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Viktoria Mann
vor 6 Jahren
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1. EINLEITUNG 1 1.1 Angeborene Immunität Die erste Abwehr 1 1.2 Phagozytose und Phagosomenreifung 2 1.2.1 Phagozytose 2 1.2.2 Phagosomenreifung 3

1 1. EINLEITUNG Angeborene Immunität Die erste Abwehr Phagozytose und Phagosomenreifung Phagozytose Phagosomenreifung Die vakuoläre Protonenpumpe (v-atpase) Die v-atpase - Enzym mit komplexem Aufbau und vielen Funktionen Funktionsweise der v-atpase Ansäuerungsmechanismen in Phagosomen Überlebensstrategien intrazellulärer Pathogene Rhodococcus equi Die Gattung Rhodococcus Rhodococcus equi Bodenbakterium mit gefährlichem Potential Virulenzfaktoren von R. equi Die Zellwand von R. equi Erste Schutzbarriere nach außen Aufbau der Zellwand von R. equi Mycolsäuren Zellwand-Komponenten als Virulenzfaktoren Das R. equi-phagosom Ziele dieser Arbeit MATERIAL UND METHODEN Material Allgemeine Lösungen und Puffer Methoden zur Kultur von Säugerzellen Zellkulturmedien Zelllinien und primäre Säugerzellen Kultur von J774E-Makrophagen Kultur von J774E-v-ATPase-GFP-und RAW-SytV-GFP-Makrophagen Kultur von L929-Fibroblasten und Herstellung von L929-Kulturüberstand Isolierung und Kultur von primären Knochenmarksmakrophagen (BMM) aus Mäusen Einfrieren, Lagerung und Auftauen von Säugerzellen Bestimmung der Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer 33 i

2 2.3 Methoden zur Kultur von Bakterien Kulturmedien Bakterienstämme Anzucht von Bakterien Einfrieren, Lagerung und Auftauen von Bakterien Bestimmung der Bakterienzellzahl Töten von Bakterien durch Hitze Protein-Biochemische Methoden Dot Blot-Technik zum Nachweis der vapa-expression in R. equ/'-stämmen Proteinbestimmung mittels Biorad DC Protein Assay SDS-PAGE Western Blot Immunmarkierung von Dot Blots und Western Blots Reinigung von VapA-His6 aus f. coli BL21 /pet28a-vapa-his Reinigung von VapA aus R. equi mittels Triton X-114- Extraktion Lipid-Biochemische Methoden Extraktion von Zellwandlipiden von R. equi Isolierung von TDM aus Zellwandlipid-Extrakten von R. equi BeSchichtung von Bakterien mit Zellwandlipid-Extrakten oder TDM von R. equi Infektion von Makrophagen Fluoreszenzmarkierung von Bakterien und Zymosanpartikeln Fluoreszenzmarkierung von endozytischen Kompartimenten mit BSA-Rhodamin Herstellung von BSA-Rhodamin Fluoreszenzmarkierung von Lysosomen mit BSA-Rhodamin Aussäen von Zellen für Infektionsexperimente Infektion von Makrophagen mit Bakterien oder Zymosanpartikeln zur Beurteilung der Phagosomenreifung Infektion von Makrophagen mit Bakterien oder Zymosanpartikeln bei 15 C Intrazelluläre Vermehrung von Bakterien in Makrophagen Bestimmung der zytotoxischen Wirkung von Bakterien auf Makrophagen Einsatz von pharmakologischen Substanzen bei Infektionsexperimenten Zugabe von gereinigtem VapA bei der Infektion von Makrophagen mit Bakterien Infektion von Makrophagen mit Lipid-beschichteten Bakterien 51 ii

3 Fixieren und Quenchen von Zellpräparaten für die Mikroskopie Fluoreszenz-Markierungen von fixierten Zellpräparaten für die Mikroskopie Immunfluoreszenz-Markierungen Aktinfärbung mit Fluoreszenz-markiertem Phalloidin Eindecken der Proben für die Mikroskopie Mikroskopie Fluoreszenz-Mikroskopie und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Kolokalisationsbestimmung mittels LSM-Software Transmissionselektronenmikroskopie Beschichtung von Latex Beads mit Maus-Fc-Fragment Infektion von J774E-Makrophagen mit Latex Beads für elektronenmikroskopische Untersuchungen Präparation von Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie Statistische Analysen ERGEBNISSE Rekrutierung der v-atpase durch Phagosomen Kolokalisation endozytischer Kompartimente mit der v-atpase Kinetische Untersuchungen der Phagosomenreifung Phagozytose von Zymosanpartikeln nach kurzen Infektionszeiträumen Reifung von Zymosan-enthaltenden Phagosomen Untersuchungen zur Rekrutierung der v-atpase von der Plasmamembran Rekrutierung der v-atpase zum Phagosom nach Einsatz pharmakologischer Substanzen Wirkung pharmakologischer Substanzen auf die gesamte Zelle Einfluss pharmakologischer Substanzen auf die Phagozytose von Zymosanpartikeln Einfluss pharmakologischer Substanzen auf die Rekrutierung der v-atpase zum Phagosom Einfluss pharmakologischer Substanzen auf die Rekrutierung des Transferrin-Rezeptors zum Phagosom Einfluss pharmakologischer Substanzen auf die Rekrutierung von EEA1 zum Phagosom 78 iii

4 Einfluss pharmakologischer Substanzen auf die Rekrutierung der v-atpase und von EEA1 zum Phagosom Das 15 C-Kompartiment Eine Methode zur Untersuchung früh- phagosomaler Reifungsstadien? Untersuchungen des Zymosan-enthaltenden 15 C-Phagosoms Phagozytose von Zymosanpartikeln und Phagosomenreifung bei 15 C Elektronenmikroskopische Untersuchungen an 15 C-Phagosomen Untersuchung von R. equi im 15 C-Phagosom Rekrutierung der v-atpase zu R. equf-enthaltenden Phagosomen bei 37 C Rekrutierung der v-atpase zu R. equ/'-enthaltenden Phagosomen bei 15 C Fusion von R. equ/'-enthaltenden Phagosomen mit Lysosomen bei 15 C Intrazelluläre Vermehrung von R. equi und anderen Bakterienspezies Zytotoxische Wirkung von R. equi und anderen Bakterienspezies auf Makrophagen Manipulation der Reifung von R. equ/'-enthaltenden Phagosomen durch Einsatz der pharmakologischen Substanz Brefeldin A Brefeldin A vermindert die Rekrutierung der v-atpase zu Phagosomen von R. equi Brefeldin A vermindert die Phagolysosomenbildung R. equ/'-enthaltender Phagosomen Brefeldin A ermöglicht die intrazelluläre Vermehrung avirulenter R. equi Manipulation der Phagosomenreifung durch R. equi-lipide Nachweis der Lipidbeschichtung von E. coli mit R. equ/tdm TDM von R. equi 103+ begünstigt die Inhibition der Phagolysosomenbildung Bestandteile des R. equi 103+-Lipidextraktes begünstigen den Ausschluss der v-atpase aus dem Phagosom Manipulation der Reifung von R. equ/'-enthaltenden Phagosomen durch Einsatz von exogen zugegebenem VapA 109 iv

5 4. DISKUSSION Rekrutierung der v-atpase zum Phagosom Kolokalisation der v-atpase mit anderen Markern in der Zelle Reifung von Zymosan-enthaltenden Phagosomen Mögliche Quellen der phagosomalen v-atpase Die Plasmamembran als Quelle der phagosomalen v-atpase Frühe Endosomen als Quelle der phagosomalen v-atpase Späte Endosomen und Lysosomen als Quelle der phagosomalen v-atpase TGN-Vesikel als Quelle der phagosomalen v-atpase Die Rekrutierung der v-atpase erfolgt hauptsächlich von TGN-Vesikeln und frühen Endosomen Das 15 C-Phagosom Eine Methode zur Untersuchung früh-phagosomaler Reifungsstadien? Charakterisierung der Phagosomenreifung im 15 C-Phagosom R. equi im 15 C-Phagosom Eignung des 15 C-Phagosoms für die Untersuchung früh-phagosomaler Reifungsstadien Manipulation der Reifung R. equi-enthaltender Phagosomen Zusammenbruch des Golgi-Apparates fördert die Etablierung von REVs durch avirulente R. equi Manipulation der Phagosomenreifung durch Oberflächenlipide von R. equi Manipulation der Reifung R. equ/'-enthaltender Phagosomen durch VapA Modelle zur Reifung R. equi-enthaltender Phagosomen ZUSAMMENFASSUNG 137 LITERATURVERZEICHNIS 139 ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS 157 DANKSAGUNG PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRÄGE EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG I III V v

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