Modul MA-CH-BOC 11: Gentechnik. (Dr. Schwenzer) Dieses Modul besteht aus 2 Vorlesungsreihen: I. Biochemische Grundlagen der Gentechnik (2 SWS im WS)

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1 Modul MA-CH-BOC 11: Gentechnik (Dr. Schwenzer) Dieses Modul besteht aus 2 Vorlesungsreihen: I. Biochemische Grundlagen der Gentechnik (2 SWS im WS) II. Methoden der Gentechnik (2 SWS im SS) Im folgenden finden Sie die gegliederten Inhalte zu beiden Lehrveranstaltungen sowie einige ausgewählte Darstellungen zu den in der Vorlesung besprochenen Sachverhalten. Eine komplette Folien-Sammlung als vorlesungsbegleitendes Material wird den teilnehmenden Studenten zu Beginn des Semesters zugänglich gemacht. Aus urheberrechtlichen Gründen muss dabei bitte beachtet werden: Die nachfolgenden Unterlagen sind ausschließlich als persönliches und begleitendes Studienmaterial für die an der Lehrveranstaltung Gentechnik am Institut für Biochemie der TU Dresden teilnehmenden Studenten zu verwenden. Jegliche kommerzielle Nutzung des bereitgestellten Materials ist untersagt. Eine Vervielfältigung dieser Unterlagen ist nur jeweils als Einzelexemplar für den ausschließlich persönlichen, studienbegleitenden Gebrauch gestattet.

2 I. BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN DER GENTECHNIK 1. Wesen, Ziele und Prinzipien der Gentechnik 1.1. Grundbegriffe und wissenschaftliche Einordnung 1.2. Historischer Überblick 1.3. Molekulare Grundlagen 1.4. Grundsätzliche Arbeitsprinzipien und Methoden 1.5. Aktuelle Schwerpunkte und Anwendungen gentechnischer Entwicklungen 2. Die Zelle als kleinste Einheit des organisierten Lebens 2.1. Aufbau, Eigenschaften und Funktion Gemeinsame Merkmale aller Zellen Einteilungsprinzipien der Zellen Vergleich zwischen Prokaryoten und Eukaryoten Subzelluläre Strukturen und Organellen Differenzierungsformen höherer Zellen 2.2. Experimentelles Arbeiten mit Zellen Kultivierung von Zellen Charakterisierung von Zellen und Zellkulturen Aufschluss von Zellen Gewinnung von Zellinhaltsstoffen 2.3. Das zentrale Dogma der Molekularbiologie als Arbeitsprinzip der Zelle

3 3. Proteine und Nucleinsäuren als molekulare Träger der Lebensvorgänge 3.1. Proteine Vorkommen und biologische Bedeutung Struktur und Eigenschaften der Aminosäuren Chemischer Aufbau der Peptide Raumstruktur der Proteine Enzyme Antikörper Methoden zur Strukturuntersuchung von Proteinen 3.2. Nucleinsäuren Vorkommen und biologische Bedeutung Mononucleotide Struktur und Nomenklatur der Mononucleotide Wichtige Mononucleotid-Derivate Chemischer Aufbau von Oligo- und Polynucleotiden Raumstruktur der DNA Komplementäre Basenpaarung Konformationsformen doppelsträngiger DNA Eigenschaften und Stabilität von Doppelstrang-DNA Organisationsform chromosomaler DNA Aufbau und Eigenschaften von RNA Struktur von RNA-Molekülen Katalytische RNA-Moleküle (Ribozyme) Spaltung und Abbau von Nucleinsäuren Nucleolytischer Abbau Besondere Bedeutung der Restriktionsendonucleasen Synthese von Oligonucleotiden und Nucleinsäuren Replikation und Transkription Chemische Oligonucleotid-Synthese

4 4. Replikation, Transkription und Translation als molekulargenetische Grundprozesse 4.1. Replikation Grundsätzlicher Mechanismus Voraussetzungen für den Ablauf der Replikation Startpunkt und Initiation der Replikation Präformation der DNA Synthese der Tochterstränge Abschluß der Replikation Sonderformen der der Replikation DNA-Reparatursysteme 4.2. Transkription Grundprinzipien der Transkription RNA-Polymerasen Einzelprozesse des Transkriptionsverlaufes Organisationsformen der Gene Unterschiede der Transkription bei Prokaryoten und Eukaryoten Regulation der Transkription 4.3. Translation Grundprinzip der Translation Der genetische Code Transfer-RNA und die Bedeutung der trna-synthetasen Ribosomen Einzelschritte des Translationsprozesses und Translationskontrolle Posttranslationale Modifizierungen der Proteine

5 Wichtige Unterschiede zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen

6 Experimenteller Umgang mit Zellen verschiedener biol. Herkunft: Kultivierung Charakterisierung Aufschluss Konservierung

7 DNA und Proteine als molekulare Träger der Lebensvorgänge in der Zelle Funktion und Eigenschaft

8 Die Struktur der Proteine

9 Verknüpfung der Grundbausteine einer Nucleinsäure-Kette

10 Feinstruktur doppelsträngiger DNA

11 Feinstruktur der DNA im Chromosom

12 Organisation der Gene innerhalb eines Chromosoms

13 Vergleich der Gen-Organisation und -Expression bei Prokaryoten und Eukaryoten

14 RNA-Typen und deren zelluläre Funktion

15 Funktionelle Beziehung von DNA und Proteinen als molekulare Träger der Lebensvorgänge in der Zelle Funktion und Eigenschaft

16 An der DNA-Replikation beteiligte Enzyme und Hilfsproteine

17 DNA-Replikation: Mechanismus und beteiligte Komponenten

18 Der Weg vom Gen zum Protein

19 Der Weg vom Gen zum Protein

20 Transkriptions-Maschinerie

21 Unterschiede der Genexpression bei Eukaryoten und Prokaryoten

22 Molekularer Mechanismus des Spleißens

23 Genstruktur und Regulation der Genexpression am Beispiel des LacZ-Gens

24 Allgemeine Mechanismen der Genregulation

25 Mechanismus der Translation

26 Schlüsselprozess bei der Informationsübertragung vom Gen zum Protein

27 II. METHODEN DER GENTECHNIK *** DNA-Rekombination und Klonierung *** 1. Allgemeine Grundprinzipien 1.1. Wesen der Gentechnik 1.2. Allgemeine Ziele der Gentechnik 1.3. Molekulare Voraussetzungen 1.4. Wichtige Begriffe aus der Gentechnik 2. Überblick über Teilschritte und Methoden 2.1. Gemeinsame Teilschritte vieler gentechnischer Experimente 2.2. Gewinnung des genetischen Ausgangsmaterials 2.3. DNA-Rekombinationstechnik 2.4. Einbringen von fremder DNA in Wirtszellen 2.5. Klonierung 2.6. Selektion 2.7. Expression 2.8. Spezielle Techniken und Methoden

28 3. Klonierungsvektoren 3.1. Plasmide Grundlegende Merkmale Größe und Kopienzahl Konjugation und Kompatibilität Klassifikation Genkarten wichtiger Plasmide 3.2. Bakteriophagen Eigenschaften Lysogene Phagen Lambda- und M13-Phagen Cosmide 3.3. Klonierungsvektoren für andere Organismen als E.coli Überblick Künstliche Hefechromosomen (YAC) Ti-Plasmid

29 4. Isolierung und Reinigung von DNA und RNA aus Zellen 4.1. Grundsätzliche Probleme und Teilschritte 4.2. Gesamt-DNA Bakterienzucht und -ernte Zellaufschluß und Gewinnung des Zellextraktes Reinigung der DNA aus dem Zellextrakt Anreicherung und Konzentrationsbestimmung der DNA Gesamt-DNA aus anderen Organismen als Bakterien 4.3. Plasmid-DNA Grundproblem der Plasmidisolierung Trennung nach der Molekülgröße Trennung nach der Konformation Plasmidamplifikation 4.4. Bakteriophagen-DNA Spezielle Probleme der Phagenkultivierung Ernte der Phagenkultur und DNA-Reinigung aus λ-phagen Präparation der DNA aus M13-Phagen 4.5. Gewinnung von RNA Strategien zur RNA-Isolierung Inhibierung der RNase-Aktivität

30 5. Enzyme zur DNA-Manipulation 5.1. Überblick über wichtige Enzymklassen Nucleasen Ligasen Polymerasen Modifikationsenzyme 5.2. Restriktionsendonucleasen Bedeutung und Vorkommen Einteilung Wirkungsweise Durchführung einer Restriktionsspaltung Analyse der Restriktionsprodukte 5.3. Ligasen Wirkungsweise Probleme der Ligation Linker, Adaptoren und tailing

31 6. Einschleusen von DNA in lebende Zellen 6.1. Ziele der Klonierung 6.2. Transformation von Bakterienzellen mit Plasmid-DNA Herstellung kompetenter Zellen Selektion transformierter Zellen Selektion der Rekombinanten Inaktivierung eines Antibiotika-Markers Inaktivierung eines Nicht-Antibiotika-Markers 6.3. Transfektion von Bakterienzellen mit Phagen-DNA Transfektion und in-vitro-verpackung Selektion der infizierten Zellen Selektion rekombinanter Phagen 6.4. Einschleusen von DNA in eukaryotische Zellen Transformation/Transfektion einzelner Zellen Transformation/Transfektion ganzer Organismen

32 7. Selektion von Klonen eines speziellen Gens 7.1. Das Problem der spezifischen Selektion 7.2. Selektionsprinzipien Direkte Selektion und marker rescue -Verfahren Selektion aus Genbibliotheken 7.3. Klon-Suche in Genbibliotheken Arten von Genbibliotheken Genomische Bibliothek cdna-bibliothek Methoden zur Klon-Identifizierung Nucleinsäure-Hybridisierung Kolonie- und Plaque-Hybridisierung Verwendung geeigneter Gen-Sonden Identifizierung durch Nachweis des Genproduktes

33 8. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen an Genen 8.1. Lokalisierung eines Gens auf einem DNA-Molekül Gelelektrophorese und Nucleinsäure-Blotting Genlokalisierung auf kleinen DNA-Molekülen (Plasmide, Phagen-DNA) Genlokalisierung auf großen DNA-Molekülen (eukaryotische Chromosomen) Genom-Kartierung 8.2. Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) Mutationsanalyse Genetischer Fingerabdruck 8.3. Sequenzierung eines Gens Sanger-Coulson-Methode Maxam-Gilbert-Methode 8.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Grundprinzip der Methode Experimentelle Durchführung Möglichkeiten und Probleme der PCR-Anwendung 8.5. Untersuchungen zur Genexpression Analyse der Transkripte Untersuchungen zur Expressionsregulation Analyse der Translationsprodukte

34 9. Praktische Anwendungsgebiete der Gentechn 9.1. Synthese wertvoller Proteine mit klonierten Genen Expression eukaryotischer Gene in E.coli Beispiele für gentechnische Herstellung wichtiger Proteine Synthese von Impfstoffen 9.2. Gene als diagnostische Sonden 9.3. Gentherapie 9.4. Tumorgene 9.5. Transgene Pflanzen und Tiere 9.6. Gentechnik in Industrie und Landwirtschaft

35 Rekombination und Klonierung von DNA Rekombination Klonierung

36 Rekombination und Klonierung von DNA

37 Genkarte für eine Gruppe von puc-plasmiden

38 Hauptstruktur-Typen von Bakteriophagen

39 Infektionszyklus eines lytischen Phagen

40 Einige in der Gentechnik häufig benutzte Restriktionsenzyme

41 Entstehung von Fragmenten mit "klebrigen" Enden bei der Restriktionsspaltung von DNA

42 Trennung von Restriktionsfragmenten durch Elektrophorese

43 Ergebnisse der Ligationsreaktion bei einem Klonierungsexperiment

44 Möglichkeiten der Genübertragung bei Prokaryoten

45 Ergebnisse der Transformation von Bakterien bei einem gentechnischen Experiment

46 Prinzip der Blau-Weiß-Selektion mit einem Plasmidvektor

47 Erzeugung einer genomischen Genbibliothek

48 Verfahren der Kolonie-Hybridisierung

49 Der "Southern-Blot" als Nachweismethode für spezifische DNA-Sequenzen

50 Das Prinzip der PCR-Reaktion

51 Grundprinzip der Sanger-Methode zur DNA-Sequenzierung

52 Konstruktion eines Expressionsvektors zur Herstellung wertvoller Proteine mittels rekombinanter DNA in fremden Wirtszellen

53 Gentechnische Herstellung von humanem Insulin

54 Neue gentechnische Arzneimittel (Deutschland 2006)

55 Typische Produzenten gentechnischer Wirkstoffe

56 Somatische Gentherapie

57 Gentechnische Methoden in der Pflanzenzüchtung

58 Grüne Gentechnik: Zielstellungen gentechnischer Veränderungen in Pflanzen EU-Freisetzungsversuche (bis 2005)

59 Möglichkeiten zur spezifischen Geninhibierung Unterbrechung des Informationsflusses von DNA zu Protein Antisense- Oligonucleotide Katalytische Nucleinsäuren si-rna

60 Wirkungsweise von Antisenseoligonukleotiden

61 Eigene Publikationen zur Entwicklung von Antitumor-Wirkstoffen (AG Schwenzer): Förster, Y., Meye, A., Albrecht, S., Kotzsch, M., Füssel, S., Wirth, M.P., Schwenzer, B. (2003) Tissue specific expression and serum levels of human tissue factor in patients with urological cancer, Cancer Lett. 193, Krämer, K.; Füssel, S., Schmidt, U., Kotzsch, M., Schwenzer, B.; Wirth, M.P., Meye, A. (2003) Antisense-mediated htert inhibition specifically reduces the growth of human bladder cancer cells, Clin. Cancer Res. 9, Förster, Y., Meye, A., Krause, S., Schwenzer, B. (2004) Antisense mediated VEGF suppression in bladder and breast cancer cells, Cancer Lett. 212, Förster, Y., Schwenzer, B. (2004) Inhibition of TF gene expression by antisense oligonucleotides in different cancer cell lines, J. Exp. Ther. Oncol. 4,

62 Eigene Publikationen zur Entwicklung von Antitumor-Wirkstoffen (AG Schwenzer): Krause, S.; Förster, Y.; Krämer, K.; Füssel, S.; Kotzsch, M.; Schmidt, U.; Wirth, M.P.; Meye, A.; Schwenzer, B. (2005) Vascular endothelial growth factor antisense pretreatment of bladder cancer cells significantly enhances the cytotoxicity of mitomycin C., gemcitabine and cisplatin, J. Urol. 174, Böhl, M., Schwenzer, B. (2005) A potent inhibitor of prothrombin gene expression as a result of standardized target site selection and design of antisense oligonucleotides, Oligonucleotides 15, Böhl, M., Böhl, J., Schwenzer, B. (2006) A cellular model system for expression studies of coagulation proteins, J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 54(1), Kampfrath, T.; Oswald, J.; Bergmann, R.; Schwenzer, B. (2006) Effects of oligosaccharide derivatives on the metabolism of tumor cells Nuklearmedizin 45(2), A87

63 Eigene Publikationen zur Entwicklung von Antitumor-Wirkstoffen (AG Schwenzer): Foerster, Y.; Meye, A.; Albrecht, S.; Schwenzer, B. (2006) Tissue factor and tumor: Clinical and laboratory aspects (invited review) Clin. Chim. Acta 364(1-2), Boehl, M.; Schwenzer, B. (2007) Multiplex PCR to assay the effect of nucleic acid based inhibitors on prothrombin transcript level Chem. Biol. Drug Des. 69(3), Wuttig, D.; Kunze, D.; Fuessel, S.; Toma, M.; Stade, J.; Kotzsch, M. Kappler, M.; Taubert, H.; Schwenzer, B.; Baretton, G.; Hakenberg, O.W.; Meye, A.; Wirth, M.P. (2007) Are overexpressed alternative survivin transcripts in human bladder cancer suitable targets for sirna-mediated in vitro inhibition? Int. J. Oncology 30(6), Oswald, J.; Treite, F.; Haase, C.; Kampfrath, T.; Bergmann, R.; Schwenzer, B.; Pietzsch, J. (2007) Experimental hypoxia is a potent stimulus for radiotracer uptake in vitro: Comparison of different tumor cells and primary endothelial cells Cancer Lett. 254(1),

64 Eigene Publikationen zur Entwicklung von Antitumor-Wirkstoffen (AG Schwenzer): Oswald, J.; Marschner, K.; Kunz-Schughart, L. A.; Schwenzer, B.; Pietzsch, J. (2007) Multicellular Tumor Spheroids as a Model System for the Evaluation of PET Radiotracer Uptake Eur. J. Nucl. Med. 34(2007)Suppl. 2, S138 Kunze, D.; Wuttig, D.; Kausch, I.; Blumhoff, L.; Burmeister, Y.; Kraemer, K.; Fuessel, S.; Toma, M.; Schwenzer, B.; Meye, A.; Hakenberg, O.W.; Jocham, D.; Wirth, M.P. (2008) Antisense-mediated inhibition of survivin, htert and VEGF in bladder cancer cells in vitro and in vivo Int. J. Oncology 32(5), Förster, Y.; Schwenzer, B. (2008) Antisense oligonucleotides and sirna as specific inhibitors of gene expression: mechanisms of action and therapeutic potential (invited review) In: Sensitization of Cancer cells for Chemo/Immuno/Radio-Therapy, 1st Edition, Ed.: Benjamin Bonavida, pp , Humana Press, Totowa, NJ, Förster, Y.; Schwenzer, B. (2008) Efficient suppression of tissue factor synthesis using antisense oligonucleotides selected by an enhanced strategy for evaluation of structural characteristics Oligonucleotides 18(4),

65 Eigene Publikationen zur Entwicklung von Antitumor-Wirkstoffen (AG Schwenzer): Beutner, R.; Michael, J.; Förster, A.; Schwenzer, B.; Scharnweber, D. (2009) Immobilization of ODNs on titanium based materials by partial incorporation in anodic oxide layers Biomaterials 30 (14), Scharnweber, D.; Beutner, R.; Roessler, S.; Michael, J.; Schwenzer, B. (2009) Using electrochemical approaches for bio surface engineering of titanium based implants (invited review) In: Recent Developments in Advanced Medical and Dental Materials Using Electrochemical Methodologies. Ed.: Karlinsey R.L.; pp , Research Signpost (ISBN: ). Michael, J.; Schönzart, L.; Israel, I.; Beutner, R.; Scharnweber, D.; Hempel, U.; Schwenzer, B. (2009) Oligonucleotide-RGD peptide conjugates for surface modification of titanium implants and improvement of osteoblast adhesion Bioconjugate Chem. 20 (4), Beutner, R.; Michael, J.; Schwenzer, B.; Scharnweber, D. (2010) Biological nano-functionalization of titanium-based biomaterial surfaces: a flexible toolbox J. Royal Soc. Interface 7, Kampfrath, T.; Reißenweber, B.; Pietzsch, J.; Schwenzer, B. (2010) Effects of sirna and antisense oligodeoxynucleotides (AS-ODN) on vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion in tumor cells under experimental hypoxia J. Oncology (Manuskript eingereicht) Gentechnik Dr. B. Schwenzer 65