target RNA 5 cdna Für die Identifizierung des Sentinellymphknotens eingesetzte blaue Farbstoffe oder kolloidale Radioisotope haben keinen Einfluss auf den Ablauf der OSNA -Reaktion. F2 F1 n Isothermes Reaktionserfahren bei 65 C n Sehr schnelle Amplifikationsreaktion (16 Minuten) L1 3 5 L2 n Keine Aufreinigung der RNA erforderlich n Keine unerwünschte Amplifikation von Pseudogenen oder genomischer DNA F1: Forward Primer 1 F2: Forward Primer 2 B1: Backward Primer 1 B2: Backward Primer 2 L1: Loop Primer 1 L2: Loop Primer 2 oder : DNA Domäne oder : komplementäre Domäne n Hohe Spezifität durch den Einsatz von sechs Primern
6 Technische Spezifikationen Gerät Methode Analyseparameter Technologie Detektionsverfahren Ergebnisparameter Durchsatz Volumen der Gewebeprobe Probevolumen Reagenzien Speicherkapazität Qualitätskontrolle Schnittstellen Gewicht Abmessungen(B x H x T) Genamplifikations-Detektorsystem RD-1i OSNA (One Step Nucleic Acid Amplification) CK19 mrna RT-LAMP (Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification) Trübungsmessung. Veränderung der Lichtdurchlässigkeit des Reaktionsansatzes in Abhängigkeit vom Reaktionsgrad und der gebildeten Menge des Präzipitats Magnesiumpyrophosphat CK19 Q (CK19 Qualitatives Ergebnis) CK19 (CK19 Risetime) CK19 C (CK19 mrna-konzentration) 4 Proben/Analysenlauf 5 6 mg 2 μl Homogenisierungsreagenz LYNORHAG Amplifizierungskit LYNOAMP BC Alle Reagenzien sind gebrauchsfertig 2 Probenergebnisse Positiv- und Negativkontrolle 18 Datenpunkte je QC-Datei Host-Computer (RS232, LAN) Drucker (USB) ca. 66 kg 596 x 548 x 622 mm SNCS optional, mit Sysmex Service Agent und online Fernzugriff. Änderungen des Designs sowie Spezifikationsänderungen basierend auf fortschreitender Produktentwicklung behalten wir uns vor. Solche Änderungen werden bei Neuauflagenerscheinungen bestätigt und anhand des neuen Ausstellungsdatums verifiziert. Copyright 215 Sysmex Europe GmbH Vertrieb Deutschland: Sysmex Deutschland GmbH Bornbarch 1, Norderstedt, Deutschland Telefon lifescience@sysmex-europe.com Vertrieb Österreich: Sysmex Austria GmbH Odoakergasse 34 36, 116 Wien, Österreich Telefon Fax office@sysmex.at Vertrieb Schweiz: Sysmex Suisse AG Tödistrasse 5, 881 Horgen, Schweiz Telefon Fax info@sysmex.ch EU Bevollmächtigter: Sysmex Europe GmbH Bornbarch 1, Norderstedt, Deutschland Telefon Fax lifescience@sysmex-europe.com Hersteller: Sysmex Corporation Wakinohama-Kaigandori, Chuo-ku, Kobe , Japan Telefon Fax Die für Ihre Region zuständige Sysmex Niederlassung finden Sie unter ZE294.DE.C.9/15
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