D. BUCHHEIDT. 3. Medizinische Klinik Universitätsklinikum Mannheim Universität Heidelberg

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1 STUDIE ZUR KLINISCHEN EVALUATION EINES DNA-MICROARRAY ZUR DETEKTION UND IDENTIFIKATION FUNGALER DNA IN BLUT-, BAL- UND GEWEBE-PROBEN NEUTROPENISCHER PATIENTEN D. BUCHHEIDT 3. Medizinische Klinik Universitätsklinikum Mannheim Universität Heidelberg

2 Antimykotische Therapie: Strategien empirische Therapie: bei persistierendem Fieber während Neutropenie bei klinischer Hochrisiko-Konstellation präemptive Therapie ( suspected IFI ): empirische Situation + suggestive Surrogatmarker-Befunde: Lungen- / Organinfiltrat(e), Thorax-CT, Galaktomannan-ELISA, PCR-Assay(s)(?), BD-Glukan-Assay gezielte Therapie: Therapie bei Erregernachweis (Goldstandard: positive Histologie / Kultur)

3 (Aspergillus-) PCR: offene Fragen Probenmaterial, Volumen, Handling/Transport DNA-Extraktionsmethode Primerdesign; Kreuzreaktivität Standardisierung Amplifikationsmethode Amplicon-Nachweis Kontamination DNA-Kinetik unklar Nachweis anderer bzw. mehrerer fungaler Pathogene? (Erregershift, Mehrfachinfektionen)

4 Zielsetzung Etablierung und Evaluation eines optimierten, sensitiven und spezifischen zeitsparenden, Assays zur Diagnostik invasiver Pilzinfektionen mit reduziertem methodischem Aufwand zur Verbesserung der Detektion und Identifikation klinisch relevanter Pilze aus klinischem Material multifungaler DNA-Microarray

5 Multifungaler DNA-Microarray: Schema Spiess B et al, J Clin Microbiol (2007)

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7 Detektionsgrenzen für fungale DNA mit ITS1 PCR Organism (strain) Aspergillus fumigatus (DSM 819) Aspergillus flavus (DSM 1959) Aspergillus terreus (DSM 826) Candida albicans (DSM 11949) Candida dubliniensis (DSM 75921) Candida glabrata (DSM 11226) Candida lusitaniae (clinical sample) Candida tropicalis (DSM 1346) Fusarium oxysporum (DSM 12646) Fusarium solani (DSM 1164) Mucor racemosus (DSM 62760) Rhizopus microsporus var rhizopodiformis (DSM 2196) Scedosporium prolificans (CBS ) Trichosporon asahii (clinical sample) DNA amount 50 pg 20 pg 10 pg 1 pg 1 pg 1 pg 1 pg 1 pg 10 pg 100 pg 10 pg 8 pg 50 pg 10 pg Spiess B et al., J Clin Microbiol (2007)

8 Multifungaler DNA-Microarray: Validierung retrospektive Untersuchung; Labormitarbeiter verblindet 91 klinische Proben (DNA-Proben-Bank; ) 66 Blutproben, 18 BAL-Proben, 7 Gewebe-/Punktatproben (Leber, Milz, Hirn; PLE, CSF 46 neutropenische Patienten Grunderkrankungen: AML, n=21; ALL, n=7; NHL, n=11; andere, n=7 proven IFI: n=5 probable IFI: n=3 possible IFI: n=33 ohne Nachweis IFI: n=5

9 Multifungaler DNA-Microarray: Ergebnisse (1) bei 22/22 Patienten (ohne IFI, n=5; possible IFI, n=17) korrellierten negative konventionelle diagnostische Ergebnisse mit negativen Microarray-Daten bei 4/5 Patienten mit proven IFI bzw. 2/3 Patienten mit probable IFI fanden sich positive Microarray-Befunde

10 Multifungaler DNA-Microarray: Ergebnisse (2) bei einem Patienten mit proven IFI (Hirnabszeß bei invasiver Aspergillus-Infektion) waren die DNA-Microarray-Befunde aus Blutproben negativ (unter intensiver antimykotischer Therapie) bei einem Patienten mit probable IFI (invasive Aspergillus-Infektion (?) war der DNA-Microarray-Befund einer BAL-Probe negativ (unter antimykotischer Therapie)

11 Multifungaler DNA-Microarray: Ergebnisse (3) genomische DNA und spezifische Hybridisierungsmuster von Candida albicans, C. glabrata, C. dubliniensis, Aspergillus fumigatus, A. flavus, Fusarium solani, F. oxysporum, Scedosporium prolificans, Trichosporon asahii waren in bislang untersuchten klinischen Proben nachweisbar ein Pathogen konnte bei 11 Patienten mit IFI identifiziert werden, zwei oder mehr Pathogene waren bei weiteren 11 Patienten mit IFI nachweisbar

12 DNA-Microarray: klinische Befunde Candida glabrata (Blut) Aspergillus fumigatus (C11), Aspergillus flavus (B7), Fusarium oxysporum (B9/B10), Fusarium solani (B12) (BAL) Candida glabrata (A7/A8/A9), Candida dubliniensis (A4) (Milz) Spiess et al, ICAAC 2006 / J Clin Microbiol 2007

13 Multifungaler DNA-Microarray: Zusammenfassung Etablierung eines neuen, sensitiven und spezifischen multifungalen Microarray-basierten Testsystems, das genomische DNA humanpathogener Pilze in klinischen Proben (Blut, BAL, Gewebe, liquide Punktate) rasch detektiert und identifiziert Erste Daten weisen auf ein hohes Potential des Tests zur Verbesserung der Diagnostik invasiver Pilzinfektionen bei neutropenischen Patienten hin Weitere Evaluation des Assays in einer prospektiven, multizentrischen Studie

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15 STUDIENPROTOKOLL Multizentrische, prospektive, offene Studie zur Untersuchung der klinischen Signifikanz eines multifungalen DNA-Microarrays und eines Galaktomannan-Antigen-ELISA zum Nachweis von humanpathogenen Pilzen aus Blut, bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit, Liquor und Punktaten zur Diagnose einer invasiven Pilzinfektion bei Hochrisiko-Patienten mit akuten Leukämien in der Induktionstherapie und nach allogener Blutstammzell- Transplantation Prof. Dr. D. Buchheidt Dr. Margit Hummel Dr. Birgit Spiess 3. Medizinische Klinik, Universitätsklinikum Mannheim Gefördert durch die Deutsche Krebshilfe e.v., Forschungsprojekt Bu 1 Kontakt: dieter.buchheidt@urz.uni-heidelberg.de