BrdU Lymphozyten-Transformationstest (LTT)

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1 Arbeitsanleitung BrdU Lymphozyten-Transformationstest (LTT) (500 Ansätze) Enzymimmunoassay zur Bestimmung der Zellprofliferation von Lymphozyten aus Vollblut Kat.-Nr.: BDU-E01 Lagerung: 2-8 C Nur für Forschungszwecke April 2010 IMMUNOLAB GmbH, Otto-Hahn-Str. 16, D Kassel Tel: , Fax: ,

2 Inhaltsverzeichnis Seite 1. Verwendungszweck 3 2. Klinische Bedeutung 3 3. Testprinzip 3 4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 4 5. Inhalt des Testbestecks 4 6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel 5 7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben 5 8. Testdurchführung 6 9. Auswertung Literatur 7 2

3 1. Verwendungszweck Der BrdU Lymphozyten-Transformationstest (LTT) dient der Bestimmung der Zellproliferation von Lymphozyten aus Vollblut nach Stimulation mit mitogenen Substanzen wie Metallen, Chemikalien, Medikamente sowie unterschiedlichen Allergenen. Laborergebnisse können nie allein die Grundlage eines medizinischen Befundes bilden. Es müssen immer das klinische Bild sowie weitere Untersuchungen mit berücksichtigt werden. 2. Klinische Bedeutung Üblicherweise wird die Zellproliferation in vitro über die direkte Auszählung der Zellen ermittelt, indem man zum Beispiel den Mitoseindex bestimmt. Alle diese Teste sind arbeitsintensiv und deswegen bei einer großen Anzahl von Proben bzw. Ansätzen nicht praktikabel. Alternativ kann man als indirekte Messung der lebensfähigen Zellen die gesamte metabolische Aktivität in einer Zellpopulation messen. Die Methode scheitert jedoch, wenn eine geringe Anzahl von proliferierenden Zellen durch eine überwiegende Mehrzahl von nicht-proliferierenden Zellen überdeckt wird oder wenn die DNS Synthese in einer begrenzten Zellpopulation ohne Änderung der Zellzahl oder der Lebensfähigkeit induziert wird. Da für die Zellproliferation die Replikation der zellulären DNS erforderlich ist, stellt die Verfolgung der DNS Synthese einen weiteren indirekten Parameter für die Zellproliferation dar. Üblicherweise wurde 3 H-Thymidin benutzt, um die DNS von mitotisch aktiven Zellen zu markieren. Nachteile des 3 H-Thymidin-Einbaus sind: 1) die Verwendung von flüchtigen Radioisotopen mit langer Halbwertszeit, 2) entsprechende Handhabungs- und Entsorgungsprobleme, 3) spezielle und teure Geräte wie einen Szintillationszähler und 4) die Gefährdung des Personals durch toxische Szintillationsflüssigkeiten. Eine wichtige Verbesserung der Methodik besteht in der Verwendung von 5-Bromo-2 -deoxyuridin (BrdU) statt 3 H-Thymidin. Die Technik basiert auf dem Einbau der Pyrimidin-analogen Verbindung BrdU anstatt des Thymidins in die DNS der proliferierenden Zellen. Nach dem Einbau erfolgt die Detektion in einem ELISA über einen monoklonalen Antikörper. 3. Testprinzip Vollblut wird in speziellen Vacutainerröhrchen abgenommen. Nach Zentrifugation wird die über dem Gel befindliche Flüssigkeit, die Lymphozyten und Monozyten enthält, vorsichtig herauspipettiert. In Gegenwart der vermuteten mitogenen Substanzen (z. B. Allergene, Chemikalien, Medikamente, Metalle) werden Kulturen der Lymphozyten in einer Mikrotiterplatte bei 37 C für 1-5 Tage unter CO 2 bebrütet. Danach wird BrdU zu den Kulturen gegeben und weitere 2-24 Stunden inkubiert. Während der Markierungsperiode wird das Pyrimidin-analoge BrdU in die DNS der proliferierenden Zellen eingebaut. Nach der Entnahme des Kulturmediums werden die Zellen fixiert und die DNS gleichzeitig denaturiert. Das Antikörper-Enzym-Konjugat bindet sich dann an die neusynthetisierte zelluläre DNS. Die Immunkomplexe werden in einer nachfolgenden Substratreaktion über einen gelben Farbstoff nachgewiesen. Die Extinktion wird in einem ELISA-Reader gemessen und ist mit der Menge der neusynthetisierten DNS und somit der Anzahl der proliferierenden Zellen korreliert. 3

4 4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Nur für in-vitro Anwendung! Nicht schlucken oder einnehmen! Die laborüblichen Sicherheitsvorschriften sowie die Verbote von Essen, Trinken und Rauchen im Labor sind zu beachten. Bei Durchführung des Tests sollten Latexhandschuhen benutzt werden. Vollblut- und Reagenzienreste sollten mit einer desinfizierenden Lösung (z.b. Natriumhypochlorit, 5 %) aufgewischt und vorschriftsgemäß entsorgt werden. Alle Reagenzien müssen vor der Testdurchführung auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht werden. Vor dem Pipettieren sollten alle Reagenzien durch leichtes Kippen oder Schwenken gemischt werden. Heftiges Schütteln mit Schaumbildung sollte vermieden werden. Wichtig ist die Einhaltung des Zeittaktes beim Pipettieren, so dass alle Ansätze in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte den gleichen Bedingungen unterliegen. Bei der Entnahme der Reagenzien aus den Flaschen ist darauf zu achten, dass die Stopfen nicht kontaminiert werden. Außerdem ist auf eine mögliche Verwechslung zu achten. Der Inhalt der Fläschchen ist in der Regel oxidationsempfindlich, so dass sie nur für kurze Zeit geöffnet werden sollten. Zur Vermeidung einer Verschleppung oder Kreuzkontamination müssen separate Einmal- Pipettenspitzen verwendet werden. Es dürfen keine Reagenzien von verschiedenen Kitchargen verwendet und diese nicht miteinander vermischt werden. Alle Reagenzien sind innerhalb der Verfallszeit zu benutzen. In Übereinstimmung mit einer guten Laborpraxis (GLP) bzw. nach ISO9001 sollten regelmäßig alle verwendeten Laborgeräte auf Richtigkeit und Präzision überprüft werden. Dies betrifft u.a. Mikroliterpipetten sowie Wasch- und Messgeräte (ELISA-Reader). Der Kontakt vor allem der Stopp-Lösung und des Substrats mit Haut, Auge und Schleimhäuten ist zu vermeiden, da mögliche Reizungen, Verätzungen oder Vergiftungsgefahr bestehen. 5. Inhalt des Testbestecks (500 Ansätze) Komponenten BrdU Markierungsreagenz (100x) Anti-BrdU-POD Konjugat (100x) Konjugatverdünner Waschpuffer (10 ) Substratlösung Fixier- und Denaturierungs-Lösung Stopp-Lösung Volumen / Menge 0,50 ml 0,55 ml 50 ml 50 ml 2x 25 ml 100 ml 50 ml 4

5 Lagerung und Aufbrauchsfristen (Angabe der Verfallsdaten auf den Etiketten) Die nachfolgenden Reagenzien sind für 500 Ansätze gedacht. Lagern Sie die Komponenten des Kits bei 2-8 C. Nach dem Gebrauch sollten die Platten verpackt, die Flaschen mit den zugehörigen Deckeln verschlossen und der Kit wieder bei 2-8 C gelagert werden. Der angebrochene Kit sollte innerhalb von drei Monaten verbraucht werden BrdU Markierungsreagenz 0,5 ml, 5-Bromo-2 -Deoxyuridin in PBS, ph 7,4 als 100x Konzentrat Anti-BrdU-POD Konjugat 0,55 ml, monoklonaler Antikörper konjugiert mit Peroxidase, als 100x Konzentrat Konjugatverdünner 50 ml in PBS/BSA Puffer. Gebrauchsfertig Waschpuffer 50 ml PBS als 10x Konzentrat Substratlösung 2x 25 ml, TMB (Tetramethylbenzidin). Gebrauchsfertig Fixier- und Denaturierungs-Lösung 100 ml. Gebrauchsfertig Stopp-Lösung 50 ml, 1 M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig. 6. Erforderliche Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel Stimulierungslösungen (bei Immunolab erhältlich) 5 µl-, 100 µl- und 500 µl-mikro- bzw. Mehrkanalpipetten Zentrifuge zur Herstellung des Dichtegradienten CO 2 Inkubationsschrank Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm) Mikrotiterplatten-Waschgerät Bidestilliertes Wasser 7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben Vollblut wird in speziellen Vacutainerröhrchen abgenommen. Der Test muss innerhalb von h nach der Blutabnahme durchgeführt werden. Nach Zentrifugation wird die über dem Gel befindliche Flüssigkeit, die Lymphozyten und Monozyten enthält, vorsichtig herauspipettiert. 5

6 8. Testdurchführung 8.1. Herstellung der Arbeitslösungen BrdU-Markierungslösung: Das Markierungsreagenz wird 1:101 mit sterilem Kulturmedium (z.b. RPMI 1640) verdünnt (z.b. 10 µl µl für 96 Vertiefungen). Die verdünnte BrdU Arbeitslösung ist mehrere Wochen bei Kühlschranktemperatur (2-8 C) im Dunkeln stabil. Konjugat-Arbeitslösung: Das Konjugat-Konzentrat wird mit dem Konjugatverdünner 1:101 verdünnt (z.b. 100 µl + 10 ml für 96 Vertiefungen). Die Konjugat-Arbeitslösung sollte kurz vor der Benutzung hergestellt und nicht aufbewahrt werden. Waschlösung: Vor der Benutzung 1:10 (1+9) mit bidest. Wasser verdünnen Einzelne Assay-Schritte ml Citratblut in speziellen Röhrchen abnehmen Minuten zentrifugieren (1500 g) und Lymphozyten separieren x im Spitzröhrchen mit Zell-Waschlösung waschen. 4. Auf 10 6 Zellen pro Milliliter in RPMI verdünnen. 5. Pro Untersuchungsparameter (z.b. Metall) bzw. für die positive Kontrolle 5 x 50 µl Lymphozyten-Lösung in RPMI in jeweils eine Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettieren. Für die negative Kontrolle 2 x 50 µl vorlegen. 6. Je 50 µl der Stimulierungslösungen dazu pipettieren. Als negative Kontrolle wird die Zell- Waschlösung in Doppelbestimmung und als Positivkontrolle die PPD-Lösungen einzeln mit jeweils 50 µl angesetzt Tage bei 37 C im CO 2 Schrank inkubieren. 8. Je 10 µl BrdU Markierungs-Lösung (Arbeitslösung) zugeben Stunden bei 37 C im CO 2 Schrank inkubieren. 10. Mikrotiterplatte 10 Minuten (300 g) zentrifugieren, Flüssigkeit abkippen und Zellen 15 Minuten mit einem Fön trocknen. 11. Je 200 µl Reagenz für Denaturierung und Fixierung pipettieren Minuten inkubieren und Reagenz abkippen µl Anti-BrdU-POD Konjugat zugeben und 90 Minuten bei RT inkubieren. 14. Waschen. 100 µl Tetramethylbenzidin zugeben und 10 Minuten bei RT inkubieren. 15. Mit 50 µl 0,5 M Schwefelsäure stoppen. 16. Bei 450/620 nm im ELISA Reader messen. 17. Durch Division mit dem Leerwerts werden unter Berücksichtigung der positiven Kontrolle die Ergebnisse (Transformations-Quotient) berechnet. 6

7 9. Auswertung Die gemessenen Extinktionen sollten für alle Ansätze zwischen 0,050 und 2,500 OD liegen. Die Zunahme des BrdU Einbaus in die mitogenbehandelten Kulturen wird als Transformations- Quotient (TQ) ausgedrückt, wobei die Extinktion der entsprechenden Vertiefung durch die Extinktion des Leerwerts (Kultur mit Puffer und ohne Allergen) dividiert wird. Eine Stimulation durch das Mitogen und damit ein positives Ergebnis liegt vor, wenn der Quotient TQ größer als 5 ist. Bei einem Quotienten unter 3 liegt ein negatives Ergebnis vor. Zwischen einem TQ von 3-4,9 liegt der Graubereich, und der Test sollte gegebenenfalls wiederholt werden. 10. Literatur 1. Porstmann T; Ternynck T; Avrameas S: Quantitation of 5-bromo-2-deoxyuridine incorporation into DNA: an enzyme immunoassay for the assessment of the lymphoid cell proliferative response. J Immunol Methods 1985 Sep 3;82(1): Biswas S; Valecha N: Bromo-deoxyuridine based assay for detection of parasite and drug sensitivity in Plasmodium falciparum in vitro. Indian J Exp Biol 1996 Dec;34(12):

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