Bestimmung von Normwerten für die intrazelluläre Kalziumkonzentration in T- Lymphozyten von Neugeborenen und Erwachsenen.

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1 Aus der Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. Volker Stephan Dienstort: Sana- Klinikum Lichtenberg Abt. Kinder- und Jugendmedizin Bestimmung von Normwerten für die intrazelluläre Kalziumkonzentration in T- Lymphozyten von Neugeborenen und Erwachsenen. (Ontogenetische Aspekte des Anstiegs der intrazellulären Kalziumkonzentration nach Stimulation.) Inaugural- Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Martin Deckers aus Velbert 2008

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3 Aus der Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. Volker Stephan Dienstort: Sana- Klinikum Lichtenberg Abt. Kinder- und Jugendmedizin Bestimmung von Normwerten für die intrazelluläre Kalziumkonzentration in T- Lymphozyten von Neugeborenen und Erwachsenen. (Ontogenetische Aspekte des Anstiegs der intrazellulären Kalziumkonzentration nach Stimulation.) Inaugural- Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Martin Deckers aus Velbert 2008

4 Dekan: Prof. Dr. med. Gert Muhr Referent: PD Dr. med. Volker Stephan Korreferent: Prof. Dr. med. Uwe Schauer Tag der Mündlichen Prüfung:

5 Abstract: Deckers,Martin Bestimmung von Normwerten für die intrazelluläre Kalziumkonzentration in T- Lymphozyten von Neugeborenen und Erwachsenen Problem: Angeborene Immundefekte sind seltene Erkrankungen. Eine Untergruppe dieser Erkrankungen stellen dabei Signalübertragungsstörungen bei T- Lymphozyten dar. Zu den möglichen Untersuchungen bei Verdacht auf diese Störung gehört die Messung des Anstiegs der intrazellulären Kalziumkonzentration nach T- Zellrezeptor Aktivierung. Kommt es zu einem unzureichenden Anstieg der Kalziumkonzentration liegt ein Defekt der Signaltransduktion zwischen T- Zellrezeptor und Kalziumfreisetzung aus intrazellulären Lagern bzw. Einstrom extrazellulären Kalziums vor. Im weiteren Verlauf der Signaltransduktion ist dieser Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration elementar für Transkriptionsvorgänge im Nukleus und somit für eine Immunantwort. Methode: Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung von Normwerten für Kalziumstimulationsversuche mit T- Lymphozyten Neugeborener. Zusätzlich wurden in einer Kontrollgruppe aus gesunden Erwachsenen die Normwerte für Kalziumstimulationsversuche in diesem Kollektiv festgestellt und mit den Werten der Neugeborenen verglichen. Ziel dieser Untersuchung war es herauszufinden, ob es Unterschiede bezüglich der intrazellulären Kalziumkonzentration nach T- Zellaktivierung zwischen Neugeborenen und Erwachsenen gibt. Zu diesem Zwecke wurde aus dem Nabelschnurblut Neugeborener und dem Blut gesunder Erwachsener T- Lymphozyten separiert und mit Fura 2AM, einem kalziumsensitiven Farbstoff inkubiert. Die Messung der Kalziumkonzentrationen erfolgte nach Stimulation mit monoklonalen Antikörpern und Lektinen mittels eines Fluoreszenzspektrometers. Ergebnis: Die gemessenen intrazelluläre Kalziumkonzentrationen betrugen bei den Neugeborenen für die Stimulation mit PHA 170,91nmol/l (SD 20,15), für Stimulation mit Anti- CD3 87,15nmol/l (SD 8,26) und bei Quervernetzung der Oberflächenantigene 137,98nmol/l (SD 18,22). In der Gruppe der Erwachsenen Probanten fand sich für PHA 228nmol/l (SD 18,85), für Stimulation mit Anti- CD3 99,61nmol/l (SD 6,97) und bei Quervernetzung der Oberflächenantigene 182,38nmol/l (SD 19,66). Im Vergleich der beiden Kollektive zeigte sich ein signifikanter Unterschied (p < 0.001) zwischen den gemessenen Kalziumkonzentrationen, die T- Lymphozyten Neugeborener reagieren somit auf T- Zellrezeptorstimulation mit einem geringeren Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Diskussion Im Rahmen der klinischen Diagnostik angeborener Immundefekte sind Abweichungen zwischen den Werten der kindlichen Patienten und den Werten Erwachsener Kontrollpersonen, die zur Überprüfung der Versuchsansatzes oft mit gemessen werden, innerhalb der hier gewonnen Werte physiologisch.

6 1 Inhaltsverzeichnis 1 INHALTSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNISS EINLEITUNG T- LYMPHOZYTEN IM IMMUNSYSTEM DER T- ZELL-REZEPTOR DIE SIGNALTRANSDUKTION Intrazelluläre Signalkaskaden: Von der Rezeptoraktivierung zum intrazellulären Kalziumanstieg Die Endstrecke der Signaltransduktion: Vom intrazellulären Kalziumanstieg zur Transkription KALZIUMFREISETZUNG IN T- LYMPHOZYTEN BEI IMMUNDEFIZIENZSYNDROMEN ZAP-70 Defekt Kalziumfreisetzung in T- Lymphozyten bei einer Untergruppe der Antikörpermangelsyndrome Andere Immundefekte mit pathologischen Calciumwerten nach Stimulation Beispiel eines Immundefizienzsyndroms mit normalem Kalziumanstieg nach Stimulation MESSUNG INTRAZELLULÄRER KALZIUMKONZENTRATIONEN Historie der Messung intrazellulärer Kalziumkonzentrationen FRAGESTELLUNG METHODIK PATIENTEN METHODIK Versuchsanordnung und Versuchablauf Der Farbstoff Fura 2AM MATERIAL Reagenzien Laborgeräte ERGEBNISSE VORVERSUCHE Dosis-Wirkungs-Kurve von PHA und CD3 Antikörper Lagerungsversuche HAUPTVERSUCHE Ergebnisse der Hauptversuche, Neonaten: Ergebnisse der Hauptversuche, adulte Probanden: MESSKURVEN Verlauf einer Messung ohne Stimulation: Verlauf einer Messung mit PHA- Stimulation: Verlauf einer Messung mit Anti CD3-Stimulation: Normwerte Für die Stimulationsversuche FALLBEISPIEL EINES AM ZAP-70 DEFEKTS ERKRANKTEN KINDES AUS UNSERER KLINIK STATISTISCHE BETRACHTUNG:... 45

7 6.5.1 Grundsätzliche Betrachtungen zu den Messungen Vergleich der Messreihen: DISKUSSION LITERATURÜBERSICHT

8 2 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 Schematische Darstellung des T-Zell-Rezeptors 10 Abbildung 2 Signaltransduktion vom T- Zell Rezeptor zur Calziummobilisation. 15 Abbildung 3: Fura 2AM nach Grynkiewicz et al. 27 Abbildung 4: Wirkmaximabestimmung PHA bei gesunden Erwachsenen. 31 Abbildung 5: Wirkmaximabestimmung CD3 Antikörper bei gesunden Erwachsenen. 32 Abbildung 6: Schematische Darstellung der Ergebnisse, Neonaten. 35 Abbildung 7: Schematische Darstellung der Ergebnisse, adulte Probanden 36 Abbildung 8: Kurve einer Messung ohne Stimulation 37 Abbildung 9: Kurve einer Messung mit Stimulation durch PHA 38 Abbildung 10: Kurve einer Messung mit Stimulation durch Anti CD3/ GAM. 39 Abbildung 11: Normwerte für die Kalziumkonzentrationen in nmol/l. 40 Abbildung 12: Fallbeispiel aus unserer Klinik: Prozentuale Verteilung der Oberflächenmarker 42 Abbildung 13: Fallbeispiel aus unserer Klinik: Ergebnis des Lymphozytentransformationstest 42 Abbildung 14: Fallbeispiel aus unserer Klinik: PHA- Messung, gesunder Erwachsener. 43 Abbildung 15: Fallbeispiel aus unserer Klinik: PHA- Messung Patient. 43 Abbildung 16: Fallbeispiel aus unserer Klinik: Messung Anti CD3, gesunder Erwachsener. 44 Abbildung 17: Fallbeispiel aus unserer Klinik: Messung Anti CD-3, Patient. 44 Abbildung 18: Tabelle Deskriptive Statistik, adulte Probanden 45 Abbildung 19: Tabelle Deskriptive Statistik, Neonaten 46 Abbildung 20: Tabelle t-test bei gepaarten Stichproben, Neonaten 47 Abbildung 21: Tabelle ANOVA Varianzanalyse adulte Probaden und Neonaten 48 Abbildung 22: Vergleich der Messreihen, Keine Stimulation 49 Abbildung 23: Vergleich der Messreihen, Stimulation mit PHA 50 Abbildung 24: Vergleich der Messreihen, Stimulation mit Anti CD3 und GAM 50

9 3 Abkürzungsverzeichniss 1,4,5-IP 3 1,4,5-Inositol-Triphosphat Ak Antikörper ARAMs antigen receptor activation motives ARH antigen receptor homology CD cluster determinants CIF Calcium Influx Factor ConA ConvanalinA CRAC Ca2+ release- activated Ca2+ channels DA Dalton DAG Diacylglycerol ER endoplasmatisches Retikulum GAM- Ak Goat anti Mouse- Antikörper GM-CSF Granulozyten- Makrophagen Colony Stimmulating Factor Grb2 (growth factor receptor-binding protein 2) ITAMs Immunoreceptor Tyrosine-based activation motives IL2 Interleukin 2 IP 4 Inositol-4-Phosphat MHC Major Histocompatibility Complex NF-κB Nuclear Faktor-κB PHA Phytohaemagglutinin PLC Phospholipase C PKC Proteinkinase C PIP 2 Phosphatidylinositol 4,5- biphosphat PWM Pokeweatmitogen SAC Staphylococcus aureus cells SCID Severe combined immunodeficency SLP-76 Src homology 2 (SH2) domain-containing leukocyte protein of 76 kda TNF-α Tumor Nekrose Faktor-α T- Lymphozyten Thymus-abhängige Lymphozyten TH1-, TH2-, T r - - Zellen spezialisierte Subtypen der T- Lymphozyten ZAP 70 Zetaketten- assoziiertes- Protein 70 kda 4

10 4 Einleitung 4.1 T- Lymphozyten im Immunsystem T- Lymphozyten stammen wie alle Zellen im menschlichen Blut von omnipotenten Stammzellen ab. Anders als bei B- Lymphozyten deren Differenzierung im Knochenmark stattfindet, reifen die unterschiedlichen Subpopulationen der T- Lymphozyten im Thymus. Zu diesem Zweck wandern unreife Zellen vom Knochenmark in den Thymus wo die Ausdifferenzierung der T- Lymphozyten (Thymus-abhängige Lymphozyten) stattfindet: Die unreifen Vorläuferzellen, die in diesem Stadium als Thymozyten bezeichnet werden, durchlaufen zunächst eine Phase der Differenzierung und der Proliferation: Während der Differenzierung finden sich verschiedene Zellstadien, die sich jeweils durch ihre unterschiedlichen CD(cluster determinants)- Rezeptoren unterscheiden. Unreife Zellen exprimieren zunächst den CD44-Rezeptor, ein Adhäsionsmolekül, später kommt der CD25-Rezeptor, ein Teil des späteren Rezeptors für das Interleukin IL 2 hinzu. Im weiteren Verlauf der Reifung exprimieren die Zellen CD4- und CD8- Rezeptoren, man bezeichnet sie als doppelt positiv. Die Expression dieser einzelnen Rezeptoren steht für bestimmte Abschnitte der Rekombination. Während der Proliferation kommt es zur Rekombination der, den T- Zell Rezeptor kodierenden Genabschnitte, wodurch bis zu T- Zell-Rezeptoren mit jeweils differenter Spezifität denkbar sind. Es entstehen nun doppelt positive Thymozyten, die eine Vielzahl an unterschiedlichen T- Zell Rezeptoren Aufweisen. Diese werden nun der Selektionierung unterzogen. Diese Selektionierung der Thymozyten dient der Aufrechterhaltung der Selbst-Toleranz: Die reifen T- Lymphozyten müssen in der Lage sein, Fremdstoffe im Körper zu erkennen und körpereigenes Gewebe zu schonen. Zellen, die nicht in der Lage sind körperfremde Substanzen zu erkennen oder deren Rezeptoren sich gegen körpereigene 5

11 Proteine wenden, werden eliminiert. Die Folge dieser Vorgänge ist, dass von den Thymus durchlaufenden Zellen nur ein geringer Teil den Thymus auch verlässt; die restlichen Zellen fallen dem programmierten Zelltod, der Apoptose anheim. Reife Zellen exprimieren nur noch CD4- oder CD8- Rezeptoren in Kombination mit dem T- Zell Rezeptor CD3. Die unterschiedlichen Reifungsstadien sind dabei in verschiedenen Regionen des Thymus lokalisiert. So finden sich die unreifen Thymozyten in der Rinde, die reifen Zellen dagegen im Mark des Thymus. Die ausgereiften Zellen, die nun als T- Lymphozyten bezeichnet werden, verlassen den Thymus und besiedeln Milz, Lymphknoten und das lymphatische Gewebe im Gastrointestinaltrakt. Diese Selektionierungs- und Reifungsprozesse finden ausschließlich im Thymus statt, dessen Vorhandensein somit Voraussetzung für die Bildung von funktionstüchtigen T- Lymphozyten ist. Eine der wesentlichen Aufgaben von T- Lymphozyten ist die Erkennung von Fremdantigenen und die Einleitung einer Immunantwort des Organismus gegen die potentiell krankmachenden Stoffe. Dabei unterscheidet man unterschiedliche Subtypen an T- Lymphozyten: TH1-Zellen aktivieren Makrophagen, die so in die Lage versetzt werden intrazellulär in Vesikeln vorliegende Mykobakterien abzutöten. TH-2 aktivieren B- Lymphozyten und steigern ihre Fähigkeit extrazelluläre Keime zu erkennen und zu vernichten. B- Lymphozyten differenzieren dann zu Plasmazellen, die Antikörper bilden und freisetzen (humorale Immunität). Ferner sind noch regulatorische T- Lymphozyten (T r ) bekannt, die CD4/ CD 25 positiv sind [66]. Diese Zellen inhibieren aktivierte T- Zellen und unterbinden Immunreaktionen. Sie sind für die Mechanismen der Selbsttoleranz des Organismus mitverantwortlich und spielen eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen [32, 34]. Während B-Lymphozyten ihre Antigene in extrazellulären Bereichen finden, sind T- Lymphozyten in der Lage Antigene zu erkennen, die intrazellulär gebildet werden. Damit T- Lymphozyten Antigene erkennen können, müssen diese an einen Haupthistokompatibilitätskomplex (engl.: Major Histocompatibility Complex, MHC), gebunden, dem T- Zell-Rezeptor präsentiert werden. Dies geschieht durch so genannte 6

12 Antigen präsentierende Zellen. Dieser Umstand wird als MHC- Restriktion der T- Lymphozyten bezeichnet. Man unterscheidet MHC Klasse I und MHC Klasse II Moleküle, die beide nur in der Lage sind Peptide, also bereits proteolytisch aufgespaltene Antigene zu präsentieren. MHC Klasse I Moleküle werden von fast allen kernhaltigen Zellen gebildet. Auf den entsprechenden Zellen des Immunsystems, präsentieren MHC Klasse I Moleküle endogene, im Cytosol gebildete bzw. aufgespaltete Peptide; dies können zum Beispiel Peptide von Viren, intrazellulär lebenden Bakterien wie Mykobakterien, und Parasiten wie Plasmodien und Leishmanien sein. Diese Erreger sind aufgrund ihrer intrazellulären Lage vor B-Lymphozyten oder zirkulierenden Antikörpern geschützt. Die infizierten Zellen exprimieren jedoch Antigene des Keims auf ihrer Zelloberfläche, wo die unterschiedlichen T- Lymphozyt Populationen diese erkennen und spezifische Abwehrschritte einleiten. So können zytotoxische T- Lymphozyten infizierte Zellen anhand von an MHC Klasse I Molekülen gebundenen Antigenen erkennen und töten sie ab, bevor z.b. virale Replikationsvorgänge abgeschlossen werden können. MHC Klasse II Moleküle präsentieren exogene, aus der Umwelt des Organismus aufgenommenen Fremdstoffe. Dies sind unter anderem phagozytierte Antigene und Keime. Zu den MHC-Klasse II positiven Zellen gehören B-Lymphozyten, Makrophagen und Epithelzellen venöser Gefäße sowie dendritische Zellen (aus CD34 positiven Stammzellen, in Gegenwart von GM-CSF und TNF-α hervorgegangene, zur Migration befähigte Zellen). TH1- und TH2-Zellen erkennen Antigene, die an MHC Klasse II Molekülen gebunden präsentiert werden. Die Verbindung zwischen dem T- Zell Rezeptor und den MHC- Molekülen wird auch Immunologische Synapse genannt [64]. Die Antigenpräsentation setzt eine Folge von strukturellen Veränderungen auf der Oberfläche des T- Lymphozyten in Gang. Hierbei bildet sich auf dem T- Lymphozyten nach Kontakt mit einer antigenpräsentierenden Zelle um eine Gruppe aktivierter T- Zell Rezeptoren (central supramolecular activation cluster, csmac) ein Ring weiterer, für die Stabilisierung des Kontakts relevanter Rezeptoren (peripheral supramolecular activation cluster, psmac). Der Kontakt zwischen den beiden Zellen muss mehrere Stunden 7

13 bestehen bleiben, damit es zu einer vollständigen Aktivierung des T- Lymphozyten kommt [13]. 4.2 Der T- Zell-Rezeptor Jeder T- Lymphozyt verfügt über ca spezifische Antigenrezeptoren, den T-Zell- Rezeptor. Dieser T- Zell-Rezeptor besteht aus zwei Glykoproteinen, der α- und β-kette. Sie sind über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden und verfügen extrazellulär im Bereich des terminalen Endes eine variable Domäne (V-Domäne). Diese V-Domäne macht die Spezifität des T- Zell-Rezeptors aus und wird für die α-kette auf dem Chromosom 14q11, für die β-kette auf dem Chromosom 7 kodiert. Sie besteht aus V- (variable) Abschnitten in Verbindung mit J-(joining- ) und D-(diversity- ) Abschnitten. Nach der V-Domäne schließt sich ein konstante Domäne (C-Domäne) an. Sowohl die α- als auch die β-kette sind mit einem hydrophoben Abschnitt, der aus positiv geladenen Aminosäuren besteht in der Lipiddoppelschicht der Zellmembran verankert und verfügen beide über kurze intrazelluläre Abschnitte, die bei der Signaltransduktion jedoch ohne Bedeutung sind. Der intrazelluläre Teil der α-kette ist jedoch an der Phosphorylierung der γ-kette sowie der Regulation der T- Zell-Rezeptoren nach Stimulation beteiligt; so weisen Zellhybriden ohne intrazelluläre α-kette eben diese Besonderheiten auf [4]. Die fehlenden intrazellulären Abschnitte des T-Zell-Rezeptors werden durch weitere membranständige Rezeptoren ergänzt, die große intrazelluläre Domänen besitzen und somit eine funktionelle Einheit mit dem T-Zell-Rezeptor bilden [27]. Dies ist zu einen der CD3-Rezeptor, einem aus mehreren Peptiden (γ-, δ- und ε-kette) bestehenden Rezeptor die jeweils als Heterodimere in Form von γ/ε- und δ/ε-ketten vorliegen. Bei der Aktivierung kommt es zu strukturellen Veränderungen des T-Zell-Rezeptors sowie des CD3- Rezeptors die jedoch noch nicht genau verstanden sind [35]. 8

14 Ferner ist der T-Zell-Rezeptor mit der ζ-kette, die als ein über Disulfidbrücken verbundenes Dimer vorliegt assoziiert. Als Corezeptoren fungierenden des weiteren CD4- und CD8-Rezeptoren: Der CD4- Rezeptor besteht aus einem extrazellulär gelegenen, über vier Domänen umfassenden Teil, der MHC-Klasse-II Moleküle bindet, sowie über eine intrazellulär gelegene Domäne, die mit der cytoplasmatischen Tyrosinkinase p56 lck reagiert. Der CD8-Rezeptor ist ein aus einer α- und einer β-kette bestehendes Heterodimer, wobei die beiden Ketten über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Sie binden MHC- Klasse-I Moleküle. Die intrazelluläre Domäne reagiert ebenfalls mit der Proteinkinase lck. Der CD8-Rezeptor erhöht die Empfindlichkeit von T- Lymphozyten gegenüber von MHC-Klasse-I präsentierten Antigenen um ein Vielfaches. Während der CD3-Rezeptor über extrazelluläre Domänen verfügt, liegt die ζ-kette zum größten Teil intrazellulär. Jedoch dienen beide Rezeptoren nicht der Antigenerkennung, sondern sind zum einen für die Signaltransduktion von Bedeutung und zum anderen sind sie für die Anzahl der T- Zell Rezeptoren auf der Zelloberfläche von Bedeutung: Personen mit CD3-Ketten Defekt weisen eine verminderte Anzahl an T- Zell Rezeptoren auf und leiden an einer Immunschwäche [6]. Hierbei scheinen die für die Verankerung der CD3-Ketten verantwortlichen, in der Zellmembran gelegenen Aminosäureketten von Bedeutung zu sein, die aus überwiegend negativ geladenen Aminosäuren bestehen. Für eine funktionierende Immunantwort sind sowohl T- Zell Rezeptor als auch CD3- Rezeptor Komplex notwendig: Die α- und β-kette liegen hauptsächlich extrazellulär und dienen der Antigenerkennung, die Peptide des CD3-Rezeptors haben lange intrazelluläre Anteile und dienen der Signaltransduktion, nachdem ein Antigen an den T-Zell-Rezeptor gebunden hat [27, 35, 41, 57]. 9

15 Abbildung 1: Schematische Darstellung des T-Zell-Rezeptors 10

16 4.3 Die Signaltransduktion Intrazelluläre Signalkaskaden: Von der Rezeptoraktivierung zum intrazellulären Kalziumanstieg. Wie der Aufbau und die Funktion des T- Zellrezeptors sind auch die an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligten Enzyme Gegenstand intensiver Forschung. So werden mittels neuer Methoden wie Klonierung bereits bekannten Proteinen eine Funktion in der Signaltransduktion zugeordnet und neue Proteine entdeckt [10]. Dem hingegen sind die Schritte, die zum Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration nach T- Zell Rezeptor Aktivierung führen bekannt: Am Anfang der intrazellulären Signalkette steht, nachdem ein Antigen dem T- Lymphozyten präsentiert wurde, die Aktivierung von Tyrosinkinasen der Src- Familie durch die cytoplasmatischen Anteile des CD3 Rezeptors. Zu diesem Zweck verfügen sie im Fall der Gamma- Delta- und Epsilon- Kette über je eine, im Fall der Theta- Kette über drei als ITAMs, ARAMs, oder ARH-1 bezeichnete Gruppen. Diese Gruppe von Proteinkinasen, deren Mitglieder die Proteinkinasen p56 Lck (Lck) und p59 Fyn sind, ist membranständig. Sie phosphoryliert ihrerseits die Zeta-Kette. Die so aktivierte Zeta-Kette bindet ihrerseits die cytoplasmatischen Proteinkinasen Syk und ZAP-70 (Zetaketten- assoziiertes- Protein 70 kda). ZAP-70 liegt im ruhenden T- Lymphozyten bereits phosphoryliert und assoziiert mit der Zeta- Kette vor. Tyrosinphosphorylierung durch Lck führt nun zur Steigerung der enzymatischen Aktivität von ZAP-70 [60]. Ein wichtiges Substrat für ZAP 70, das für eine funktionierende Signalkaskade essentiell ist, ist das Protein SLP-76 SLP- 76 wird im Zuge der T- Zell Aktivierung Tyrosin- phosphoryliert. Als Substrate des SLP-76 werden Phospholipase C-γ1 und das Adapter-Protein Grb2 diskutiert [68, 70]. Ein weiteres Substrat ist das 120 kda Protein p120cbl das ebenfalls nach T- Zell Rezeptor Aktivierung Tyrosin- phosphoryliert wird. Es bindet im weiteren Verlauf andere Proteinkinasen wie Fyn, Lck, Src, sowie Phospholipase C (PLC) und GTPase- 11

17 activating protein. P120 stellt eine Verbindung zwischen den verschiedenen Signalkaskaden nach T- Zellrezeptor Aktivierung dar [40, 52, 59]. Untersuchungen mit gentechnisch hergestellten dominanten ZAP-70 Defekten haben die Bedeutung dieser Proteinkinase untermauert [65]. Diese ersten Schritte in der Signaltransduktion führen jedenfalls zu einer Aktivierung verschiedener Signalwege im T- Lymphozyten. Zum einen wird die PLC aktiviert, welche durch Hydrolysierung von Phosphatidylinositol 4,5- biphosphat die Bildung der Second Messenger Diacylglycerol (DAG) und 1,4,5-Inositol-Triphosphat (1,4,5-IP 3 ) bewirkt [70]. DAG aktiviert Proteinkinase C (PKC), ein Enzym mit regulatorischer und mit katalytisch aktiver Domäne, die in verschiedenen Isoformen vorliegt, die sich in ihrer Sensitivität gegen über Kalzium, DAG sowie in ihren Substraten unterscheiden [29]. Bindung von 1,4,5-IP 3 an 1,4,5-IP 3 -Rezeptoren am endoplasmatischen Retikulum (ER) und an der Zellmembran bewirken eine Entleerung intrazellulärer Kalzium-Reservoirs. Die Aktivität des IP 3 -Rezeptors wird durch Kalzium-Ionen selbst reguliert: Geringe Kalzium-Konzentrationen stimulieren, hohe Kalzium-Konzentrationen inhibieren den 1,4,5-IP 3 -Rezeptor. Die Kalziumlager des ER erklären jedoch nicht die Intensität des Kalzium Anstiegs, so dass extrazelluläres Kalzium bei der T- Zellaktivierung eine entscheidende Rolle spielt [53]. Der Einstrom des extrazellulären Kalziums in die Zelle unterliegt verschiedenen Regulationskreisen: Zunächst finden sich auch in der Plasmamembran IP 3 -Rezeptoren, die sich im Aufbau von den 1,4,5-IP 3 -Rezeptoren am ER geringfügig unterscheiden und eine höhere Affinität zu Inositol-4-Phosphat haben jedoch für den Kalzium-Einstrom zum Teil verantwortlich zu sein scheinen. Daneben reguliert die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern direkt den Einstrom von extrazellulärem Kalzium: Der initiale Kalziumanstieg führt zur Freisetzung eines Second messengers, CIF (Calcium Influx Factor), der aus intrazellulären Organellen freigesetzt wird und die in der Plasmamembran lokalisierten Kalziumkanäle aktiviert [51]. 12

18 Diese Membranständigen Kalziumkanäle, CRAC (Ca2+ release- activated Ca2+ channels), reagieren auf den Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration mit einer weiteren Erhöhung der Kalziumkonzentration durch den Einstrom extrazellulären Kalziums [36]. Das Öffnen dieser Kalzium Kanäle führt zu der lang anhaltend erhöhten Kalziumkonzentration im T- Lymphozyten [21, 46]; daraus resultiert nachfolgend die Transkription entsprechender Gensequenzen [20, 47]. Die Anzahl der CRAC Kanäle steigt während der Aktivierung des T- Lymphocyten dabei von ca. 15 Kanälen bei nicht aktivierten auf ca.140 Kanäle bei aktivierten T- Lymphocyten. Dabei ist die ursprüngliche Anzahl an CRAC- Kanälen ausreichend um einen suffizienten Kalzium Influx zu gewährleisten, die etwa 10fache Steigerung der Anzahl der Kanäle führt zu einer Verstärkung der Kalzium abhängigen Reaktionen und ist möglicherweise Voraussetzung und Ausdruck der verstärkten immunologischen Aktivität des T- Lymphozyten [25, 56]. Die Bedeutung der CRAC- Kanäle für einen ausreichenden Kalziumanstieg nach T- Zell Aktivierung wird durch den Fall eines Immundefektes verdeutlicht, bei dem ein fast vollständiges Fehlen der CRAC- Kanäle beobachtet wurde: Es fand sich in den betroffenen T- Zellen ein auf 1-2% des Normalen verminderter Kalziumanstieg nach Stimulation und im weiteren eine unzureichende T- Zell Aktivierung [22] Die Endstrecke der Signaltransduktion: Vom intrazellulären Kalziumanstieg zur Transkription. Obwohl noch nicht alle Mechanismen, die von dem Kalziumanstieg nach T- Zell Aktivierung initiiert werden bekannt sind, besitzen wir jedoch Kenntnis über Transkriptionsfaktoren und die sie regulierenden Enzyme. Im Folgenden wird exemplarisch der Einfluss von Kalzium auf die Transkription des Interleukins 2 dargestellt, dieses reguliert Lymphozytenproliferation und Syntheseleistung anderer Interleukine und Wachstumsfaktoren. Das Enzym Calcineurin ist eine Phosphatase, die aus der Calmodulin abhängigen katalytisch wirksamen Einheit Calcineurin A und der regulatorisch wirksamen, 13

19 Kalzium-abhängigen Einheit Calcineurin B besteht. Mit dem Anstieg des intrazellulären Kalziums kommt es zu einer Aktivierung des Calcineurin. Die Aktivierung des Calcineurins korreliert direkt mit der resultierenden T- Zell Aktivierung [11, 50]. Der T- Lymphozyten spezifische Transkiptionsfaktor NF-AT ist Substrat von Calcineurin. Er besteht aus zwei Untereinheiten von denen eine im Cytoplasma und eine in Kern lokalisiert ist. Die cytoplasmatische Untereinheit, die nur in T- Lymphozyten zu finden ist, liegt in verschiedenen Isoformen vor, die zwar alle als Transkriptionsfaktor fungieren, jedoch während der Reifung der T- Lymphozyten im Thymus sowie in den reifen T- Lymphozyten in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen und bei der Selektionierung der T- Lymphozyten im Thymus eine Rolle spielen könnten [2]. Diese cytoplasmatische Untereinheit interagiert während der T- Zellaktivierung mit Calcineurin [42, 71]. Dabei wird eine Phosphatgruppe abgespalten was sie in die Lage versetzt in den Kern zu der dort vorliegenden Untereinheit des NF-AT zugelangen, die zu der AP-1-Familie gehört [58, 61]. Gemeinsam leiten sie dort Transkriptionsvorgänge für das Interleukin IL 2 ein, für dessen Transkription jedoch weitere Faktoren mitverantwortlich sind. Neben NF-AT sind eine Reihe weiterer Transkriptionsfaktoren calcineurinabhängig. Diese sind nicht T- Zell spezifisch, sondern kommen in einer Vielzahl von Geweben, so auch in Lymphozyten vor. Dazu gehört NF-κB (Nuclear Faktor-κB), der die T- Zell Rezeptor vermittelte Transkription des IL2 mitsteuert. Ein weiterer Faktor der die Transkription des IL 2 steuert ist das oben erwähnte AP-1. Dieser Transkriptionsfaktor wird durch PKC und Kalzium reguliert: Aktivierung durch PKC ermöglicht die Bindung an DNA, während die Transkriptionsaktivität durch einen intrazellulären Kalziumanstieg sowie durch Tyrosinphosphorylierung aktiviert wird [55]. Eine Isoform der PKC, die PKC-α, sowie Calcineurin sind in der Lage AP-1 zu aktivieren. Die Aktivität der PKC-α ist Kalzium abhängig [29]. Untersuchungen an B-Lymphozyten, in denen die calziumabhängige Transkriptionsfaktoren NF-AT, NF-κB und JNK ebenfalls zu finden sind, haben darüber hinaus ergeben, dass Dauer und Höhe des Calciumanstiegs eine entscheidende Rolle 14

20 spielen welche Transkriptionsfaktoren aktiviert werden. NF-κB und JNK benötigen eine kurze aber hohe Anhebung der intrazellulären Kalziumkonzentration um aktiviert zu werden, während NFAT niedrige jedoch nachhaltige Erhöhungen des Calciumspiegels benötigt. Auf diese Weise sind Regulationsmechanismen denkbar, die sich eine unterschiedliche Calcium-Sensitivität der Transkriptionsfaktoren zu nutze machen. Es wäre so dem Immunsystem möglich, auch nach Aktivierung weit verbreiteter Second messenger- wie dem intrazellulären Kalzium- variabel zu reagieren [12]. Abbildung 2: Signaltransduktion vom T- Zell Rezeptor zur Calziummobilisation [37]. 15

21 4.4 Kalziumfreisetzung in T- Lymphozyten bei Immundefizienzsyndromen ZAP-70 Defekt Bei dem ZAP- 70 Defekt handelt es sich um eine autosomal rezessive, sehr selten auftretende Erkrankung, die zu den schweren kombinierten Immundefizienzsyndromen gezählt wird. Sie geht charakteristischerweise mit einem Fehlen von CD8 positiven T- Lymphozyten bei gleichzeitigem Vorhandensein von CD4 positiven T- Lymphozyten einher. So sind 60-80% aller Lymphozyten CD4 positiv, während die CD8 positiven Zellen mit 0-3% nahezu fehlen. Des weiteren ist bei den Patienten eine Störung in der Ontogenese des Thymus zu beobachten. Hier spielen T- Zell Rezeptor übermittelte Signaltransduktion und somit funktionierende Proteinkinasen eine entscheidende Rolle bei Entwicklung von doppelt positiven zu einfach positiven Thymozyten. Das Gleiche gilt auch für die positive und negative Selektionierung der T- Lymphozyten [8, 9, 67]. Die Proteinkinase Syk ist in ZAP-70 defizienten Thymozyten in der Lage diesen Mangel zu kompensieren und so den Differenzierungsprozess zum Teil fortzuführen. Dies würde das Vorhandensein von CD4 positiven Zellen bei Patienten mit ZAP-70 Defekt erklären [28]. Histologisch zeigt sich dies in einer Verbreiterung des Cortex mit unreifen Thymozyten zu Ungunsten des Marks mit reifen Thymozyten respektive T- Lymphozyten [45]. Die Anzahl und Funktion der B-Lymphozyten ist meist nicht, die der natürlichen Killerzellen ist nie betroffen. Dies ist in sofern interessant, als dass ZAP-70 in T- Lymphozyten und natürlichen Killerzellen exprimiert wird. Es sind unterschiedliche Mutationen bei den betroffenen Patienten festgestellt worden. Dabei handelt es sich um zwei Punktmutationen mit einfachem Basenaustausch und um eine Deletion von 13 Basenpaaren, die zu einem Auftreten eines vorzeitigen Stopcodons führt. All diesen Mutationen ist gemeinsam, dass sie zu einem Fehlen des Proteins führen [15]. Ferner wurde eine Mutation beschrieben, die nicht die Stabilität des Proteins, sondern nur die 16

22 katalytische Funktion beeinträchtigt [19]. Ursache war hier ein einfacher Basenaustausch. Klinisch fallen die Patienten bereits in den ersten zwei Lebensjahren mit rekurrierenden Infekten und infolgedessen mit Gedeihstörungen auf. Bei Untersuchungen des Blutbildes weisen die Patienten normale bis leicht erhöhte Leukozytenzahlen auf, die Immunglobuline im Serum sind normal bis leicht erhöht. Die Zellen weisen eine fehlende Stimulierbarkeit durch den T- Zell Rezeptor auf. Stimulationstests mit PHA (Phytohaemagglutinin) und Anti-CD3 Antikörpern zeigten keine Proliferation [3, 5, 15, 18, 17, 24]. Stimulationsversuche mit Anti-CD3 Antikörpern und Quervernetzung der Oberflächenantigene ergaben einen deutlich verminderten Anstieg der Kalziumkonzentration [3, 17]. Es fand sich keine IL-2-Produktion nach T- Zell Rezeptor Stimulierung, jedoch nach Stimulation mit Agenzien, welche die ersten Schritte der Signaltransduktion überspringen (Phorbol myristic acetate (PMA), Ionomycin). Die kausale Therapie der betroffenen Patienten besteht zum gegenwärtigen Zeitpunkt in einer Knochenmarkstransplantation. Als Zukunftsperspektive steht hier eventuell die Gentherapie zur Verfügung [62]. Zusammenfassend scheint die Proteinkinase ZAP-70 somit entscheidend für die positive Selektion der CD8 positiven-thymozyten sowie die Signaltransduktion in peripheren CD4 / CD8 positiven T- Lymphozyten zu sein [16] Kalziumfreisetzung in T- Lymphozyten bei einer Untergruppe der Antikörpermangelsyndrome Ein Fehlen des Kalziumanstieg ist auch bei einem Teil der Patienten zufinden, die an einem weiteren Immundefekt leiden, dem Antikörpermangelsyndroms (CVID, Common variabel immunodeficency). Dies betrifft etwa 50-60% aller Erkrankten mit einem Immundefekt. Diese Patienten weisen neben einer Störung der B-Lymphozytenfunktion mit dem Fehlen von Antikörpersubgruppen eine Störung der T- Zell-Rezeptor vermittelten Bildung des Interleukin 2 auf. Bei den betroffenen Patienten findet sich eine normale Anzahl an T- und B-Lymphozyten im peripheren Blutbild, wobei die CD8 17

23 positiven Zellen ebenfalls nicht vermindert sind. Klinisch zeigen sie rezidivierende schwere Infektionen der oberen und unteren Luftwege sowie eine Hypogammaglobulinämie. Die T- Lymphozyten fielen durch unzureichenden Kalziumanstieg nach T- Zell- Rezeptor vermittelter Stimulation auf, während die Zellen nach Stimulation mit PHA normal reagierten. In Proliferationsversuchen zeigte sich bei den in den in der Literatur erwähnten Patienten eine mangelnde Stimulierbarkeit mit anti-cd3 Antikörpern und PHA auf. Die Proteinkinasen ZAP-70 und p 56 lck ließen sich nachweisen. Der fehlende Anstieg des intrazellulären Kalziums beruht auf der ungenügenden Synthese des Kalzium freisetzenden Proteins 1,4,5-Inositol-Triphosphat. Der zugrundeliegende Defekt muss somit in den frühesten Schritten der Signaltransduktion zu suchen sein. Interessanterweise waren die B-Lymphozyten der betroffenen Patienten unter in-vitro- Bedingungen in der Lage Immunglobuline zu produzieren, sodass der Defekt T- Zell spezifisch ist und nicht Schritte der Signaltransduktion betrifft, die B- und T- Lymphozyten gemeinsam sind [23, 24, 26, 39] Andere Immundefekte mit pathologischen Calciumwerten nach Stimulation. Es finden sich in der Literatur auch Fälle von schweren kombinierten Immundefizienzsyndromen, bei denen sich pathologische Kalziumwerte nach Stimulation fanden, und bei denen es sich nicht um einen ZAP70- Defekt handelte: In einem Fall von Immundefizienz bei einem Jungen verwandter Eltern fand sich bei einem klinischen Bild wiederkehrender Infektionen wie orale Candidiasis, Diarrhöe und Pneumonien bei klinischen Untersuchungen folgendes Bild: Bei normalen Lymphozytenzahlen und normaler Verteilung des Phänotyps der Lymphozyten fanden sich erhöhte Immunglobulinwerte für alle Klassen. Proliferationstests mit anti-cd3 Antikörpern waren negativ, jedoch lies sich eine Proliferation mit PMA und Ionomycin auslösen. Messungen der intrazellulären Kalziumkonzentration ergaben einen reduzierten Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration nach anti-cd3 Antikörpergabe und Quervernetzung der Oberflächenantigene. Bei dem beschriebenen 18

24 Fall handelte es sich um einen nicht näher identifizierbaren Defekt in einem frühen Schritt der Signaltransduktion [63]. Bei einem anderen Fall von schwerem Immundefizienzsyndrom bei einem Jungen unverwandter, gesunder Eltern fanden sich bis zum vierten Lebensjahr keine T- Lymphozyten. Ab dem vierten Lebensjahr fanden sich bei normalen Lymphozytenzahlen oligoklonale CD3 positive Zellen, die hauptsächlich den CD8- Rezeptor exprimierten (CD4/CD8- Ratio 0,1). Klinisch zeigte der Junge eine Hepatosplenomegalie sowie radiologisch Lungeninfiltrate, die sich nach Biopsie als Infiltration von CD8 positiven-positiven Zellen darstellte. Die infiltrierenden Zellen waren jedoch nicht monoklonalen Ursprungs, sondern stammten aus mindestens drei klonalen T- Zell Populationen. Im Krankheitsverlauf kam es zu einer fortschreitenden Infiltration der Lunge. Der Junge verstarb im Alter von 10 Jahren an den Folgen respiratorischer Insuffizienz. Die Testung der Lymphozyten ergab folgende Ergebnisse: Die Lymphozyten zeigten keinerlei Reaktion in Proliferationstests mit PHA oder Convanalin A. Auch die Stimulation mit PMA oder Ionomycin ergab keine Proliferation. Die Aktivierung der Phospholipase C sowie ihrer Zielstoffe 1,4,5-IP 3 und DAG waren intakt, die Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration nach Stimulation mit PHA ergab einen zwei- bis fünffach erhöhten Calciumspiegel gegenüber Normalpersonen. Es handelt sich somit um einen Defekt, der im Vergleich zum vorher beschriebenen Fall oder dem ZAP-70 Defekt erst relativ spät in der intrazellulären Signalkaskade auftritt [31]. Ein Beispiel für eine, von der intrazellulären Signalkaskade unabhängigen Störung der Kalziummobilisation ist das fast vollständige Fehlen der CRAC- Kanäle. Hier finden sich bei ungestörter intrazellulärer Signaltransduktion nur 1-2% der normalerweise vorhandenen Kalziumkanäle. Dies führt zu unzureichenden Kalziumkonzentration nach T- Zell Stimulation und dem klinischen Bild eines SCID (Severe combined immunodeficency) [22]. 19

25 4.4.4 Beispiel eines Immundefizienzsyndroms mit normalem Kalziumanstieg nach Stimulation Neben den oben erwähnten Immundefizienzsyndromen mit pathologischem Kalziumanstieg nach Stimulation gibt es Erkrankungen, die unter dem klinischen Bild eines schweren kombinierten Immundefekts auffallen, jedoch normale Kalziumkonzentrationen nach Stimulation aufweisen. So wurde kürzlich von einem männlichen Säugling nicht verwandter Eltern berichtet, der im Alter von einem Monat mit Durchfällen und Gewichtsverlust zum ersten mal auffällig wurde und im Alter von zwei Monaten auf Grund von Dehydratation, Atemversagen und Sepsis aufgenommen wurde. Neben Infektionen mit Rotarviren, Cytomegalieviren und Enterobakter fanden sich bei der Untersuchung eine Lymphozytopenie von 1580 Lymphozyten/ ml sowie eine Hypogammaglobulinämie. Testung auf das HIV-Virus war bei verschiedenen Gelegenheiten sowohl beim Kind wie auch der Mutter negativ. Bei Testung der Oberflächenantigene fiel bei einem normalen prozentualen Anteil der CD-3 positiven Zellen, eine verminderte Anzahl der CD-4 und CD16/56 positiven Zellen und ein gesteigerter Anteil der CD-8 positiven Zellen auf. Das Verhältnis von CD4- zu CD8- positiven Zellen betrug im Verlauf der Erkrankung 0,8 bis 0,2. Therapie mit Interleukin- 2 führte zu keiner Verbesserung der klinischen Situation oder der Laborparameter. Die Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration ergab bei der Stimulation mit anti- CD3 und GAM-Antikörpern (Goat anti Mouse- Antikörper, vernetzen die Oberflächenantigene) einen normalen Anstieg der Kalziumkonzentration. Proliferationstests mit anti-cd3 Antikörpern, PHA und Convanalin A ergaben deutlich reduzierte Werte gegenüber den Kontrollansätzen. Bei der Untersuchung der intrazellulären Proteinkinasen stellte sich bei normaler Expression von ZAP-70 und syk- Kinasen eine Erniedrigung der Proteinkinase p56 lck auf 10% der Kontrolle heraus. Als Ursache dafür stellte sich ein Gendefekt im Exon 7 des lck-gens heraus, der zur Instabilität des Genprodukts führt. 20

26 Der Patient ist der erste bekannt gewordene Fall einer schweren kombinierten Immundefizienz auf Grund einer p56 lck -Expressionsstörung. Er wurde im Alter von 32 Monaten einer Knochenmarkstransplantation unterzogen [31]. 4.5 Messung intrazellulärer Kalziumkonzentrationen Historie der Messung intrazellulärer Kalziumkonzentrationen Bevor die heute angewendeten quantitativen Methoden der Messung intrazellulärer Kalziumkonzentrationen mit Hilfe verschiedener kalziumsensitiver Farbstoffe etabliert wurden, bediente man sich radioaktiv markierten Kalziums um die Aufnahme von Kalzium in die Zelle darzustellen. Dabei setzte man der Lymphozytensuspension eine Lösung eines radioaktiv markierten Kalziumsalzes (z.b. 45 CaCl 2 ) zu. Man stimulierte die Zellen z.b. mit Lektinen und konnte nach dem Waschen der Zellen entsprechend der Kalziumaufnahme in den Lymphozyt eine intrazelluläre Radioaktivität messen [1]. Eine andere Meßmethode war die Messung von Spannungspotentialen mittels Mikroelekroden, eine Meßmethode, die sich nur bei großen wirbellosen Einzellern anwenden ließ. Optische Kalziumindikatoren, die die Messung von Konzentrationen erlaubten waren metallochrome Farbstoffe, die seit den `60er Jahren eingesetzt wurden und der natürliche, lumineszierende Farbstoff Aequorin, der aus einer Qualle der Gattung Aequoria gewonnen wird und ein 22 Da- Protein ist [44]. Die heute angewendeten quantitativen Messungen von intrazellulären Kalzium-Konzentrationen in Lymphozyten waren möglich nach der Entwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen wie Quin vor 20, beziehungsweise Indo und Fura vor 15 Jahren [33]. Während der Farbstoff Quin noch entscheidende Nachteile hatte, weil Lösungsverhalten, Excitationswellenlänge, Excitationskoeffizient und Fluoreszenzintensität nicht allen Anforderungen und Fragestellungen gerecht wurden, ermöglichten die Farbstoffe der Indo- und Fura- Gruppe eine umfassendere Anwendung: Sie wechseln die Excitations- und Emissionswellenlänge nachdem sie Kalzium gebunden haben, ferner weisen sie eine geringere Sensibilität gegenüber Magnesium- oder Schwermetallionen und eine stärkere 21

27 Fluoreszenz auf -letztgenanntes erlaubte geringere Farbstoffkonzentrationen, kürzere Beobachtungszeiträume und Einzelzellmessungen. Mit ihrer Hilfe war es möglich, Zellen und Zellverbände zu untersuchen, die bis sich dahin einer Untersuchung entzogen haben [33]. Sie ermöglichten die Untersuchung der Bedeutung von Kalzium im Lymphozyten im Rahmen der Signaltransduktion als aktivierender und regulierender Second Messenger zu erforschen. Die Messungen erfolgen entweder unter Verwendung der Durchflußzytometrie oder, wie in unserem Fall mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrometers. Bei der Durchflußzytometrie, werden Zellen einzeln gemessen; dabei ist unter Verwendung entsprechender Farbstoffe die Bestimmung von Ionen wie Ca 2+, Mg 2+, Na +, K + sowie die Messung des ph möglich. Es wird nicht die Durchschnittskonzentration eines Ions in allen sich im Ansatz befindlichen Zellen gemessen, sondern jede Zelle wird untersucht, ob und wenn ja, wie sie reagiert. Die Schritte der Zellaktivierung und der Signaltransduktion sind dabei identisch. Technisch funktioniert die Messung indem aktivierte Zellen in Suspension gebracht werden und einen Zähler durchlaufen. Anschließend werden die Zellen einzeln mit Licht einer auf den entsprechenden Farbstoff abgestimmten Wellenlänge aktiviert und die freigesetzte Lichtmenge wird gemessen. Während bei der Messung mittels des Fluoreszenzspektrometers keine Unterscheidung der Lymphozyten bezüglich ihrer CD- Komplexe möglich ist, kann man bei der Durchfluß- zytometrie die Zellen mittels CD- Cluster spezifischer Antikörper markieren und so die Konzentrationsverläufe der Ionen unterschiedlicher Lymphozyten- Subpopulationen messen. Dies war bei unserer Fragestellung nicht nötig. 22

28 4.6 Fragestellung Ziel dieser Arbeit war es, Normwerte für Kalziumstimulationsversuche mit T- Lymphozyten aus dem Blut Neugeborener zu ermitteln. Des Weiteren haben wir zunächst Normwerte für eine Kontrollgruppe aus gesunden Erwachsenen bestimmt und diese mit den Werten der Neugeborenen verglichen. Ziel dieses Vergleiches war es herauszufinden, ob es Unterschiede bezüglich der intrazellulären Kalziumkonzentration nach T- Zellaktivierung zwischen Neugeborenen und Erwachsenen gibt. Die Untersuchungen konnten in der Folge an einem Patienten aus unserer Klinik mit einem ZAP- 70 Defekt angewendet werden. 23

29 5 Methodik 5.1 Patienten Für die Vorversuche sowie die Versuchsgruppe adulte Probanden wurden gesunde männliche und weibliche Freiwillige morgens in das Labor bestellt. Es wurde unter sterilen Bedingungen 20 ml venöses Blut abgenommen und mit Heparin- Natrium versetzt. Die Freiwilligen waren bei Blutentnahme zwischen 22 und 35 Jahre alt. Für die Versuchsgruppe Neonaten standen Blutproben aus dem Kreissaal des Evangelischen Krankenhauses, Düsseldorf, zur Verfügung. Die Proben wurden in den 24 Stunden vor Versuchsbeginn unter sterilen Bedingungen aus der Nabelschnur Neugeborener gewonnen. Das Blut wurde in mit Heparin- Natrium beschichteten Probenröhrchen überbracht und bei Raumtemperatur gelagert. 5.2 Methodik Versuchsanordnung und Versuchablauf Zu Beginn eines Versuches überschichteten wir mit 20 ml Ficol- Paque vorbereitete 50 ml- Falcon- Küvetten mit 10 ml Blut. Die Proben wurden 20 min bei 2500 Umdrehungen pro min (U/m) mit ungebremster Zentrifuge zentrifugiert. Die Lymphozyten wurden entnommen, und im Verhältnis 1:2 mit PBS-Lösung verdünnt. Es schloss sich eine weitere Zentrifugation bei 2000 U/m für 10 min mit gebremster Zentrifuge an. Der Überstand wurde abgegossen, die Lymphozyten aufgeschüttelt und in eine Falcon-Küvette überbracht. Eventuell verbliebene Erythrozyten wurden durch einbringen einer NH4Cl-Lösung lysiert. Nach 5 min wurde diese Lösung durch Auffüllen mit PBS-Puffer neutralisiert. Die Lymphozytensuspension wurde erneut bei 1500 U/m für 5 min zentrifugiert; anschließend wurden die Zellen in RPMI-Medium (15% FCS, 2 mmol Glutamin, 1% Gentamycin, 20 mmol Hepes) überbracht. Durch 24

30 Zählen der Zellen und geeignete Verdünnung wurde die Lymphozyten Suspension auf ein Konzentration von 10 6 Zellen/ml gebracht. Pro 1 Mio. Zellen wurden 1 ml Fura 2 AM zugeführt und für 45 min bei 37ºC im Drehofen inkubiert. Nach Inkubation wurden die Zellen für 5 min bei 1500 U/m zentrifugiert, der Überstand abgegossen und mit 37ºC warmer HEPES-Lösung aufgefüllt. Dieser Waschvorgang wurde insgesamt dreimal wiederholt, wobei mit dem letzten Auffüllen die Konzentration der Suspension wieder auf 10 6 Zellen/ml gebracht wurde. Bis zum Einbringen in den Fluoreszenzspektrometer wurden die Proben in einem dunklen Ort bei Raumtemperatur verwahrt. Die Probe wurde in das Photometer überbracht dort auf 37 C erwärmt und während der gesamten Messung magnetisch gerührt Die Stimulation erfolgte mit 100 µg PHA, 1 µg Anti-CD3 Antikörper und- im Verlauf dieser Messung- mit 8 µg GAM pro ml Lymphozytensuspension. Zusätzlich führten wir eine Messung ohne Stimulation als Kontrollmessung durch: Eine Minute nach Beginn der Messung haben wir PHA oder den Anti CD3 -Antikörper hinzugefügt. Bei Stimulation mit dem Anti CD3 Antikörper erfolgte nach 8 min die Zugabe von GAM- Antikörpern. Der Versuch wurde nach 8 min bei PHA- Stimulation bzw. nach ca. 14 min bei Stimulation mit Anti CD3 Antikörper durch Zugabe von 10µl Triton 10% zur Lyse der Zellen beendet das Kalzium aus den Reservoirs wird dabei vollständig freigesetzt und das Maximum Rmax der Fluoreszenzintensität bestimmt. Nach einer weiteren Minute wird das Kalzium durch Zugabe von 80µl Tris/EDTA vollständig gebunden und das Minimum der der Fluoreszenzintensität wird bestimmt. Anschließend wurde die Messung beendet, die Daten gespeichert und die Fluoreszenz- Kurve zusammen mit den Daten ausgedruckt PHA Veränderungen im Kalziumstoffwechsel von T- Lymphozyten nach Stimulation mit dem pflanzlichen Lektinen ist ein seit langer Zeit bekannter Mechanismus. PHA (Phytohämagglutinin) ist ein pflanzliches Lektin, mit mitogenen Eigenschaften. Es ist in der Lage in T- Lymphozyten über einen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration die Expression von Genprodukten wie IL2 zu bewirken. Der 25

31 Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration erfolgt wenige Sekunden nach Zugabe des PHA und hält für mehrere zehn Minuten an [49]. Er wird wahrscheinlich ausgelöst durch Bindung des PHA an Glykoproteine oder Polysacharidreste an der Oberfläche des T- Lymphozyten; es ist jedoch gesichert, dass Abhängigkeit vom Vorhandensein einer funktionierenden Signaltransduktion durch den T- Zell Rezeptor besteht [69] Anti-CD3-Antikörpern Für die Stimulationsversuche verwendete Antikörper ist ein zur Klasse der IgG 2A gehörender anti-cd3 Antikörper. Er entspricht der Stimulation durch MHC- Moleküle im lebenden Organismus. Die Stimulation des T- Zellrezeptors durch den anti-cd3 Antikörper resultiert in einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration innerhalb von 30 Sekunden nach Zugabe des Antikörpers: Nachdem zunächst ein Maximum an Fluoreszenz zu beobachten ist, nimmt diese langsam ab und verbleibt für mehr als 30 Minuten oberhalb des Basalwerts. Die maximal erreichbare Kalziumkonzentration ist abhängig von dem Vorhandensein von Kalzium im Medium. Dies verdeutlicht die Bedeutung des Kalzium- Influx für die Signaltransduktion. Die Bedeutung des physiologischen ph-werts sowie dem Vorliegen von physiologischen Ionenverhältnissen im Versuchsansatz zeigt sich in der Tatsache, dass Depolarisation oder Hyperpolarisation zu einem Ausbleiben des Kalziumanstiegs nach Antikörperzugabe führt [48, 69] Quervernetzung der Oberflächenantigene mittels Goat- Anti-Mouse- Antikörpern Im Verlauf der Versuche mit dem Anti-CD3-Antikörper fügten wir nach ca. 7 Minuten einen GAM- Ak (Goat- Anti- Mouse Antikörper) hinzu. Dieses Ig2a-Immunglobulin führte zu einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration und somit zu einer Verstärkung des Fluoreszenzsignals. Die Antikörper binden an Oberflächenantigene des T- Zell Rezeptors, wodurch es zu einer Quervernetzung der Anti CD-3 Antikörper 26

32 kommt. Der daraufhin messbare Anstieg des intrazellulären Kalziums beruht auf einer Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Lagern des Endoplasmatischen Retikulums. Der Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration tritt auch im Wirkmaximum des Anti-CD3-Antikörpers auf und resultiert aus einer erneuten Signaltransduktion über den T- Zell Rezeptor und die nachgeschalteten Proteinkinasen Der Farbstoff Fura 2AM Abbildung 3: Fura 2AM. Der Kalzium sensitive Farbstoff Fura-2AM ist ein Mitte der 80er Jahre entwickelter und bis heute verwendeter Fluoreszenzfarbstoff, der routinemäßig zur Messung intrazellulärer Kalziumkonzentrationen verwendet wird [14, 22, 25, 38]. Fura-2 AM weist eine im Vergleich mit seinem Vorgänger Quin eine ca. 30-fach höhere Fluoreszenz auf. Die Verbesserungen der Selektivität von Fura-2AM bezüglich Kalzium gegenüber Mg 2+, Mn 2+ und Zn 2+ entspricht einem 4-fachen, 12fachen bzw. 40fachen Veränderung gegen den Ausgangswert. Fura-2AM wird in Form eines Acetmethyl-Esters per Diffusion in die Zelle aufgenommen und dort von intrazellulären Esterasen gespalten, so dass der so entstandene Farbstoff die Zelle 27

33 nicht mehr verlassen kann. Kommt es zu einer Erhöhung des cytosolischen Kalziumspiegels, lässt sich ein Anstieg der Fluoreszenz messen, wobei Fura-2AM eine Sensibilität für Kalzium bei 350nm und nm zeigt. Die intrazelluläre Kalzium Konzentration berechnet sich nach der Formel der Erstbeschreiber Grynkiewicz et al. wie folgt: [Ca i ] = Kdβ (F-F min )/(F max -F) Wobei Kd die Cazium-Fura-2AM Dissoziationskonstante, β die gemessene Fluoreszenz, Rmin die kleinste gemessene Fluoreszenz - im Versuch nach Zugabe von EGTA, das das cytosolische Kalzium bindet- und Rmax der größte gemessene Fluoreszenz ist. Im Versuch ist dies nach Lyse der Zellen, wobei das Kalzium aus den cytosolischen Reservoirs gänzlich freigesetzt wird [30, 33]. Der Farbstoff (5 mg) wurde in 5 ml DMSO gelöst und anschließend aliquotiert. Die Proben wurden bei -20ºC eingefroren und kurz vor der Inkubation mit der Lymphozytensuspension aufgetaut. Dabei wurde darauf geachtet den Farbstoff nur für kürzeste Zeit dem Tageslicht ausgesetzt wurde. Pro 10 6 Zellen wurde 1 ml Fura- 2Am-Lösung hinzugefügt. 5.3 Material Reagenzien DMSO: Sigma FCS: Gibco, Karlsruhe, Deutschland Ficol-Paque: Pharmacia Biotech 28